Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54486

⸱

5 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Virus-Cell Interactions Laboratory, Lady Davis Institute for Medical Research, 2Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 3Department of Medicine, McGill University

В этой статье

Краткое содержание

Описаны методы оценки эффективности и токсичности молекул РНК, нацеленных на постинтеграционные этапы цикла репликации ВИЧ-1. Эти методы полезны для скрининга новых молекул и оптимизации формата существующих.

Аннотация

Терапия малыми РНК, нацеленная на постинтеграционные этапы цикла репликации ВИЧ-1, является одним из лучших кандидатов на генную терапию и имеет потенциал для использования в качестве лекарственной терапии инфекции ВИЧ-1. К ингибиторам постинтеграции относятся рибозимы, короткие РНК шпильки (sh), малые интерферирующие (si) РНК, интерференционные РНК U1 (U1i) и аптамеры РНК. Многие из них были выявлены с помощью анализов на транзиторную котрансфекцию с экспрессирующей плазмидой ВИЧ-1, а некоторые из них дошли до клинических испытаний. В дополнение к показателям эффективности, малые РНК были оценены на предмет их способности влиять на экспрессию РНК человека, изменять рост и/или дифференцировку клеток, а также вызывать врожденные иммунные реакции. В описанных здесь протоколах описан набор анализов транзиентной трансфекции, предназначенных для оценки эффективности и токсичности молекул РНК, нацеленных на постинтеграционные этапы цикла репликации ВИЧ-1. Мы использовали эти анализы для идентификации новых рибозимов и оптимизации формата шРНК и миРНК, нацеленных на РНК ВИЧ-1. Эти методы обеспечивают быстрый набор анализов, которые полезны для скрининга новых РНК против ВИЧ-1 и могут быть адаптированы для скрининга других постинтеграционных ингибиторов репликации ВИЧ-1.

Введение

Ограничение текущего лечения ВИЧ-1 является то, что они должны быть хронически введены, чтобы предотвратить прогрессирование заболевания. Пересадка ВИЧ-1 , резистентных Т - лимфоцит или гемопоэтических стволовых клеток, имеет потенциал для обеспечения долгосрочного контроля репликации ВИЧ-1 в отсутствие лекарственной терапии 1,2 , а также может быть эффективным подходом к достижению ВИЧ-1 - лекарство 3. Один из способов визуализации клеток , устойчивых к репликации ВИЧ-1, чтобы вставить один или несколько генов , кодирующих анти-ВИЧ-1 РНК или пептидов в клетки зараженного человека во время аутогенной трансплантации 4. Гены Несколько кандидатом анти-ВИЧ-1 были разработаны с учетом некоторых в клинических случаях, в комбинации из двух или трех 5 6, чтобы предотвратить развитие ВИЧ-1 , устойчивость к любым одним геном.

Анти-ВИЧ-1 РНК входят в число кандидатов для генной терапии комбинацией из-за их низкого потенциала, чтобы вызывать иммунный ответ и потому что онитранскрибируются с очень коротких последовательностей генов. Некоторые анти-ВИЧ-1 РНК были разработаны, чтобы предназначаться проникновение вируса и интеграции. Тем не менее, большинство анти-ВИЧ-1 РНК целевых шагов после интеграции в жизненном цикле вируса (рисунок 1). Ингибиторы после интеграции включают приманка РНК, нацеливание ВИЧ-1 регуляторные белки Tat или Rev 1, и антисмыслового на основе РНК, ориентированных на различные сайты в РНК ВИЧ-1, такие как рибозимы , 7, 8 и shRNAs U1i РНК 9. Методы , которые были использованы для сравнения эффективности анти-ВИЧ-1 РНК включает мониторинг вирусной репликации в клетках , трансдуцированных гены , кодирующие кандидатов РНК и измерения вирусного производства в клетках временно трансфицированных плазмидами , экспрессирующими кандидатских РНК и экспрессионной плазмиды ВИЧ-1 10 -13. Ранее мы использовали производственный анализ на ВИЧ-1 для скрининга РНК ВИЧ-1 для новых сайтов - мишеней рибозима 13-15. Эти методы, так как были усовершенствованы с целью оптимизации формата РНКмолекулы интерференции , экспрессированный из плазмиды ДНК в качестве shRNA или поставляется в виде синтетического миРНК 16. Анализ измеряет производство зрелых вирусов из эмбриональной почки (НЕК) 293Т клеток человека, и может быть использовано для сравнения эффектов ингибиторов , которые нацелены на шаги после интеграции в цикле репликации ВИЧ-1 (фигура 1). Для ингибиторов , которые нацелены на стадии предварительной интеграции, альтернативные анализы , такие как TZM-бл клеток инфективности 17 необходимы для оценки противовирусной эффективности.

