Методическая статья

Хлорного железа-индуцированной мышиной модели Тромбоз

DOI:

10.3791/54479

⸱

5 сентября 2016 г.

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сообщаем о изысканную процедуру хлорида железа (FeCl 3) индуцированный моделей тромбоз на сонной и брыжеечной артерии, а также вены, характеризующийся эффективно использовать прижизненной микроскопии для контроля времени окклюзионные тромбообразования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Артериальный тромбоз (тромб) является распространенным осложнением многих системных заболеваний, связанных с хроническим воспалением, включая атеросклероз, диабет, ожирение, рак и хронические аутоиммунные ревматологические заболевания. Тромбы являются причиной большинства инфарктов, инсультов и потери конечностей, что делает тромбоз чрезвычайно важной проблемой общественного здравоохранения. Поскольку эти тромбы возникают в результате неадекватной активации тромбоцитов и последующей коагуляции, терапевтическое воздействие на эти системы имеет важное клиническое значение для разработки более безопасных методов лечения. Из-за сложностей системы гемостаза эксперименты in vitro не могут воспроизвести взаимодействие крови со стенками сосудов; Таким образом, исследования in vivo имеют решающее значение для понимания патологических механизмов образования тромбов. С этой целью были разработаны различные модели тромбоза у мышей. Среди них повреждение сосудов, вызванное хлоридом железа (FeCl3), является широко используемой моделью окклюзионного тромбоза, которая сообщает об активации и агрегации тромбоцитов в контексте асептической закрытой сосудистой системы. Эта модель основана на редокс-индуцированном повреждении эндотелиальных клеток, которое является простым и чувствительным как к антикоагулянтам, так и к антитромбоцитарным препаратам. Время, необходимое для развития тромба, который блокирует кровоток, дает количественную меру повреждения сосудов, активации и агрегации тромбоцитов, что имеет отношение к тромботическим заболеваниям. Мы значительно усовершенствовали эту модель тромбоза сосудов, индуцированного FeCl3, что делает данные высоковоспроизводимыми с минимальными вариациями. Здесь мы описываем модель и представляем репрезентативные данные из нескольких экспериментальных установок, которые демонстрируют полезность этой модели в исследованиях тромбоза.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Артериальный тромбоз (сгусток крови) является частым осложнением многих системных заболеваний, связанных с хроническим воспалением, включая атеросклероз, сахарный диабет, ожирение, рак и хронические аутоиммунные ревматологических заболеваний. Тромбы, которые происходят в стволе артериальной циркуляции с несоответствующей активацией тромбоцитов, агрегации и последующих coagulatory механизмов, а также участвуют в сердечных приступов, инсультов и потери конечностей. Стенка сосуд представляет собой сложную систему , которая включает в себя различные типы клеток и зависит от множества внешних факторов , в том числе напряжения сдвига, циркулирующих в крови клеток, гормоны и цитокины, а также экспрессию антиоксидантных белков в стенке сосуда. В пробирке эксперименты не может реплицировать это сложная среда , и поэтому в естественных условиях исследования с использованием животных моделей имеют решающее значение для обеспечения лучшего понимания механизмов , участвующих в тромботических заболеваний.

Мыши было показано, что симИЛАР механизмы для человека с точки зрения тромбоз, атеросклероз, воспаление и диабета 1,2. Кроме того, трансгенные и нокаутные мыши могут быть созданы для тестирования функции специфических генных продуктов в сложном физиологическом или патологическом среде. Такие исследования имитировать патологии человека и может предоставить важную механистическую информацию, связанную с открытием новых путей и методов лечения, а также обеспечивают важные детали при характеристике эффекты препарата на тромбоз.

