Применения<em&gt; В Vivo</em&gt; Функциональное тестирование Крысы передней большеберцовой для оценки Tissue Engineered скелетной мускулатуре Ремонт

Ellen L. Mintz; Juliana A. Passipieri; Daniel Y. Lovell; George J. Christ

doi:10.3791/54487

Методическая статья

Применения

17K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54487

⸱

7 октября 2016 г.

Ellen L. Mintz¹ , Juliana A. Passipieri² , Daniel Y. Lovell² , George J. Christ²^,³

¹Department of Pathology, University of Virginia, ²Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, ³Department of Orthopaedic Surgery, University of Virginia

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол in vivo для измерения тыльного сгибания стопы после стимуляции малоберцового нерва и сокращения переднего отдела голени задней конечности крысы. Такие измерения являются незаменимым трансляционным инструментом для оценки скелетной мышечной патологии и подходов тканевой инженерии к восстановлению и регенерации мышц.

Аннотация

Несмотря на регенерационной способности скелетных мышц, постоянных функциональных и / или косметических дефицита (например, потеря объемные мышцы (VML) в результате травматического повреждения, болезней и различных врожденных, генетических и приобретенных условиях весьма распространены. Тканевая инженерия и регенеративные технологии медицины огромны потенциал для обеспечения терапевтического решения. Тем не менее, использование биологически соответствующих моделей животных в сочетании с продольными оценками соответствующих функциональных мер имеют решающее значение для развития улучшенных регенеративных терапевтических средств для лечения VML-подобных травм. в этой связи, коммерческая система мышц рычаг может быть использован для измерения длины, напряжение, сила и параметры скорости в скелетных мышцах. Мы использовали эту систему, в сочетании с высокой мощностью, двухфазного стимулятора, для измерения в естественных условиях производства силы в ответ на активацию передней бедренной отсека задних конечностей крыс. Мы previменно используется это оборудование для оценки функционального воздействия травмы VML на передней большеберцовой (TA) мышцы, а также степень функционального восстановления после лечения травмированного TA мышцы с нашей технологии тканевой инженерии мышцы ремонт () НДПИ. Для таких исследований, левая нога из анестезированных крыс надежно закреплено на подножку, связанного с сервоприводом, а общий малоберцовый нерв стимулируется двумя чрескожных игольчатых электродов, чтобы вызвать сокращение мышц и сгибание стопы. Стимуляции нерва-индуцированное сокращение мышц перонеальная измеряется в диапазоне частот стимуляции (1-200 Гц), чтобы обеспечить в конечном итоге плато в производстве силы, что позволяет для точного определения пика тетанической силы. В дополнение к оценке степени повреждения VML, а также от степени функционального восстановления после лечения, эта методика может быть легко применен к изучению различных аспектов мышечной физиологии и патофизиологии. Такой подход шоÜLD помочь с более рациональной разработке улучшенных терапевтических средств для ремонта мышц и регенерации.

Введение

Скелетная мышца обладает замечательной способностью к внутренней ремонта в ответ на травмы или болезни в ^1,2 раза . Экспериментально робастность этого регенеративного ответа были хорошо документированы в моделях на животных путем изучения, например, временной ход скелетных мышечных повреждений, восстановления и регенерации после нанесения myotoxins (например, cardiotoxin) ^3-7. Более конкретно, после обширных cardiotoxin-индуцированное повреждение мышц (38-67% мышечных волокон ^8), регенерация , опосредованных сателлитных клеток, резиденты стволовые клетки , которые созревают в конечном счете становятся функциональные мышечные волокна ^4,9-13. Конечный результат увеличивается сообщению на повреждения функциональной регенерации здоровых, силы продуцирующих мышечной ткани ^14-16. Хотя детали выходит за рамки настоящего доклада, механистической основой для регенерации мышц отражает тщательно спланированных событий многочисленных типов клеток из нескольких линий, использующих Canoniкал сигнальных путей решающее значение как для развития тканей и морфогенеза ^5,17-21. Важно отметить, что регенерация myotoxin-индуцированный включена тем , что внеклеточный матрикс, нейрональный иннервации и перфузию кровеносных сосудов остаются структурно нетронутыми следующие cardiotoxin индуцированное повреждение мышц ^3,8,22. В противоположность этому, эти ключевые структуры и компонентов ткани, по определению, полностью отсутствует в контексте травмы VML; где откровенная потеря ткани, из - за множества причин, приводит к постоянных функциональных и косметических дефицитов ^23-25.

