Синтез циклических полимеров и характеристика их диффузионное движение в расплавленном состоянии на уровне отдельной молекулы

Summary

Протокол для синтеза и определения характеристик диффузионного движения циклических полимеров на одной молекулы уровне представлена.

Abstract

Мы демонстрируем метод синтеза циклических полимеров и протокол для характеристики их диффузионного движения в состоянии расплава на уровне одной молекулы. Для синтеза циклического поли(тетрагидрофурана) (поли(ТГФ)) используется процесс электростатической самосборки и ковалентной фиксации (ESA-CF). Диффузионное движение отдельных циклических полимерных цепей в состоянии расплава визуализируется с помощью флуоресцентной визуализации одной молекулы путем включения флуорофорного звена в циклические цепи. Диффузионное движение цепей количественно характеризуется с помощью комбинации анализа среднеквадратичного смещения (MSD) и анализа кумулятивной функции распределения (CDF). Циклический полимер проявляет многомодовую диффузию, которая отличается от его линейного аналога. Результаты показывают, что диффузионная гетерогенность полимеров, которая часто скрыта за ансамблевым усреднением, может быть выявлена путем эффективного синтеза циклических полимеров с использованием процесса ESA-CF и количественного анализа диффузионного движения на уровне отдельных молекул с использованием анализов MSD и CDF.

Introduction

Циклические полимеры уникальны тем, что у них нет цепных концов. Они часто демонстрируют необычное поведение, которое отличается от их линейного аналога, включая повышенную термическую стабильность полимерных мицелл за счет линейного преобразования в ^{циклический,1,2} и пространственную организацию ДНК в бактериальных клетках за счет образования петли. ³ Считается, что топологические взаимодействия между циклическими цепями являются критическим фактором для такого необычного поведения. ^4,5 Таким образом, определение характеристик движения и релаксации циклических полимеров в запутанных условиях является важной темой исследований в науке о полимерах на протяжении десятилетий. ⁶

Циклическая динамика полимеров была исследована с использованием как синтетических, так и природных молекул с помощью экспериментальных методов, усредненных по ансамблю, таких как ядерный магнитный резонанс (ЯМР), рассеяние света и измерения вязкости. ^7-9 Однако эти исследования часто страдают от молекул примесей в образцах. ¹⁰ Кроме того, пространственно-временные неоднородности движения отдельных молекул, вызванные врожденной структурной неоднородностью запутанных полимеров, часто скрываются за усреднением ансамбля в этих исследованиях. Для того чтобы охарактеризовать динамику циклических полимеров на молекулярном уровне, необходимо разработать метод синтеза, обеспечивающий получение циклических полимеров высокой чистоты, а также экспериментальный и аналитический методы, позволяющие количественно охарактеризовать движение молекул на уровне отдельных молекул. Здесь мы покажем способ синтеза циклических и дициклических полицепей высокой чистоты (THF), включающих флуорофорную единицу, с использованием процесса электростатической самосборки и ковалентной фиксации (ESA-CF)^11-13, а также метод анализа движения отдельных полимерных цепей, включенных в флуорофор, с использованием комбинации анализа среднеквадратичного смещения (MSD) и кумулятивной функции распределения (CDF).

Было показано, что правильная обработка данных имеет важное значение для точной характеристики диффузионного движения. С помощью адекватного анализа MSD и CDF была выявлена многомодовая диффузия циклических и дициклических полимеров в расплаве и полуразбавленном растворе линейных полимерных ^{цепей,14-16} что свидетельствует о значительном влиянии топологических состояний полимеров на диффузионное движение цепей в запутанных условиях. ¹⁷ В то время как экспериментальный и аналитический подходы к характеристике движения циклических полимеров описаны в настоящем протоколе, тот же метод может быть использован для количественной характеристики диффузионного движения во многих других гетерогенных системах. Этот подход будет особенно подходящим в тех случаях, когда необходимо проанализировать несколько диффузионных компонентов, присутствующих в образцах.