Патологические артериальных тромбов происходят из - за эндотелиального повреждения слоя или дисфункции и воздействия на поток крови к субэндотелиальном матрицы 3,4. Различные модели тромбоз, были разработаны , чтобы вызвать это повреждение эндотелия , таких как механическое повреждение, фотореакционноспособная соединение бенгальский розовый на основе окислительного повреждения и лазерной травмы 5. В этом спектре, хлорид железа (FeCl 3) индуцированный сосудистых повреждений является широко используемой моделью тромбоза. Этот реагент, когдаприкладывается к внешней аспекту сосудов вызывает окислительное повреждение клеток сосудов 6-8, с потерей защиты эндотелиальных клеток от циркулирующих тромбоцитов и компонентов каскада свертывания. Модель FeCl 3 проста и чувствительна к обоим антикоагулянта и анти-Тромбоциты препаратов, и было выполнено на сонных и бедренных артерий, яремной вены, и брыжеечных и cremasteric артериолы и венулы у мышей, крыс, морских свинок и кроликов 6-15.

Один измеряемый параметр в этой модели является то, время , прошедшее после травмы до полной окклюзии сосуда, измеряемое как прекращение кровотока с помощью измерителя потока Доплера или под непосредственным наблюдением с прижизненной микроскопии 6,7,9. Диапазон времени от 5 до 30 мин, как сообщается в различных исследованиях в C57BL6 мышей 7-10,16, предполагая , что концентрации FeCl 3, виды анестезии, хирургических методов, мыши возраста, геномную фона, метод измерения BLOOD потока, а также других параметров окружающей среды оказывают значительное влияние в этой модели. Эта широкая изменчивость затрудняет сравнивать исследования из различных исследовательских групп и может сделать обнаружение тонких различий трудно.

С видением , чтобы свести к минимуму такие изменчивости и установить равномерно воспроизводимые в модели естественных условиях системы, мы усовершенствовали модель артерии индуцированная сонной FeCl 3 , что делает данные с высокой воспроизводимостью с минимальным изменением 6-10,16-19. В этой статье мы описываем и делиться навыками и сообщают о нескольких репрезентативных экспериментальных примеров, которые могут извлечь выгоду из этой модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры и манипуляции животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитетов (IACUC) из клиники Кливленда в соответствии с политикой Соединенных Штатов службы общественного здравоохранения на гуманное лечение и использовании животного мира , а также в Руководстве NIH по уходу и Использование лабораторных животных.

1. Подготовка:

  1. Флуоресцентным красителем для нанесения этикеток Тромбоциты
    1. Готовят раствор родамина 6G, 0,5 мг / мл, в физиологическом растворе и стерилизацию раствора с фильтром 0,22 мкм.
  2. FeCl 3 Решение
    1. Сделать свежий раствор с концентрацией 30% FeCl 3 (негашеной, равна 1,85 м) в чистой воде, и фильтр с фильтром 0,45 мкм. Подготовка 5 мл свежего FeCl 3 раствора при требуемой концентрации [например, 2,5% (0,154 М), 5% (0,308 м), 7,5% (0,463 М), 10% (0,617 М) и 12,5% (0,771 М)] с разбавлением 30% раствора FeCl 3 с водой , которую яна 6 см блюдо культуры ткани и держать крышку закрытой.
      Примечание: Использование культуры блюдо делает его легче подобрать фильтровальную бумагу , насыщенную раствором FeCl 3 , чем забрать его из узкого контейнера, например, 1,5 мл трубки микроцентрифужных. FeCl3 крайне опасно и что меры предосторожности, такие как использование перчаток и пальто лаборатории и т.д., средства индивидуальной защиты, всегда должны быть приняты.
  3. фильтровальная бумага
    1. Вырезать фильтровальную бумагу до 1 мм х мм размером 2. Замачивание достаточное количество кусков разрезанного фильтровальную бумагу в растворе FeCl 3 в том же блюде.
  4. Папаверин гидрохлорид Раствор
    1. Готовят папаверина гидрохлорида раствор (25 мг / мл) в воде и стерилизуют раствор с 0,22 мкм фильтр.
  5. агарозном геле
    1. Приготовьте 2% -ном агарозном геле в PBS или физиологический раствор в 6-луночный планшет для тканевых культур, ~ 1 см толщиной, и сут его полукруга с диаметром ~ 3 см.