Вне зависимости от дополнительных проблем, связанных с мышечной восстановления и регенерации после повреждения VML по сравнению с myotoxin-индуцированное повреждение мышц, улучшение понимания механистической основы для скелетной регенерации и восстановления мышц, в различных контекстах, было бы хорошо обслуживается утилизации биологически соответствующие модели животных в сочетании с продольной аssessments соответствующих функциональных из мер. Как здесь обсуждалось, исследования задней конечности крысы обеспечивают отличную модельную систему для достижения этой цели. Более конкретно, мышцы передней голени отсека (передней большеберцовой, разгибатель большого пальца (EDL) и hallicus большого пальца (HL)), которые отвечают за сгибание стопы, легко идентифицируются и манипулировать ими. Кроме того, они обслуживают крупных кровеносных сосудов (подвздошных и филиалов), а также иннервируются нервов (седалищного и филиалов, в том числе малоберцового) по всей длине ноги ^26-28. Таким образом , можно использовать модель крысы задних конечностей непосредственно оценить функцию скелетных мышц / патологии в естественных условиях, или оценить более косвенное влияние патологии , связанные с изменениями в кровеносных сосудах или нервов на соответствующие функции скелетных мышц. В любом случае, тяжести заболевания, а также эффективность лечения может быть определена в зависимости от производства силы мышц (крутящий момент) и соответствующего ножного мovement ^29-34.

В идеальном случае, измерения силы сопровождаются гистологических исследований и анализов экспрессии генов, чтобы более строго оценить структурную и молекулярную состояние скелетных мышц. Основные гистологии и иммуногистохимии, например, способны ответить на вопросы о размерах мышц, выравнивание мышечных волокон, внеклеточного матрикса состава, расположения ядер, числа клеток и локализации белка. Анализ экспрессии генов, в свою очередь, необходимо для определения молекулярных механизмов, которые могут повлиять / модулировать зрелость мышечных волокон, болезненных состояний и метаболической активности. Хотя эти методы дают важную информацию, они, как правило, представляют конечные точки терминала, а самое главное, они не могут напрямую обратиться к функциональной способности скелетных мышц, и, таким образом, соотносительны, а не причинных. Однако, когда гистологические исследования и анализ экспрессии генов оценивали в сочетании с функциональным измэс, а затем, механизмы производства силовой и функциональной регенерации может быть наиболее точно идентифицированы.

В связи с этим, сила , производящая способности мышцы можно измерить в лабораторных условиях , на месте, или в естественных условиях. Все три подхода имеют как преимущества, так и недостатки. В эксперименте , проведенном в пробирке, например, мышца полностью изолирована и удаляется из организма животного. Удаляя влияния кровеносных сосудов и нервов, питающих мышцы, сократительная способность ткани может быть определена в жестко контролируемой внешней среде ^35. При тестировании Ситу мышц позволяет мышцы должны быть изолированы, как и с препаратами в пробирке, однако , иннервация и кровоснабжение остаются нетронутыми. Преимущество на месте экспериментальной модели является то , что она позволяет человеку мышцы должны быть изучены в то время как иннервация и кровоснабжение минимально возмущенных ^36. В обоихв пробирке и экспериментов на месте, фармакологические методы лечения могут быть применены более непосредственно без учета эффектов любых окружающих тканей или воздействия системы кровообращения на измеренных сократительных реакций ^37. Тем не менее, при тестировании функции естественных условиях, как описано в настоящем документе, является наименее инвазивным методом для оценки функции мышц в своей нативной среде ^38, и может быть выполнена повторно в течение долгого времени (то есть в продольном направлении). Таким образом, это будет координационным центром обсуждения ниже.

В связи с этим, чрескожная электроды, вставленные вблизи мышцы интересов или двигательного нерва, который служит ему, обеспечивают электрический сигнал к мышце. Преобразователь затем измеряет Результирующая длина или силы изменения в активированном мышцы в соответствии с указаниями заранее определенного, настроенного программного протокола. Исходя из этих данных, физические свойства мышцы может быть определена. К ним относятся,CE-частота, максимальная столбняк, сила-скорость, жесткость, длина натяжения, и усталость. Длина мышцы или сила также может удерживаться постоянным, так что мышца сокращается изометрически или изотонически. Важно отметить, что эти экспериментальные протоколы могут быть быстро выполнены, легко повторить, и customized- все, пока животное анестезировали и с периодом восстановления от нескольких часов до дней. Один животное может пройти в естественных условиях тестирования силы несколько раз, что позволяет продольные исследования моделей заболеваний или оценки терапевтических платформ / технологий.

Как описано здесь, коммерческая система мышечного рычага в сочетании с высокой мощностью, двухфазный Стимулятор используется для выполнения в естественных условиях тестирования функции мышц , чтобы оценить вклад передней большеберцовой мышцы задней конечности крысы тыльном сгибании стопы посредством стимуляции малоберцового нерва. Мы разработали протокол, который специально разработан для оценки регенеративной медицины / TiСГУП инженерные технологии для ремонта мышц после травматического повреждения VML крысы TA мышцы. Следует отметить; ПНМ и HL должны быть расчленены из передней бедренной отсека для того , чтобы специально оценить мышцы TA (они составляют примерно 15-20% от общего передней большеберцовой крутящего момента , измеренное следующим малоберцового нерва (Corona и др., 2013) ). Поскольку этот подход обеспечивает комплексный продольный анализ мышечной физиологии / функции, она может пролить важный механистического представление о многочисленных других типов физиологических исследований, а также различных заболеваний или терапевтических областях ^39. Например, в естественных условиях тестирования функции мышц применима к изучению физиологии упражнений, ишемии / реперфузии исследования, миопатия, повреждение нерва / невропатии и заболевания сосудов, саркопения и мышечной дистрофии ^40.