Основные проблемы безопасности для доставки анти-ВИЧ-1 РНК в клинике включают потенциальные эффекты вне цели на человека РНК или белков, а также активации врожденного иммунитета датчиков. Для оценки токсичности анти-ВИЧ-1 киРНК, мы использовали анализ на жизнеспособность клеток в различных клеточных линиях 16. Мы также измерили активацию двухцепочечных иммунных датчиков РНК, РНК-активированная протеинкиназа R (PKR) и Toll подобные рецепторы 3 (TLR3), а также эксприжимное интерферона стимулируется гена, ADAR1 P150. Эти анализы могут быть использованы для подтверждения того, что эффективность анти-ВИЧ-1 РНК не из-за косвенного воздействия на жизнеспособность клеток или активации иммунной датчика. Они также полезны в исключении кандидатов в РНК с потенциальными токсичностью от дальнейшего развития.

В следующих протоколов, процедур для выявления новых терапевтических РНК и оптимизировать формат существующих описаны. Эти методы полезны для скрининга РНК на основе ингибиторов пост-интеграционным репликации ВИЧ-1 и может быть адаптирована для скрининга других ингибиторов после интеграции, такие как малые молекулы , направленных Rev опосредованного экспорта вирусной РНК 18 или CRISPR / Системы Cas , предназначенные для целевой интегрированной ДНК ВИЧ-1 19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Клетки и Трансфекция

  1. Культура НЕК 293T клеток в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина. Приготовить 2 х 10 5 клеток / мл суспензии в клеточной культуральной среде. Добавить 500, 100 и 1000 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного, 96-луночные и 12-луночные планшеты, для вирусного производства, жизнеспособности клеток и анализом активации иммунной системы , соответственно (рис 2А).
  2. Аккуратно водоворот пластин и инкубировать их O / N при 37 ° С с 5% CO 2. Рост клеток на 50-70% сплошности.
  3. Согласно плану трансфекции, подготовить разведений тест - РНК и их контроля в 1,5 мл микро трубок (например, рис 2B).
    1. Для вирусного анализа производства, подготовить 10 нг / мкл разведения плазмиды экспрессии ВИЧ-1 и добавляют по 10 мкл в каждую пробирку. Затем готовят 5 мкМ разведений тест-РНК и отрицательный контроль RNA. Добавление 2,5 или 10 мкл каждого тест-РНК и отрицательного контроля разбавления в соответствующие пробирки в течение 25 или 100 нм конечной концентрации.
    2. Для анализа жизнеспособности клеток, получением раствора 5 мкМ разведений тест-РНК и 10 мг / мл разбавление положительной контрольной РНК, с низкой молекулярной массой поли I А: С. Добавляют 2 мкл тест-РНК или положительных разведений контроль РНК в соответствующие пробирки для 100 нм или 200 мкг / мл конечной концентрации, соответственно.
    3. Для анализа активации иммунной системы, добавляют 20 мкл тест-РНК или РНК-положительных контрольных разведений, полученных на этапе 1.3.2. в соответствующие пробирки для 100 нм или 200 мкг / мл конечные концентрации соответственно.
      Примечание: Для получения плазмид экспрессии РНК-тестирование, подготовить 10 нг / мкл разведений вместо 5 мкМ разведений тест-РНК, что дает конечные объемы 25 и 100 нг в течение шага 1.3.1. и 100 нг для шагов 1.3.2. и 1.3.3.
  4. Добавьте 50, 25 или 75 мкл DMEM в каждую пробирку для трансфекции вирусного продед ен ие, жизнеспособность клеток и анализы активации иммунной системы, соответственно. Для вирусных анализов производства, довести клетки и подготовленные трансфекцию трубки к 3 (BSL3) лаборатории уровня биологической безопасности перед следующим этапом.
  5. Добавляют 2 мкл реагента последовательно трансфекция для трансфекции трубок и инкубировать от 15 до 20 мин, чтобы позволить комплексов с образованием. Смотрите таблицу материалов для конкретного реагента трансфекции для использования.
  6. Добавить всю смесь для трансфекции с каждой микротрубы по каплям к соответствующим положениям в культуре клеток пластин. Аккуратно вихревой и инкубировать пластин в течение 48 ч при 37 ° С с 5% CO 2.
  7. Мера ВИЧ-1 производства (раздел 2), жизнеспособность клеток (раздел 3) и активации иммунной системы (раздел 4) в клеточной культуре пластин (рис 2С).