2. FeCl 3 Индуцированные сонных артерий Тромбоз Травма Модель

  1. Хирургические процедуры для тромбозов модели
    1. Используйте 8 - 12 недель C57BL6 мышей (или другие штаммы в случае необходимости). Обезболить мышей со смесью кетамина (100 мг / кг) / ксилазином (10 мг / кг) через внутрибрюшинного введения. Подтвердите глубину анестезии пальца щипать.
      Примечание: Это количество кетамина / ксилазина достаточно , чтобы держать животное в стабильной анестезии и никакой боли (ответ на пальце ноги щипать) , по крайней мере , 1 ч.
    2. Удалите шерсть на шее и верхней части грудной клетки с небольшим животным электрической машинки для стрижки. Крем для депиляции не является необходимым. Нанесите нейтральную мазь нефтяное глаз на глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
    3. Закрепите мышь в положении лежа на спине на крышке 15 см планшета для культуры ткани. Используйте одну длинную ленту (~ 10 см), чтобы обеспечить гинуг конечностей и нижней части тела, а также два куска тонкой ленты (2 см х 0,5 см), чтобы обеспечить передние ноги. Используйте 4-0 швом , чтобы обернуть вокруг резцами, лента два конца шовного материала к крышке , чтобы держать мыши шею прямой (рисунок 2).
    4. Поместите пластину с головой мыши по направлению к оператору при хирургическом источника света.
    5. Стерилизовать хирургический сайт с алкоголем площадку. Используйте микро-Адсон пинцет, чтобы держать кожу и использовать хирургическое ножницы, чтобы сделать небольшой разрез (2 - 3 мм).
    6. Держите кожу разреза с щипцами и вставить хирургические ножницы с зев закрыт в разрез. Нажмите ножницы подкожно в направлении подбородка или рукоятки, а затем откройте ножницы, чтобы освободить кожу от подкожного слоя.
    7. Порезать кожу с хирургическими ножницами , чтобы сделать срединный разрез от рукоятки до уровня подъязычной кости (рис 3А и 3В). Попросту рассекают тонкую фасцию (пунктирная линия, в Рисунок 3B) между подчелюстных желез с тонкой кровоостанавливающего и пинцетом Грефе (рис 3B и 3С; синие стрелки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рукоятка (черная стрелка на рисунке 3C) и трахеи (Т на рис 3C) будет видно после этого шага.
    8. Удерживайте мягкую ткань и кожу увидеть в правой части рукоятки с пинцетом Грефе, вставьте кровоостанавливающего под фасции по направлению к положению 2 часа (желтая пунктирная линия на рисунке 3C), откройте пасть кровоостанавливающего , чтобы освободить яремной вены от окружающих тканей.
    9. Вырезать фасции, мягкие ткани и кожу в направлении положения 2 часа (рис 3C) с хирургическими ножницами , чтобы обнажить правую яремную вену (рис 3D, стрелка).
    10. Draw около 200 - 300 мкл родамина 6G раствора с помощью 1 мл шприц с иглой 22 G, а затем изменитеэто 30 G иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это защищает 30 G иглу от повреждения его тонкого наконечника. Непосредственно рисунок раствора родамина 6G с иглой 30 G не повредит наконечник; Однако касаясь стенки контейнера случайно может привести к повреждению, что может сделать инъекции трудно.
    11. Промойте 30 G иглы, медленно выдавливая родамина 6G решение, убедитесь, что пузырьки воздуха не остаются в шприц или иглу. Держите 100 мкл родамина 6G раствора для инъекций.
    12. Изгиб 2 - 3 мм кончик иглы под углом 90 ° с держателем иглы, которая предотвратит введение иглы слишком глубоко в яремную вену и делает инъекцию более легко контролировать (рис 3D).
    13. Вводят раствор родамина 6G в правую яремную вену на этикетке тромбоцитов. Для того, чтобы стабилизировать шприц и держать иглу в положении, удерживая шприц с одной стороны, и иглы с пинцетом Грефе с другой стороны, во время injection.Afинъекции тер, зажать место инъекции с пинцетом Грефе, чтобы избежать кровотечения.
    14. Откройте пасть кровоостанавливающего и вставить его под пинцетом Грефе, чтобы зажать стенку сосуда в месте инъекции, а затем перевязать место инъекции с 6-0 швом.