Протокол

Все животные были гуманно и все протоколы были одобрены Университета Вирджинии IACUC.

1. Подготовка оборудования

Убедитесь в том, что все машины подключены правильно.
Включите компьютер, за которым следует большой мощности двухфазным стимулятора и рычажной системы двухрежимного.
В это время, поместите животное в наркоз камере, поставляемой с 2% изофлуран, и включите нагревательный элемент таким образом, что платформа нагревается до 37 ° С.
Поместите электроды в 70% этаноле, так что из политетрафторэтилена (PTFE) покрытием наконечники погружены и будут вылечены при настройке устройства и программного обеспечения.
Найдите и откройте программное обеспечение управления рычажной системы на рабочем столе.
Примечание: Это будет программное обеспечение, необходимое для выполнения функционального тестирования.

Установка 2. Программное обеспечение

После того , как программа открыта (Фиг.1А), изменения параметраs для мгновенного Стим в меню Setup до требуемых значений.
Примечание: В этом протоколе все параметры остаются в заданных уровней, за исключением "Run Time (ы)", который изменяется на 180 секунд (рис 1B).
Создайте папку автосохранения под меню Setup.
Найдите тип окна-состоянии с надписью "автосохранение Base". Введите название образца, например "Rat1-дата-временной точки". Непосредственно слева от окна типа-в состоянии "автосохранение Base", нажмите на поле "Enable Autosave."
В верхней части экрана управления, выберите "Sequencer". В новом окне откроется. В нижней части нового окна, выберите "Открыть последовательность". В новом окне откроется. Выберите Premade последовательность и нажмите кнопку OK. Перечень протоколов параметров последовательности , включая частоту, длительность стимулов, а также время отдыха будет развиваться в окне с именем: Редактор последовательности (Рисунок 1C). Нажмите кнопку "Загрузить" Последовательность -> & #34; Закрыть окно ".
Чтобы увидеть в реальном времени тока и стимуляции, выберите "Файл" -> "Live Data Monitor". В новом окне откроется.
В новом окне Live Data, формат экрана для тестирования с помощью функции автоматического масштабирования, или вручную ввести максимальное и минимальное значения Y-отображаемый на экране.

3. Животное Set-вверх

Примечание: Все измерения силы являются те из 11-недельных крыс Льюиса. Существует линейная корреляция между мышечной массы и силы производства (в ньютонах). Поэтому, как возраст увеличивается крысы, значения силы, возникающей в ноге должна возрастать, а также.

Убедитесь в том, что животное находится в правильной плоскости анестезии перед удалением его из камеры анестезии. Полностью удалить все волосы на боковой стороне между лодыжкой и таза экспериментальной ноги с помощью электрического машинки для стрижки волос.
Примечание: Правильная плоскость анестезии достигается, когда животное яS нечувствительной к носочной крайнем случае. Необходимо следовать инструкциям, выдвинутые уходу и использованию животных комитетом каждого учреждения путем.
Поместите животное в положении лежа на спине, обеспечивая нос животного надежно в конусе анестезии носа, так что остается в достаточной глубины анестезии.
Регулировать положение аппарата педали тремя независимыми регуляторами (рисунок 2). С помощью ручки (A и B), чтобы отрегулировать педаль, поместите устройство педали на его крайнем левом и крайнем нижнем положении, соответственно. Это позволит правильное позиционирование ноги животного, оставляя место для последующих манипуляций. В этом положении с помощью ручки слева от дорожки, чтобы переместить аппарат к себе или дальше от экспериментатора так, чтобы животное нога лежит на прямой плоскости.
Очистите ногу с тремя изменениями йода и спирта. Йод должен оставаться на ноге в течение 30 сек.
Отрегулируйте животное или платформу(Рисунок 2A, D) , так что расширенный нога обеспечивает полный контакт между подошвой стопы и ножной педали.
Использование медицинского ленту, закрепить ногу животного против стопы пластины (рис 2D). Крайне важно, чтобы пятка вплотную к нижней части педали и всей стопы является плоской и не вытеснят от плиты во время тестирования.
Расположить зажимной механизм для стабилизации ноги. Вставьте стабилизирующую штифт в достаточно далеко, чтобы уменьшить движение ноги и зафиксировать ее на месте, повернув гаечный ключ.
В этом положении, используйте ручку C для перемещения устройства либо в сторону или от экспериментатора , так что лодыжки, голени, бедра и лежат в одной прямой (рис 2С). Убедитесь в том, что нога параллельно с педалью. Внести необходимые изменения на ходу и тонкой ручки находится на задней части аппарата, чтобы медленно перемещать лодыжку, так что нога и голени находятся в положении 90 °.
Continuе , чтобы переместить ногу так , бедром и голенью находятся на 90 градусов под прямым углом (рис 2В). На данный момент, животное готово к электродам.