Protocol

1. Синтез монофункциональных и бифункциональных Поли (ТГФ)

1. Монофункциональное поли (ТГФ)
   1. Пламя насухо 2-образным вырезом 100-мл колбу с круглым дном. Вакуумные и заполняют колбу с азотом (3 цикла).
   2. Добавить дистиллированную тетрагидрофуран (ТГФ) (50 мл) в колбу. Поместите колбу в водяную баню при температуре 20 ° С и уравновешивания температуры.
   3. Добавить метилтрифлатом (0,5 ммоль) в колбу с помощью шприца. Смесь перемешивают в течение 5-10 мин при температуре 20 ° С.
   4. Добавить N -фенил пирролидина (4-6 экв.) В колбу с помощью шприца. Смесь перемешивают в течение 30-60 мин.
   5. Полностью удалить растворитель при пониженном давлении (около 100 мм рт.ст.). Остаток растворяют в 3-5 мл ацетона. Добавить раствор ацетона в 300-500 мл н - гексана. Фильтр осадка и сушат под пониженным давлением.
2. Бифункциональные поли (ТГФ)
   1. Пламя насухо 2-образным вырезом 100-мл колбу с круглым дном. Vacuum и заполнить колбу с азотом (3 цикла).
   2. Добавить дистиллированную ТГФ (50 мл) в колбу. Поместите колбу в водяную баню при температуре 20 ° С и уравновешивания температуры.
   3. Добавить ангидрида трифторуксусной кислоты (0,3 ммоль) в колбу с помощью шприца. Смесь перемешивают в течение 5-10 мин при температуре 20 ° С.
   4. Добавить N -фенил пирролидина (4-6 экв.) В колбу с помощью шприца. Смесь перемешивают в течение 30-60 мин.
   5. Полностью удалить растворитель при пониженном давлении (около 100 мм рт.ст.). Остаток растворяют в 3-5 мл ацетона. Добавить раствор ацетона в 300-500 мл н - гексана. Фильтр осадка и сушат под пониженным давлением.

2. Синтез перилен диимидом-4 включены вооруженные Звезда и 8-образный бициклических Поли (ТГФ)

1. Вооруженный звезда поли (ТГФ)
   1. Ионный обмен
      1. Растворите периленкарбок диимид тетракарбоксилата натриевой соли в воде (10 мг / мл, 150 мл). растворятьсямонофункциональный поли (ТГФ) в ацетоне (160 мг / мл, 4 мл). Добавл ют по капле ацетонового раствора в интенсивно перемешиваемой водном растворе. Собирают образовавшийся осадок фильтрацией.
      2. Повторите описанную выше процедуру с извлеченного осадка (2.1.1.1) четыре раза.
   2. Ковалентная крепление
      1. Растворение полученного осадка в толуоле (5 мг / мл). Нагревание с обратным холодильником раствора в течение 4 ч.
      2. Полностью удалить растворитель при пониженном давлении (около 100 мм рт.ст.). Фильтр остаток через пробку из силикагеля с использованием н - гексан / ацетон (2/1 об / об). Добавить раствор в охлажденную льдом воду (300-500 мл), чтобы осадить продукт. Собирают осадок фильтрованием.
2. Двухцикличный 8-образный поли (ТГФ)
   1. Ионный обмен
      1. Растворите периленкарбок диимид тетракарбоксилата натриевой соли в воде (6 мг / мл, 50 мл). Растворите бифункциональный поли (ТГФ) (0,5 г) В 30-50 мл ацетона. Добавл ют по капле ацетонового раствора в интенсивно перемешиваемой водном растворе при 0 ° С. Собирают образовавшийся осадок фильтрацией.
      2. Повторите описанную выше процедуру с извлеченного осадка (2.2.1.1).
   2. Ковалентная крепление
      1. Растворение полученного осадка в толуоле (0,05 г / л). Нагревание с обратным холодильником раствора в течение 4 ч.
      2. Полностью удалить растворитель при пониженном давлении (около 100 мм рт.ст.). Добавить толуол частично растворяют остаток. Повторно осаждаются в 300-500 мл н - гексана.
      3. Фильтр образовавшийся осадок через пробку из силикагеля с использованием н - гексан / ацетон (2/1 об / об). Повторно осаждаются в 300-500 мл воды.
      4. Очищают образовавшийся осадок путем хроматографии на колонке с использованием ¹⁸ гель полистирола. Дальнейшей очистки сырого продукта с помощью препаративной гель - проникающей хроматографии (ГПХ) с ¹⁹ в качестве элюента смеси CHCl ₃ РемуOve побочных продуктов путем мониторинга показателя преломления (RI) и УФ-детекторов.