2. Вирусный Анализ производства,

  1. Удалите 24-луночного культуре клеток пластины из инкубатора и осторожно встряхните пластины внутри культуры клеток BSL3капот. Перенести 150 мкл супернатанта из каждой лунки к соответствующему лунку в 96-луночных плоскодонных пластины, которая будет использоваться для количественного определения ВИЧ-1 производства.
    Примечание: Обычные вирусные квантификации анализы включают измерение экспрессии белка капсида ВИЧ-1 (р24) с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) 20, количественной оценки вирусной РНК с помощью обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) 21 и измерения активности от ВИЧ-1 RT фермента. Шаги 2,2 до 2,5 объяснить методы для количественного определения транскриптазы ВИЧ-1 активность 13,15,16.
  2. Передача 5 мкл супернатанта в соответствующие лунки в 96-луночный планшет, содержащий 25 мкл вирусного нарушение коктейль 15 (таблица 1). Выдержите смесь в течение 5 мин при комнатной температуре и передавать пластину на радиоактивной рабочей станции.
    Примечание: Шаг 2.2. необходимо только если Радиоактивность рабочая станция не доступна в лаборатории BSL3. Если пластины не должны быть удалены изBSL3 лаборатория, перейдите к шагу 2.3. и добавить 50 мкл радиоактивного / вирусного разрушения коктейлем (таблица 1), вместо 25 мкл радиоактивного коктейля.
  3. Приготовьте радиоактивный коктейль 15 (таблица 1), и добавляют по 25 мкл в каждую лунку вирусного супернатанта и разрушающий коктейль. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 2 часов.
  4. SPOT 5 мкл реакционной смеси на соответствующие квадраты в стеклянном волокне ди этиламино Этил (ДЭАЭ) Фильтермат бумаги и позволяют пятна высохнуть в течение 10 мин. Пятно реакционную смесь на любой другой площади, так что никакие два образца непосредственно не граничить друг друга. Это помогает избежать перекрестное между образцами при определении импульсов в минуту (СРМ) на шаге 2.6.
  5. Промыть бумаги 5x в течение 5 мин 2 раза солевым раствором цитрата натрия (SSC) буфере (таблица 1), а затем два 1 мин промывками 95% -ным этанолом. Разрешить бумаги, чтобы высушить и запечатать их в мешки образца.
  6. Клип пакеты с образцами соntaining в Фильтермат бумагу в кассету и вставьте кассету в сцинтилляционного счетчика для микропланшетов. Установить счетчик для чтения ОЭР 32 P с датой отсчета , предусмотренной для партии [32 P] дТТФ , используемого в эксперименте. Выберите, какие образцы для чтения с помощью карты пластины и запустить счетчик.
  7. Для любого вирусного метода количественной оценки, разделить значения, полученные для каждой тест-РНК с помощью соседнего отрицательного контроля и умножить это значение на 100, чтобы получить процент ингибирования ВИЧ-1 производства для каждой повторности из тестовых РНК. Пример результатов сравнения различных тестовых РНК при различных концентрациях обеспечивается на рисунке 3.