4. Размещение электродах

Активировать "Instant стим", нажав на оранжевую кнопку с надписью "Instant Стим".
Поместите оба электрода поверхностно на проксимальном конце передней большеберцовой и перемещать концы электродов вокруг до тех пор, пока шипы видны на экране монитора прямых. В идеале, шипы должны быть около 0,4 N.
Примечание: электроды должны быть размещены рядом и ортогонально к плоскости малоберцового нерва, которая, в свою очередь, проходит в боковом направлении от колена и перпендикулярно к большеберцовой кости.
Вставьте одну иглу достаточно далеко, чтобы пронзить дермы, и едва в мышечный слой. Перемещение другого электрода вокруг, пока шипы не будут видны на экране монитора прямых около 0,6 N. Вставить иглы и зажать их на место с помощью хобби зажима или медицинской ленты.
djust грубой и тонкой настройки, чтобы найти максимальную выходную силу.
На мощном двухфазного стимулятора, будет две ручки в центре. Один называется "RANGE", а другой "ADJUST". Поверните "RANGE" ручку требуемой максимальной силе тока.
Примечание: Пики будет медленно увеличиваться по величине, а максимальная сила тока определяется как уровень, при котором три последовательных раздражений в результате одинаковых ответов сократительной. Сопротивление перевернув сила тока выше, чем это необходимо; максимальная сила тока будет стимулировать все мышцы сокращаться, но любой более высокий ток приведет к набору соседних мышц и потенциально антагонистов, а также.
Поверните «подправить» ручку, чтобы установить процент от "RANGE", который будет использоваться для стимуляции мышц. На данный момент, сила должна прочитать около 1,0 N. Это может потребовать увеличения или уменьшения тока.
Перепроверьте электроды, чтобы убедиться, что они находятся в безопасности. СтопМгновенный Стим.
В окне "Live Data", нажмите кнопку "Начать последовательность".
Продолжайте следить за кривые, возвращаясь к экрану управления, и нажав на кнопку "Анализ", расположенную над оранжевым "Instant Stim" кнопку. Тетаническая кривая должна начать формироваться вокруг стимуляции 60 Гц.

5. Завершение стимуляции и очистки

После того, как последовательность закончена, удалить электроды и протирать с 70% -ным спиртом. Устанавливая электроды в крышках.
Освободить зажим колена и выключить анестезии. Удалить животное от наркоза газа и поместить животное в положении лежа, до сих пор на грелку. Поддерживать крысу на 100% O ₂ в течение нескольких минут после того , как изофлуран газ был выключен , чтобы держать крысу насыщенной кислородом. Животное может двигаться на начальном этапе, но не вернуть животное обратно в клетку, пока животное не приходит в сознание. Если болезненность мышц замеченоПосле восстановления дозы NSAID следует, как определено вашим комитетом по уходу за животными.
Выключите все оборудование, перечисленные в пункте 1.2, закройте программное обеспечение, а также продолжать анализ данных.
Протереть педаль платформы и ног.

Анализ 6. Данные

Примечание: Анализ данных осуществляется в соответствии с последовательностью, разработанную этой лаборатории и в соответствии с лабораторных протоколов. Значения анализа, точки данных, имеющие важное значение, а также другие аспекты процедуры будут меняться в зависимости от намерения пользователя.

Откройте программное обеспечение для анализа данных.
Нажмите на меню с высокой пропускной способностью для проведения анализа нескольких файлов данных (образцов) в то время. Выберите "Frequency Force" Анализ.
Нажмите на кнопку "Выбрать файлы" и открыть столько файлов сохраняются данные по своему усмотрению.
Выберите "Вручную" в поле курсора Способ размещения.
Примечание: Это позволит пользователю анализировать все ДАТА, в пределах желаемой метки времени, в отличие от программы автоматического выбора местоположения для анализа.
Измените значение временной метки End Курсор до 2. Нажмите кнопку "Анализ" (Рисунок 1D).
Для сохранения таблицы и анализа данных с помощью электронных таблиц, нажмите на кнопку "Сохранить таблице кнопку ACSII. Это позволит сохранить файл, и он может быть открыт с электронной таблицей в более позднее время.
Откройте сохраненный файл данных в электронной таблице.
Создать дополнительный столбец с надписью "Absolute Maximum", и определить разницу между исходным уровнем и максимальных значений для каждого образца. Это обеспечит общую максимальную силы, создаваемой на каждой частоте.
Для определения крутящего момента, умножить каждую величину силы на длину плеча рычага.
Примечание: В этом случае, который будет представлен длины ног животного. Этот протокол использует среднее экспериментально определенное значение 30 мм. Пользователь теперь определены значения для маximum крутящий момент на каждой частоте.
Построить график изменения этих значений в качестве частоты крутящего момента кривой, или, максимальный крутящий момент производимого животного на всех частотах стимуляции.
Примечание: Это может быть идентифицирован и использован в качестве одной точки сравнения между образцами.