3. одиночных молекул флуоресцентной томографии Эксперимент

1. Базовые приготовления
   1. Очистка микроскопа покровных стеклах
      1. Место No. 24 1,5 х 24 мм микроскоп крышка скользит в сосуд для окрашивания.
      2. Добавить раствор гидрида 1 М калия (100 мл) в банку и разрушать ультразвуком в течение 15 мин. Слейте раствор гидроксида калия при декантации и ополаскивают покровных стеклах с ультра-чистой водой несколько раз. Добавить спектроскопического класса этанола (100 мл) в банку и разрушать ультразвуком в течение 15 мин.
      3. Слейте этанол путем декантации и ополаскивают покровных стеклах с ультра-чистой водой несколько раз. После заливки от ультра-чистой воды декантацией, повторите шаг 3.1.1.2.
      4. Добавить ультра-чистую воду в банку и разрушать ультразвуком в течение 15 мин. Промыть покровных стеклах с ультра-чистой воды в несколько раз, Выньте крышку ускользает из кувшина с помощью пластиковых пинцеты и высушить их либо сухим воздухом или сухим азотом.
   2. Приготовление образцов полимерного расплава ^14,15
      1. Добавьте 100 мкл немеченого линейного поли (ТГФ) в стеклянной бутылке и нагреть его до температуры выше точки плавления (приблизительно 25 ° C) с помощью фена.
      2. Развести флуорофора внедренной полимер (линейный, 4-вооруженных звезду, циклический или 8-образную дициклическую , синтезированный в 2,1 и 2,2) в хлороформе (1 мл, 10 ^-6 М). Добавляют 1 мкл раствора к 100 мкл расплава немеченого линейного поли (ТГФ).
      3. После тщательного перемешивания образца с наконечником пипетки, испаряются хлороформа путем нагревания образца с использованием сушилки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает расплав немеченого линейного поли (ТГФ) , содержащего 10 ^-8 М флуорофора включены полимеров.
      4. Возьмите 10 мкл образца с использованием микро-пипетки и дROP его на очищенную покровным. Другими очищенную крышку скольжения на образце и сэндвич образца между двумя покровных стеклах.
      5. Нажмите пробу осторожно с помощью пластикового пинцета.
2. Установка ¹⁵ флуоресцентных изображений Широкое поле
   1. Внедрение лазера возбуждения (488 нм) в задний порт инверсионного микроскопа
      1. Вставьте полосовой фильтр возбуждения и поляризатор в пути луча.
      2. Разверните луч приблизительно 1 см в диаметре с помощью расширителя пучка.
      3. Вставьте четвертьволновой пластины в пути луча. Установить оптическую ось волновой пластины на 45 градусов по отношению к этому поляризатора. В качестве альтернативы, вставить компенсатор Berek и установить оптическую задержку Л / 4.
      4. Вставьте диафрагму в пути луча возбуждения для регулировки размера пучка.
      5. Перед введением лазерного луча в задний порт инвертированного оптического microscoPE, вставить фокусирующую линзу (план-выпуклой линзы, фокусное расстояние ≈ 300 мм) в положении, где коллимируется лазерный луч из объектива.
   2. После того, как отражении лазерного луча с помощью дихроичного зеркала , установленного на светофильтров, вводится лазерный луч на образец через высокой числовой апертурой (NA) линзы объектива (например, Н. А. 1,3, увеличение в 100 раз, масло погружения).
   3. Приложить объективный нагреватель для объектива и установить температуру до 30 ° С.
   4. Монтаж стенда на предметный столик инверсионного микроскопа
      1. Отбросьте одну каплю иммерсионного масла на объектив и крепление образца на состояние микроскопа.
      2. Убедитесь, что толщина образца приблизительно 10 мкм получают путем проверки осевого положения нижней и верхней поверхности образца.
      3. Отрегулируйте фокусировку микроскопа до нескольких микрометров выше нижней поверхности образца.