3. Жизнеспособность клеток Анализ

  1. Удалите 96-луночные планшеты из инкубатора и добавить 20 мкл 5 мг / мл МТТ (3- [4,5-диметил-2-тиазолил] -2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид), разбавленный в фосфатно-солевом буфере Дульбекко ( DPBS) в каждую лунку. Инкубируйте пластин Fили 3 ч при температуре 37 ° С.
  2. Добавьте 150 мкл изопропанола, подкисленного с моющим средством (1% NP-40, 4 мМ HCl в изопропаноле) в каждую лунку и инкубировать пластин в течение 2 ч при комнатной температуре.
  3. Определить оптическую плотность при 570 нм в спектрофотометре для микропланшетов.
  4. Вычислить относительную MTT метаболизм для каждого положительного контроля и тест-РНК путем деления значения, полученного для каждого образца на его смежного управления трансфекцию. Пример результатов сравнения различных тестовых РНК и положительный контроль обеспечивается на рисунке 4.

4. Анализ активации иммунной системы

  1. Удалите 12-луночные планшеты из инкубатора и аспирата культуральной среды. Осторожно промыть клетки дважды с ДЗФР и добавить 70 мкл холодного буфера для лизиса 22 (включая протеазы и фосфатазы ингибиторы, таблица 1) в каждую лунку. Инкубируйте пластин в течение 10 мин на льду.
  2. Передача лизаты клеток микро трубок и быстро замораживают их, погрузивтрубки в жидком азоте. Разрешить образцы оттаивать и повторить еще 2 циклов замораживания-оттаивания в общей сложности 3.
  3. Центрифуга лизатов в течение 15 мин при 4 ° C, 15700 XG, для осаждения остатков клеток. Передача супернатант к новым микротрубок и определяют концентрацию белка с помощью метода 23,24 Кумасси синим (Bradford).
  4. Устранить 75 мкг белка из каждого образца в денатурирующем полиакриламидном геле , 10% и переносят на нитроцеллюлозную мембрану , как это описано ранее 25,26.
  5. После электрофореза и переноса на мембрану, показывают полосы белка путем инкубирования мембраны в Ponceau S (таблица 1) в течение 1 мин с последующим промыванием в дважды дистиллированной воде. Используйте полосы и белка лестницы в качестве ориентира, чтобы разрезать мембрану при 80 и 55 кДа.
    Примечание: На этапе 4.4 Образцы могут быть запущены на 16 х 18 см 2 гели вниз до 34 кД, так что его легко разрезать мембрану в указанных точках и не прорезалполосы, представляющие интерес. В качестве альтернативы, некоторые гели могут работать с теми же образцами, чтобы избежать сокращения мембраны.
  6. Промыть окрашивание Ponceau S с Трис-буферном солевом растворе , содержащем 0,05% Tween 20 (TBST, таблица 1). Добавить TBST с 5% молока обезжиренного, чтобы полностью покрыть мембраны. Инкубируйте мембраны при комнатной температуре при перемешивании в течение 1 ч.
  7. Инкубируйте мембраны O / N в TBST с 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА), и антитела, разбавленного до концентрации 1 в 1000 против ADAR1 (110 и 150 кДа), фосфо-PKR (62 кДа) и фосфо-IRF3 (47 кДа), для верхней, средней и нижней частей мембраны, соответственно.
  8. Промыть мембраны 5x в течение 5 мин с помощью TBST и инкубировать в TBST с 5% молока обезжиренного и меченных пероксидазой козьими антителами против кроличьих вторичными антителами (разведенные 1: 5000) в течение 1 часа.
  9. Вымойте мембраны 5x в течение 5 мин с TBST и применять раствор Электрохемилюминесценцию (ЭСЛ) для визуализации полос на пленках в соответствии с инструкциями изготовителя.
  10. После визуализации белковых полос на пленках, моют средней и нижней части мембраны в течение 10 мин с раствором антитела зачистки. Инкубируйте мембраны O / N в TBST с 3% БСА и антитела против общего PKR (при 1 в 500) и IRF3 (в 1 из 1000), для средней и нижней частей, соответственно. Повторите шаги 4.8. и 4.9. с помощью меченных пероксидазой козьего анти-мышиного вместо анти-кроличьего вторичного антитела для мембраны ПКР (средний).
  11. Промыть нижнюю часть мембраны 5x в течение 5 мин с помощью TBST и инкубировать мембрану в TBST, содержащим 3% BSA в течение 1 часа с антителом против актина (разведенные 1: 5000). Повторите шаги 4.8. и 4.9. с помощью меченных пероксидазой козьего анти-мышиного вместо анти-кроличьего вторичным антителом. Пример результатов сравнения различных тестовых РНК и положительный контроль обеспечивается на рисунке 5 см. Таблицу материалов для специфических антител , которые будут использоваться.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общая схема процедур показан на рисунке 2 , с примерным планом для трансфекции трех тестовых РНК и РНК управления , предоставленному на фигуре 2В. Для вирусных производства и жизнеспособность клеток анализы, неизменяемый для каждой испытательной конструкции нормирована отрицательного контроля. Реплики трансфицируют в наборах, так что каждый тест РНК нормирована на прилегающей к нему отрицательного контроля. Это сделано, чтобы избежать неточных данных, от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ производства ВИЧ-1 описано проводили с использованием клетки HEK293T (рисунок 2) и аналогично анализов , используемых для скрининга ВИЧ-1 РНК для эффективного рибозима 13, shRNA 10,29, миРНК 30 и U1i РНК 11,31 сайтов - мишеней. Используя различные методы для количественного определения ВИЧ-1 производства, большинство исследований измеряли вирусные производство на 48 часов после того, как со-трансфекции плазмиды экспрессии ВИЧ-1 с кандидатами РНК. После ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа, представленная здесь, была поддержана Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) (гранты DCB-120266, PPP-133377 и HBF-348967 к AG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Пенициллин/стрептомицин GibcoThermo Fisher15140-122