Результаты

Тетаническая кривая может быть использована, чтобы отличить оптимальные результаты от неоптимальных результатов. Эта кривая обычно начинает формироваться при частоте 60 Гц. Ключевым фактором для получения хороших результатов является способность стимулировать мышцы так, что он производит свою максимальную силу и сохраняет эту силу в течение столбняка. Идеальная кривая должна иметь непрерывный, резкий, вертикальный подъем во время стимуляции, а затем плоской фазе плато с минимальными колебаниями, а также непрерывный, резкий вертикальный уменьшение периода при прекращении стимуляции (рисунок 4). Отклонения от идеальной кривой признаки того, что устает мышцы (рис 5D) или что мышца не должным образом стимулируются , чтобы произвести максимальную силу (рис 5B - C). Последнее обычно является результатом неправильного размещения электрода что приводит к выходу из строя максимального набора мышечных волокон во время Stimulaции. Отличительной особенностью, которая позволяет исследователю определить, является ли неидеальный кривая является результатом неправильного размещения электродов или патологических изменений в мышцы, является ли или нет тетаническая кривая завершена (плавленый) или неполной (Незакрепленное). Незакрепленное, неполная тетаническая кривая указывает на то, что электроды неуместны, в результате чего мышцы не испытывают максимального сокращения. Примером патологического изменения в мышце можно наблюдать как снижение максимального сокращения по сравнению с контролем, или сократительной реакции, которые более быстро устает.

Три различных типа пиков , полученных в течение этой процедуры представляют собой различные электродные и ножные позиции и их можно увидеть на рисунке 3. Первые пики будут вокруг 0,4 N и иметь место , когда правильное расположение электродов определяется поверхностно на коже (рис 3A). Второй набор пиков имеет часigher амплитуда, как правило , около 0.5-0.6N (рис 3B) и происходит , когда электроды пронзит дермы. После того, как они получены, голени и стопы корректируются , чтобы максимизировать производство силы, которая достигается , когда максимальная амплитуда возрастает до приблизительно 1N или более (рис 3C). На данный момент, мгновенный Стим может быть выключен, и последовательность может начаться. Эти руководящие принципы обеспечения точных и воспроизводимых результатов и являются ключевыми контрольно-пропускных пунктов протокола.