      Примечание: В качестве альтернативы стадии 2.1.15, оказывая давление на месте инъекции с пальцем в течение 2 мин будет остановить кровотечение; Тем не менее, этот метод имеет риск возникновения необходимости дальнейшего кровотечения, если тромб в месте инъекции удаляется случайно.
    15. Попросту рассекают мягкие ткани и фасции вокруг левой подчелюстной железы с кровоостанавливающего и пинцетом Грефе и тянуть железу к положению 7 часов (рис 3Е) , чтобы разоблачить левой кивательной мышцы (синяя стрелка на рисунке 3Е).
    16. Попросту рассекают фасцию (рис 3E, пунктирная линия) между левым кивательной мышцы и лопаточно-подъязычная мышца или sternohyподъязычная мышца (рис 3E, зеленая стрелка) , расположенный на левом участке трахеи с кровоостанавливающего.
    17. Пропустите иглу с 6-0 шелковой нити (длиной около 15 см) в середине кивательной мышцы (синяя стрелка на рисунке 3Е), поместите два конца нити вместе и вытяните нить в боковом направлении положения 10 часов ,
      Примечание: Эта процедура должна быть выполнена тщательно , чтобы избежать травм левой яремной вены, которая находится за пределами кивательной мышцы.
    18. Попросту отделить тонкую грудино-подъязычная мышца и / или лопаточно-подъязычная мышца разоблачить сонной артерии (CA) (рисунок 3F стрелка) после того, как отстраняясь кивательной мышцы. Вырезать грудино-подъязычная мышца и / или лопаточно-подъязычная мышца, как это необходимо. Используйте кровоостанавливающего, чтобы отделить мягкие ткани от CA, не касаясь CA.
      Примечание: CA сопровождается блуждающего нерва, белая структура рассматривается в Рисунок 3G (зеленая стрелка), и в большинстве случаев она находится под тонким грудинно - подъязычный мышцы и / или лопаточно-подъязычная мышца (между желтыми пунктирными линиями на рисунке 3е).
    19. Используйте пинцет тоненького кончика, чтобы поднять боковую облицовку вокруг СА, избегая блуждающего нерва и CA. Используйте другой прекрасный кончик пинцетом, чтобы пробить отверстие на лицевой панели между СА и блуждающего нерва.
    20. Пропустите крюк через отверстие и осторожно поднимите ЦС, а затем поместить кончик пинцетом мелкие под CA. Переместить крюк и щипцов в противоположных направлениях вдоль СА раздеться адвентициальных мягких тканей. Свободный , по меньшей мере ~ 5 мм длина CA (рис 3H, синяя стрелка) из окружающих тканей.
    21. Для блокирования фоновой флуоресценции, нажмите конец черной пластиковой кофе мешалкой с плоским, квершлаг мешалку кофе в 3 мм кусок, а затем разрезают в продольном направлении вдоль сгиба краев , чтобы получить две части "U" формы из пластика (рис 3Н, зеленый стрелка).
    22. Полоскание одну часть этого "U" формы пластика с физиологическим раствором и провести его с пинцетом и поместить его под CA, осторожно поднимая СА с крюком (рис 3Н, зеленая стрелка). Немедленно нанести 2-3 капли физиологического раствора, чтобы избежать высыхания CA.
  2. В режиме реального времени записи видео
    1. Передача мыши и пластины крышку вместе с предметный столик микроскопа и место в соответствующем положении под водой объектива 10X. Заполнить пространство между 10-кратным объективом и СА с физиологическим раствором.
    2. Запустите приложение цифровой записи видео программное обеспечение, а также запускать новый файл и назовите его соответствующим образом. Запись изображений обычного сосуда и запишите номер кадра, когда запись видео останавливается.
      Примечание: Ссылка на программное обеспечение для записи видео в компьютер для записи. Мы используем программное обеспечение цифровой записи видео и последующие описания основаны на данной заявке.
      Примечание: Так как механической TRAУма может повредить эндотелий и привести к образованию тромба 20, необходимо подтвердить , что нет никакого хирургического повреждение стенки сосуда до начала травмы FeCl 3. Кроме того , необходимо , чтобы подтвердить , что не осталось ткани вокруг СА, которая может образовывать барьер и ослабить эффект FeCl 3 индуцированного повреждения. Запишите номер кадра записей позволит легко анализировать видео в соответствии истекшее время позже.