Клеточные культуральные планшеты, 96 лунок, 24 лунки, 6 лунок.Corning353075, 353047, 353043
Микропробирки AxygenCorning311-08-051
Низкомолекулярный поли I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01реагент для трансфекции синтетических РНК
TransIT-LT1MirusMIR 2300реагент для трансфекции плазмид
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
шаблон поли(А) РНК Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 праймер для ДНКThermo Fisher18418-012
DEAE filter mat paper Perkin Elmer1450-522
Микропланшетный сцинтилляционный счетчикPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Микропланшетный спектрофотометрBio-rad1706930
Лизис буферные таблеткиRoche4693159001, 4906837001ингибиторы протеазы и фосфатазы
МикроцентрифугаEppendorf5415R
Реагент BradfordBio-rad500-0006
Гелевая беговая камераHoeferSE600
Полусухая передаточная ячейкаBio-rad1703940
Белковая лестница EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Нитроцеллюлозная мембранаBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Раствор для удаления антителMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher 
Антителоот доктора Б.Л. Басса антитело
фосфо-T446-PKRAbcamab32036
антитело фосфо-S396-IRF3Cell Signaling4947
антителоот доктора А. Хованесяна
антитело IRF3Cell Signaling11904
Антитело к актинуMilliporeMAB1501
Peroxidase-меченый козий анти-кроликKPL474-1506
Меченый пероксидазой козий анти-мышиныйKPL474-1806
Ponceau S Сигма-Олдрич6226-79-5
экспрессии РНКPI32106 ADAR1 PKR

Ссылки

  1. Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
  2. Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
  3. Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
  4. DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
  5. Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236(2015).
  6. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43(2010).
  7. Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
  8. Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
  9. Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
  10. McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55(2009).
  11. Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
  12. Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
  13. Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178(2014).
  14. Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
  15. Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
  16. Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
  17. Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
  18. Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
  19. Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22(2015).
  20. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  21. Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
  22. Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96(2013).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  25. Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
  26. Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
  27. Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
  28. Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
  29. ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
  30. Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80(2007).
  31. Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
  32. Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
  33. Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
  34. Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
  35. Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
  36. Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).
  37. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
  38. Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
  39. Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
  40. Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Таргетинг РНК ВИЧ-1анализ эффективности РНКскрининг токсичности РНКанализ транзиентной трансфекциианализ продукции вирусаанализ жизнеспособности клетоканализ иммунной активацииоптимизация рибозимовдизайн shRNA и siRNAпротокол работы в лаборатории уровня BSL-3
Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.