Конечные результаты могут быть представлены по-разному в зависимости от информации о том, что пользователь, извлеченной из усилия испытания и эксперимента. В этом протоколе, максимальная сила измеряется во всех частот стимуляции, однако другие точки данных могут быть важны для конкретного исследователя или приложения. Одним из примеров является частота стимуляции, при которой кривая тетаническая начинает складываться. Tон данные можно сравнить с другими результатами, полученными из предыдущего или последующего эксперимента на том же животном, или для сравнения между различными группами обработки. Производство Силы могут быть нормализованы по массе тела, чтобы вычислить изометрической силы и обеспечить более объективную оценку влияния возраста на максимальном сжатии наблюдается. Хотя животные отличающегося массы тела и возраста будет производить различные максимальные силы, форма кривой тетанического должна соответствовать между всеми группами, когда процедура выполнена правильно.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор системы управления установкой рычага и программного обеспечения для анализа данных для анализа (A) Обзор программного обеспечения управления при открытии программы.. (B) Параметры для "Instant Стим" . (C) Пример последовательности для силовой частоты стимуляции. (D ) Типичные данные анализа частоты силы с высокой пропускной способностью в программном обеспечении анализа. Следует отметить , что процедура анализа пример последовательности и данных , специфичных для данного протокола и не представляет полный спектр последовательностей и выходов, которые предусмотрены этим программным обеспечением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Критические аспекты для позиционирования Крысы и размещения стопы в аппарате (A) Крыса находится в положении лежа на спине с левой ноги надежно прикреплен к подножке.. Правильные углы, сделанные стопы, ноги, бедра и обведены. (B) Правый угол , созданный лодыжке подсвечивается. (C) нога должна быть выровнены по прямой плоскости от стопы к телу. (D) Размещение электрода параллельно и перпендикулярно к плоскости малоберцового нерва. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Представитель Пики демонстрирует важность правильного электрода размещения для производства Максимальная сила (A) Базовые пиковые тетанической ответы , наблюдаемые с электродами , расположенными слишком поверхностно.. (Б) Большие пики с введенными электродами , в правильном месте. (C) Переход от больших пиков сигнализации правильное размещение электродов для оптимальной предварительной последовательности пиковой амплитуды как позиции голени и стопы оптимально регулировать./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рис . 4: Оптимальная тетанической Кривая при частоте 100 Гц Эта кривая увеличивается и резко уменьшается и имеет плоскую фазу плато. Этот пример показывает правильное расположение электродов и максимальную стимуляцию силы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рис . 5: Характерные примеры суб-оптимальных тетанической кривых , полученных при частоте 100 Гц (A) После релаксации, эта кривая опускается ниже базового уровня. Это свидетельствует о стимуляцииантагонистов. (B - D) Эти графики являются результатом неправильного размещения электродов и неравного набора мышечных волокон. Фазы плато демонстрируют большие колебания (В), восходящий уклон (C), или наклон вниз (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Этот протокол демонстрирует относительно простой способ для выполнения в тестировании функции естественных условиях мышцы на передней голени отсеке задней конечности крысы. Другие формы тестирования функции мышц, в том числе экс естественных условиях и в протоколах на места, а также может предоставить важную информацию о мышечной физиологии. Тем не менее, значение естественных условиях тестирования функции в заключается в его неинвазивной природы, а также тот факт , что наиболее точно повторяет эндогенные механизмы стимуляции мышц. Для обоих бывших естественных условиях и тестирования на месте, сухожилия и / или мышцы в подвергаются, и , следовательно, должен быть влажным или погруженным ^41,42. В естественных условиях тестирования удаляет вмешивающиеся переменные травмы и воспаления , которые могут быть вызваны хирургических процедур , необходимых для тестирования на месте функции мышц в; это особенно важно, если целью эксперимента является изучение воспалительных и клеточных процессов 43. Кроме того, тестирование в естественных условиях требует небольшого хирургического мастерства , как мышца не изолирована от окружающей среды и не требует точных узлов , чтобы уменьшить мышцы / сухожилия проскальзывание (как это имеет место для на месте или ех естественных условиях тестирования) ^41. Кроме того, с достаточной практикой, скорость правильного размещения электродов и способность быстро вносить коррективы для достижения максимальной выработки усилий мышцы будет гарантировать , что завершение протокола является быстрым и reproducible- как внутри животных и между различными пользователями одного и того же оборудования ³⁹ , Это полезно начать с оценки всей передней бедренной компонента, как показано на рисунке, до иссечения менее доступных синергических мышц (EDL и HL) для более прямого исследования мышц TA. Используя этот подход, можно достаточно быстро достичь мастерства техники. Хотя процедура, описанная здесь, демонстрирует и подчеркивает полезность силы фрПротокол equency, чтобы вызвать столбняк и определить максимальную силу, создаваемую мышцы, пользователи должны определить тип (ы) функционального тестирования, которые бы наилучшим образом информировать их конкретный эксперимент (ы) и научно-исследовательских целей.

Есть несколько важных шагов, которые должны быть тщательно выполнены для того, чтобы обеспечить оптимальные и воспроизводимых экспериментальных результатов, то есть последовательное производство максимальное усилие мышцами для различных параметров стимуляции. Некоторые из ключевых особенностей описаны на рисунке 2. Тем не менее, правильное размещение и стабильность стимулирующего электрода является абсолютно необходимым условием для воспроизводимой максимальной стимуляции малоберцового нерва. В связи с этим, электроды должны быть размещены поверхностно. То есть, если размещение электрода слишком глубоко, есть риск, что прямой электрической стимуляции мышц-антагонистов, тем самым уменьшая величину наблюдаемого сократительной реакции передней бедренной отсека. Кроме того,два электрода должны быть помещены в качестве непосредственной близости друг от друга, как это возможно, чтобы уменьшить электрическое сопротивление окружающей кожи и соединительной ткани. В общем, электрод позиционирование близко к колену и медиально к ноге непосредственно трассировку край передней большеберцовой, где она встречает икроножной часто приводит к адекватной силы производства. Это также гарантирует, что электроды расположены смежно и перпендикулярно к плоскости малоберцового нерва, которая, в свою очередь, проходит перпендикулярно к большеберцовой кости и в боковом направлении вниз по ноге от колена. Тем не менее, естественная изменчивость в анатомии между животными требует постоянной бдительности, чтобы гарантировать, что размещение электрода оптимизирован на индивидуальной основе случая. Таким образом, существует определенный уровень проб и ошибок, связанных с размещением электрода, который значительно уменьшается от опыта пользователя. Число раз электроды прокалывают кожу следует свести к минимуму, чтобы уменьшить отек и воспаление, которое уменьшает меняasured производительной силой. Это зависит от того, где иглы первоначально размещены, но рекомендуется для перемещения игл в два раза или менее, особенно в области вокруг коленной чашечки. Наконец, как только электроды расположены в ноге животного, незначительные изменения могут быть сделаны к позиционированию ножке и обеспечиваемого тока через электроды. Это должно быть сделано одновременно с измерением силы, создаваемой из одного дергаться. В дополнение к размещению электродов, регулировки могут также быть сделаны в напряжение, подаваемое на электроды. Тем не менее, в установке, описанной здесь, важно соблюдать осторожность при увеличении напряжения как способ повышения выходной силы, так как повышенное напряжение будет стимулировать нервы, которые иннервируют мышц-антагонистов.