    3. Перемещение мыши с пластинчатой ​​крышкой из объектива 10X. Сложите угол бумажное полотенце, чтобы сделать тонкий и тонкой кончик и использовать его тщательно промокните физиологический раствор вокруг СА (не касаясь CA), а также в других местах, в операционное поле. Это важно , чтобы избежать разбавления раствора FeCl 3 используется.
    4. Используйте мелкозернистый кончик пинцетом и возьмите кусочек фильтровальной бумаги , насыщенный раствором FeCl 3 и поместите его непосредственно на ЦС и держать его на месте в течение 1 мин.
      Примечание: TO визуализация помощью кровотоке и уборочного точных данных, поместите фильтровальную бумагу близко к дистальному концу обнаженного СА (рис 3I) и оставить короткий сегмент на проксимальном участке (зеленая стрелка на рисунке 3I) для наблюдения кровотока в последнее время фаза (см ниже).
    5. Удалите фильтровальную бумагу (на этот раз точка определяется как начало "после травмы") и полоскание СА с физиологическим раствором (по крайней мере, 2 мл).
    6. Поместите мышь с пластинчатой ​​крышкой обратно в объектив 10Х; наблюдать за судно и начать записывать видео изображений. Запишите номер видеокадра в конце первой минуты записи.
      Примечание: Образование тромбов определяется накоплением флуоресцентных тромбоцитов, который наблюдается в режиме реального времени видеоизображения на экране компьютера или под микроскопом. Запись видео изображения сразу после ввода мышь обратно под микроскопом. Продолжайте запись до конца первой минуты после удаления диафрагменноеМСДЭНИ бумага. Обратите внимание на весь сосуд от дистальной к проксимальной сайтов для получения информации о травме, а затем сосредоточиться на интересующей области (как правило, является центром травмированной области) для дальнейшей обработки изображений.
    7. Видеоизображений Запись в течение 10 сек каждую минуту в течение первых 10 мин (например, 2:55 до 3:05) , а затем 10 секунд каждую минуту до конца эксперимента. Запишите номера кадров, когда каждая запись была остановлена.
      Примечание: Конечные точки модели являются: 1) , когда поток крови прекратился> 30 сек; или 2), если закупорка не наблюдается через 30 мин после травмы. В этом случае рекомендуется использовать 30 мин для статистического анализа. Установите время экспозиции в записи видео, как 10 мс в начале, так что это будет легко наблюдать поток крови через тромбов. Когда тромбы становятся большими и флуоресценцию насыщает датчика камеры, становится трудно определить кровоток через тромбов. Чтобы решить эту проблему, переместите се изображенияNTER к проксимальной неповрежденную месте (Рисунок 3I, зеленая стрелка) , где поток крови может все еще ​​быть отчетливо наблюдается. Мы также увеличить Expose Время до 15 или 20 мс при фокусировке на проксимальном ун-мозговой травмой месте, поэтому поток крови может наблюдаться более четко. Когда поток крови прекратится, многочисленные крупные клетки (лейкоциты) начинают катиться на стенке сосуда у проксимального участка тромба. Расход обычно останавливается в течение 2 - 3 мин после появления крупных клеток. Запишите Expose Время на листе записи, если она изменяется. Обычно это занимает около 30 минут после анестезии до конца эксперимента, если использовались нормальные мышей дикого типа C57BL6.
      ВНИМАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте белую агрегированный сгустка тромбоцитов как признак прекращения кровотока, который не даст точные данные , и это зависит от времени экспозиции. Белый тромб покрыты просвет сосуда не означает, что поток крови прекратилась (см представитель видео 1).
    8. В конце эксперимента, усыпить мышей с использованием передозировок кетамин / ксилазин (200/20 мг / кг) с последующим смещением шейных позвонков После устранения дыхание и сердцебиение.

