Описаны методы оценки эффективности и токсичности молекул РНК, нацеленных на постинтеграционные этапы цикла репликации ВИЧ-1. Эти методы полезны для скрининга новых молекул и оптимизации формата существующих.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Описаны методы оценки эффективности и токсичности молекул РНК, нацеленных на постинтеграционные этапы цикла репликации ВИЧ-1. Эти методы полезны для скрининга новых молекул и оптимизации формата существующих.
Терапия малыми РНК, нацеленная на постинтеграционные этапы цикла репликации ВИЧ-1, является одним из лучших кандидатов на генную терапию и имеет потенциал для использования в качестве лекарственной терапии инфекции ВИЧ-1. К ингибиторам постинтеграции относятся рибозимы, короткие РНК шпильки (sh), малые интерферирующие (si) РНК, интерференционные РНК U1 (U1i) и аптамеры РНК. Многие из них были выявлены с помощью анализов на транзиторную котрансфекцию с экспрессирующей плазмидой ВИЧ-1, а некоторые из них дошли до клинических испытаний. В дополнение к показателям эффективности, малые РНК были оценены на предмет их способности влиять на экспрессию РНК человека, изменять рост и/или дифференцировку клеток, а также вызывать врожденные иммунные реакции. В описанных здесь протоколах описан набор анализов транзиентной трансфекции, предназначенных для оценки эффективности и токсичности молекул РНК, нацеленных на постинтеграционные этапы цикла репликации ВИЧ-1. Мы использовали эти анализы для идентификации новых рибозимов и оптимизации формата шРНК и миРНК, нацеленных на РНК ВИЧ-1. Эти методы обеспечивают быстрый набор анализов, которые полезны для скрининга новых РНК против ВИЧ-1 и могут быть адаптированы для скрининга других постинтеграционных ингибиторов репликации ВИЧ-1.
Ограничение текущего лечения ВИЧ-1 является то, что они должны быть хронически введены, чтобы предотвратить прогрессирование заболевания. Пересадка ВИЧ-1 , резистентных Т - лимфоцит или гемопоэтических стволовых клеток, имеет потенциал для обеспечения долгосрочного контроля репликации ВИЧ-1 в отсутствие лекарственной терапии 1,2 , а также может быть эффективным подходом к достижению ВИЧ-1 - лекарство 3. Один из способов визуализации клеток , устойчивых к репликации ВИЧ-1, чтобы вставить один или несколько генов , кодирующих анти-ВИЧ-1 РНК или пептидов в клетки зараженного человека во время аутогенной трансплантации 4. Гены Несколько к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
1. Клетки и Трансфекция
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Общая схема процедур показан на рисунке 2 , с примерным планом для трансфекции трех тестовых РНК и РНК управления , предоставленному на фигуре 2В. Для вирусных производства и жизнеспособность клеток анализы, неизменяемый для каждой испытательной конструкции нормирована отрицательного контроля. Реплики трансфицируют в наборах, так что каждый тест РНК нормирована на прилегающей к нему отрицательного контроля. Это сделано, чтобы избежать неточных данных, от.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Анализ производства ВИЧ-1 описано проводили с использованием клетки HEK293T (рисунок 2) и аналогично анализов , используемых для скрининга ВИЧ-1 РНК для эффективного рибозима 13, shRNA 10,29, миРНК 30 и U1i РНК 11,31 сайтов - мишеней. Используя различные методы для количественного определения ВИЧ-1 производства, большинство исследований измеряли вирусные производство на 48 часов после того, как со-трансфекции плазмиды экспрессии ВИЧ-1 с кандидатами РНК. После .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторам нечего раскрывать.
Работа, представленная здесь, была поддержана Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) (гранты DCB-120266, PPP-133377 и HBF-348967 к AG).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Пенициллин/стрептомицин Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Клеточные культуральные планшеты, 96 лунок, 24 лунки, 6 лунок. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Микропробирки Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Низкомолекулярный поли I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | реагент для трансфекции синтетических РНК |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | реагент для трансфекции плазмид |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| шаблон поли(А) РНК | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 праймер для ДНК | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filter mat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Микропланшетный сцинтилляционный счетчик | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Микропланшетный спектрофотометр | Bio-rad | 1706930 | |
| Лизис буферные таблетки | Roche | 4693159001, 4906837001 | ингибиторы протеазы и фосфатазы |
| Микроцентрифуга | Eppendorf | 5415R | |
| Реагент Bradford | Bio-rad | 500-0006 | |
| Гелевая беговая камера | Hoefer | SE600 | |
| Полусухая передаточная ячейка | Bio-rad | 1703940 | |
| Белковая лестница EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Нитроцеллюлозная мембрана | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Раствор для удаления антител | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | ||
| Антитело | от доктора Б.Л. Басса антитело | ||
| фосфо-T446-PKR | Abcam | ab32036 | |
| антитело фосфо-S396-IRF3 | Cell Signaling | 4947 | |
| антитело | от доктора А. Хованесяна | ||
| антитело IRF3 | Cell Signaling | 11904 | |
| Антитело к актину | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-меченый козий анти-кролик | KPL | 474-1506 | |
| Меченый пероксидазой козий анти-мышиный | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Сигма-Олдрич | 6226-79-5 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.