Существуют три основных технических проблем, которые должны быть проверены, чтобы гарантировать, что размещение электрода остается оптимальным. Во-первых, нога наркозом животного должна быть надежноприкрепляется к устройству педалью, который измеряет способность мышц вырабатывать силу (рисунок 2). Если нога не надежно закреплены, истинная сила, создаваемая мышце может быть полностью переведен на датчика силы. Нестабильная фиксация стопы также вводит риск потери оптимальное размещение электродов как движение за пределы нормального сокращения мышц (т.е. нога отходит от подножку) может вызвать смещение электродов от их поверхностных положения или выбивать их полностью. Любой из них будет уменьшаться измеренное усилие. Во- вторых, тело животного должно быть полностью лежачее и выровнены по прямой плоскости (рисунок 2). Правильное позиционирование тела животных предотвращает незначительные движения ноги из-за дыхания, а также сводит к минимуму скручивание ног и таза, что позволяет лучше разместить и непрерывный контакт из раздражающих электродов. В-третьих, правильное позиционирование и закрепление колена является critiкал, чтобы гарантировать, что нога остается устойчивым, и, таким образом, помогает стабилизировать оптимальное размещение стимулирующего электродов, чтобы обеспечить последовательное активацию малоберцового нерва.

Есть несколько дополнительных моментов, которые следует подчеркнуть. Во-первых, коммерческая система мускул рычаг предназначен для проведения тестирования на левой ноге, однако установка может быть изменена, чтобы провести тестирование на правой ноге, а также. Во-вторых, систем рычагов мышц могут быть выбраны в зависимости от размера животного, так что пользователи должны гарантировать, что платформа используется достаточна для измерения и поддерживать силу, создаваемую животной модели выбора. Тестируемые мышцы для платформы оборудования ограничены теми, которые вызывают расширение или подошвенной сгибание стопы. В-третьих, следует еще раз подчеркнуть, что расположение электродов может быть сложным и требует терпения и практики, чтобы овладеть техникой. Электроды также быстро становятся тупыми при регулярном использовании, поэтому полезно иметь несколько запасных секЭТС на этот раз становится трудно проколоть кожу поверхностно. В-третьих, протокол, описанный в настоящем докладе используются специфические последовательности стимуляции и процедур анализа данных. Программное обеспечение для анализа мышечного рычага управления программным обеспечением системы и данных, и данные, которые она предоставляет ответы на многие другие экспериментальные вопросы и, следовательно, его полезность, выходит за рамки того, что изложенные в настоящем документе. Таким образом, пользователям рекомендуется изучить за пределы протокола (программ), представленные в этой статье. Несмотря на эти незначительные ограничения, в естественных условиях тестирования функции мышц является мощным подход для определения способности здоровья и сократительную скелетных мышц , так как она является минимально инвазивной и может быть выполнена на несколько раз, в течение длительного периода времени, на том же животном. Короче говоря, этот тип исправном утилита делает систему особенно умело тестирования эффектов новых видов лечения для скелетной мышечной травмы или болезни в задней конечности крысы.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Ханну Бейкер за ее обширную работу по оптимизации этой процедуры.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Изотезия	Henry Schein Animal Health	05260-04-04
Изофлуран Вапорайзер-воронка Заполнение	Vet Equip	911103
Входной адаптер для Vaporizer	Vet Equip	911124
Выходной адаптер для Vaporizer	Vet Equip	911125
Настольный анестезиологический аппарат	Vet Equip	901801
Сжатый кислород газообразный	Praxair	N/A
VaporGuard Фильтр с активированным углем	Vet Equip	931401
T / Pump Профессиональный водонагреватель	Stryker	N/A	Set on Continuous Therapy Time at 38/100 для температуры
Transpore Surgical Tape	3M	1527S-1	разорвать пополам, чтобы сделать более тонкие полоски
A5 Golden animal clippers	Oster	078005-050-002
Раствор повидона-йода	Aplicare	82-227K
Спиртовые тампоны
200 пробы Этанол	Decon labs		разбавленный до 70% деионизированной водой
ватные аппликаторы	Puritan	836-WC
Электроды с тефлоновым покрытием-Монополярный игольчатый электрод	Chalgren Enterprises	111-725-24TP
серводвигатель	Cambridge Technology	Model 6650LR
Двухрежимная рычажная система	Aurora Scientific Inc	Модель 305C-LR-FP	свяжитесь с производителем для заказа
сигнального интерфейса	Aurora Scientific Inc	Модель 604A
Мощный двухфазный стимулятор	Aurora Scientific Inc Модель	701C
Анализ данных программное обеспечение	Aurora Scientific Inc	программное обеспечение DMAv5.110 программное обеспечение
для управления системой мышечного рычага Программное обеспечение	Aurora Scientific Inc	DMCv5.400 программное обеспечение