3. FeCl 3 Индуцированные брыжеечная артерия / Тромбоз Модель Vein

  1. Обезболить 8 - 12 недель старых мышей C57BL6, как указано в разделе 2.1.1. Нанесите мазь ветеринара на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
  2. Вводят папаверина раствора (всего 0,4 мг / мышь) внутрибрюшинно для ингибирования кишки перистальтику.
  3. Удалите шерсть на шее и животе с животным электрической машинки для стрижки. Крем для депиляции не является необходимым.
  4. Закрепите мышь в положении лежа на спине на крышке 15 см планшета для культуры ткани. Используйте четыре куска ленты небольшой (2 см х 0,5 см), чтобы обеспечить все ноги. Используйте 4 -0 швом , чтобы обернуть вокруг резцами, лента два конца шовного материала к крышке , чтобы держать шею прямой (рисунок 2).
  5. Выполните процедуры 2.1.4 -2.1.15 подвергать яремную вену для инъекции родамина 6G на этикетке тромбоцитов.
  6. Выполните срединный разрез через кожу от мечевидного к нижней части живота с помощью хирургических ножниц (рис 4а). Возьмите среднюю брюшины (также называемый Linea альба, рис 4A, стрелка) с Грефе пинцет, который ясно и не имеет кровеносных сосудов, поднять около 2 - высокий 3 мм, не подтверждают нет кишечника под линии разреза, и разрезают брюшину открыт в продольном направлении до тонких ножниц (рис 4б).
  7. Повторно закрепить мышей правой боковой позиции. Поместите агарозный гель полукруг близко к животу, и осторожно экстериоризоваться кишок и распространить его на верхней части геля с пинцетом Грефе (рис 4в). Используйте второй ветви для тромбоз эксперимента (рис 4C, стрелка).
    Примечание: Используйте кровоостанавливающего или Micro-Адсон пинцет , чтобы помочь экстериоризоваться кишечника. Избегайте больнокишечника и сосуд.
  8. Поместите 5 - 6 капель физиологического раствора, чтобы сохранить влагу кишечника и судна. Перенесите мышь с крышкой пластины вместе, чтобы столик микроскопа и место в соответствующем положении под 10X сухой объектив.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сухую линзу , поскольку jejunoileal мембрана не может содержать физиологический раствор. Убедитесь в том, чтобы упасть солевой раствор на обрабатываемые ткани, чтобы держать их во влажном состоянии.
  9. Пятно физиологический раствор вокруг брыжеечной артерии и вены перед обработкой.
  10. Используйте пинцет тоненького кончика , чтобы забрать кусок фильтровальной бумаги , насыщенный 12,5% раствором FeCl 3 и поместите его непосредственно на брыжеечной артерии и вены в течение 1 мин (рис 4D). Удалите фильтровальную бумагу (на этот раз точка определяется как начало "после травмы") и полоскать травмированного брыжеечной артерии и вены с физиологическим раствором (по крайней мере, 2 мл).
  11. Поместите мышь с пластинчатой ​​крышкой задней под сухой объектив 10Х; соблюдать сосуды и начинают RecORD видео изображения, упомянутые в пункте 2.2).
    Примечание: Конечные точки этого эксперимента являются: 1) , когда поток крови прекратился> 30 сек; или 2), если закупорка не наблюдается через 30 мин после травмы, и в этом случае используют 30 мин для статистического анализа.
  12. В конце эксперимента, усыпить мышей с использованием передозировок кетамин / ксилазин (200/20 мг / кг) с последующим смещением шейных позвонков после того, как не дыхание и сердцебиение не подтверждены.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сонная артерия Тромбоз Модель