Ссылки

Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H., Jarvinen, M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 33, 745-764 (2005).
Ciciliot, S., Schiaffino, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle. Basic mechanisms and clinical implications. Curr Pharm Des. 16, 906-914 (2010).
Lin Shiau, S. Y., Huang, M. C., Lee, C. Y. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther. 196, 758-770 (1976).
Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
Couteaux, R., Mira, J. C., d'Albis, A. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury I. Cytological aspects. Biol Cell. 62, 171-182 (1988).
d'Albis, A., Couteaux, R., Janmot, C., Roulet, A., Mira, J. C. Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Eur J Biochem. 174, 103-110 (1988).
Reali, M., Serafim, F. G., da Cruz-Hofling, M. A., Fontana, M. D. Neurotoxic and myotoxic actions of Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle in vitro. Toxicon. 41, 657-665 (2003).
Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, 628-633 (2007).
Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10, 504-514 (2012).
Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3647-3656 (2011).
Lees, S. J., Rathbone, C. R., Booth, F. W. Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C609-C615 (2006).
Rotter, R., et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue. J Orthop Res. 26, 1618-1626 (2008).
Rathbone, C. R., Wenke, J. C., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Importance of satellite cells in the strength recovery after eccentric contraction-induced muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, R1490-R1495 (2003).
Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 75, 19-37 (2006).
Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
von Maltzahn, J., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., Rudnicki, M. A. Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609 (2012).
Collu, G. M., Hidalgo-Sastre, A., Brennan, K. Wnt-Notch signalling crosstalk in development and disease. CMLS. 71, 3553-3567 (2014).
Bjornson, C. R., et al. Notch signaling is necessary to maintain quiescence in adult muscle stem cells. Stem Cells. 30, 232-242 (2012).
Vignaud, A., Hourde, C., Butler-Browne, G., Ferry, A. Differential recovery of neuromuscular function after nerve/muscle injury induced by crude venom from Notechis scutatus, cardiotoxin from Naja atra and bupivacaine treatments in mice. Neurosci Res. 58, 317-323 (2007).
Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research, C. Volumetric muscle loss. J Am Acad Orthop Surg. 19 Suppl 1, S35-S37 (2011).
Sicari, B. M., et al. A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement. Tissue Eng Part A. 18, 1941-1948 (2012).
Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Biores Open Access. 1, 280-290 (2012).
Armstrong, R. B., Phelps, R. O. Muscle fiber type composition of the rat hindlimb. Am J Anat. 171, 259-272 (1984).
Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plast Reconstr Surg. 105, 1704-1711 (2000).
Lin, J. B., et al. Imaging of small animal peripheral artery disease models: recent advancements and translational potential. Int J Mol Sci. 16, 11131-11177 (2015).
Larcher, T., et al. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PloS one. 9, e110371(2014).
Warren, G. L., Stallone, J. L., Allen, M. R., Bloomfield, S. A. Functional recovery of the plantarflexor muscle group after hindlimb unloading in the rat. Eur J Appl Physiol. 93, 130-138 (2004).
Muller-Delp, J. M., Spier, S. A., Ramsey, M. W., Delp, M. D. Aging impairs endothelium-dependent vasodilation in rat skeletal muscle arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1662-H1672 (2002).
Liu, M., Bose, P., Walter, G. A., Thompson, F. J., Vandenborne, K. A longitudinal study of skeletal muscle following spinal cord injury and locomotor training. Spinal Cord. 46, 488-493 (2008).
Yoshida, H., et al. A phosphodiesterase 3 inhibitor, K-134, improves hindlimb skeletal muscle circulation in rat models of peripheral arterial disease. Atherosclerosis. 221, 84-90 (2012).
Regensteiner, J. G., et al. Chronic changes in skeletal muscle histology and function in peripheral arterial disease. Circulation. 87, 413-421 (1993).
Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. , e4198(2012).
MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. , e3167(2011).
Grassi, B., Gladden, L. B., Samaja, M., Stary, C. M., Hogan, M. C. Faster adjustment of O2 delivery does not affect V(O2) on-kinetics in isolated in situ canine muscle. J Appl Physiol (1985). 85, 1394-1403 (1998).
Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12, 246(2011).
Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 20, 705-715 (2014).
Burks, T. N., et al. Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia. Sci transl med. 3, 82ra37(2011).
Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).
Machingal, M. A., et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).
Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions. J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).