У мышей с C57BL6 фоне, мы рекомендуем использовать 7,5% FeCl 3 для лечения сосуда в течение 1 мин в качестве отправной точки. Под обработкой 7,5% FeCl 3, границы поврежденной области и нормальной стенки сосуда легко идентифицируются под микроскопом (см онлайн видео 1), предполагая , что эндотелиальные слой был значительно поврежден. Тромбы образуются сразу же после обработки FeCl 3, и на...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FeCl 3 индуцированную модель является одним из наиболее широко используемых моделей тромбоз, который может не только предоставить ценную информацию о генетических модификаций на функции тромбоцитов и тромбоза 7,8,16,19,31-33, но также может быть ценным инструментом для оценки терапевтических соединений и стратегий для лечения и профилактики заболеваний атеротромботических 11,17,34-37. Здесь мы показали наши изменения и уточнения этой модели и показали дополнительные доказательства полезн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным институтом сердца, легких и крови (NHLBI) Национальных институтов здравоохранения под номерами R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) и R01 HL098217 (PI: Nieman). Содержание данной публикации является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хирургические ножницы - карбид вольфрамаFine Science Tools 14502-14Щипцы Micro-Adson для резки и удержания кожи
- зубчатые/прямые/12 смИнструменты для тонкой науки 11018-12and hold skin
Metzenbaum Fino Ножницы - карбид вольфрама/изогнутый/тупой-тупой/14,5 смИнструменты для тонкой науки 14519-14   для рассечения и отделения мягких тканей
Ультратонкий гемостат - гладкий/изогнутый/12,5 смтонкие научные инструменты 13021-12для рассечения и отделения мягких тканей
Щипцы Грефе - зубчатые/прямые/10 смFine Science Tools 11050-10для рассечения и отделения мягких тканей
Тонкие щипцы Dumont #5 - Советы по биологии/Прямой/Inox/11 смИнструменты для тонкой науки 11254-20 Изолировать сосуд от окружающих тканей
Щипцы Dumont #5XL - Стандартные наконечники/Прямые/Inox/15 смИнструменты для тонкой науки 11253-10Изолировать сосуд из окружающей ткани
Тупой крючок - 12 см/0,3 мм Диаметр наконечникаFine Science Tools 10062-12Изолировать сосуд из окружающей ткани
Микроиглодержатели CastroviejoFine Science Tools 12061-02Иглодержатели
шовные нити 4-0Fine Science Tools 18020-40Для фиксации резцов на пластине
Шовная нить 6-0Fine Science Tools 18020-60Для всех операций и лигирования
Калтовые шовные иглыFine Science Tools 12050-03
родамин 6G Sigma83697-1GК тромбоцитам
FeCl3 (безводный)Sigma12321Для индуцирования повреждения сосудов
Папаверина гидрохлоридSigmaP3510Для ингибирования перистальтики кишечника.
Медлайн Хирургический инструмент Стерилизация Паровые автоклавные лентыМедлайн111625Для фиксации мыши к пластине
Fisherbrand™   Фильтры для шприцев - стерильные 0,22 & микро; mFisher09-720-004Для стерилизации растворов, вводимых мышам
Fisherbrand™   Фильтры для шприцев - стерильные 0,45 & микро; mFisher09-719DДля фильтрации раствора FeCl3
Стерильный спирт Prep PadFisher06-669-62Для стерилизации хирургического участка
Agarose BioExpressE-3120-500Для изготовления гелевого столика
флуоресцентный микроскоп Leica DMLFSLeicaIntravital
платформа GIBRALTAR и система X-Y Stage с прилагаемой нагревательной пластиной.npi electronic GmbHhttp://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
программное обеспечение Streampix версии 3.17.2NorPixhttps://www.norpix.com/
cut , микроскоп ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IIIintravital6GPAR4

Похожие статьи