      Получить циркулярно поляризованный свет возбуждения под объективом
      1. Вставьте поляризатор в коллимированный лазерный луч из объектива.
      2. Записывают интенсивности лазерного пучка, прошедшего через поляризатор, вставив измеритель мощности после поляризатора. Записывают, передаваемую мощность лазера под разными углами поляризации при вращении поляризатора.
      3. Если переданная мощность лазера не постоянна на всех углах поляризации, слегка вращать пластину четверти волны или Berek компенсатор, вставленный в пути пучка возбуждения.
      4. Повторите шаг 3.2.5.2 и 3.2.5.3 до постоянной передаваемой мощности лазера получается при всех углах поляризации. Убедитесь в том, что циркулярно поляризованный свет получается на образце.
   5. Установка ЭМ (электронного умножителя) отрицательный заряд связью (ПЗС) камеры
      1. Установите камеру EM-CCD с боковой порт микроскопа и подключить его к тон программное обеспечение захвата изображений.
      2. При необходимости синхронизации экспозиции камеры с механическим затвором или акустооптического перестраиваемого фильтра, вставленного в пути луча возбуждения, послав транзисторно-транзисторной логики (TTL) сигналы, генерируемые EM-CCD камеры к устройствам. В качестве альтернативы, синхронизировать экспозицию камеры на выходе лазера, посылая сигналы TTL, генерируемых ЭМ-ПЗС-камеры лазера.
         Примечание: Последний вариант применим только тогда, когда твердотельный лазер, выходная мощность может быть модулируется входным транзисторно-транзисторной логики сигналы (TTL) используется для эксперимента.
      3. Нанести усиление ЭМ (как правило, приблизительно 300) к ПЗС-камеры с помощью программного обеспечения управления камерой, чтобы получить флуоресцентного высокого качества изображения одного флуорофора.
      4. Установить область интереса (ROI) (как правило, 128 х 128 пикселей в центре поля зрения) с использованием программного обеспечения управления камерой.
         Примечание: Это позволяет томографовнг эксперименты на частоты кадров 100 - 200 Гц в режиме передачи кадров, который необходим для визуализации движения Флуорофор внедренной полимерных цепей в образце расплава.
3. Запуск эксперимента
   1. Оптимизация условий эксперимента
      1. Настройка области освещения образца до приблизительно 20 мкм в диаметре, используя диафрагму, вставленный в пути пучка возбуждения.
      2. Установка лазерного возбуждения мощности на образце до 4 - 8 мВт вручную, выбирая соответствующую нейтральной плотности (ND) фильтр, вставленный в пути пучка возбуждения.
         Примечание: Это обеспечивает среднюю мощность лазера 1 - 2 кВт · см ^-2 в образце.
      3. Запись флуоресцентные изображения образца при частоте кадров 100 - 200 Гц. Если интенсивность флуоресценции получены из отдельных флуорофором включены полимеров является слишком низкой, постепенно увеличивать мощность возбуждения с использованием юе ND фильтр до достижения примерно 100 мВт на образце.
      4. Если качество флуоресцентного изображения одной молекулы до сих пор не является удовлетворительным, проверьте примеси флуоресценции в образце путем регистрации флуоресценции изображения чистого расплава немеченого поли (ТГФ). В случае наблюдается высокий уровень фона флуоресценции, используют различные немеченого поли (ТГФ).
      5. Если плотность пятна флуоресценции, полученной из Флуорофор внедренной полимеров в расплаве слишком велико, чтобы пространственно изолировать их (это приводит к ошибкам в анализе диффузионного движения), снижение концентрации флуорофора внедренной полимеров в образце до пространственно наблюдаются единичные пятна.
      6. Если плотность пятна флуоресценции, полученной из Флуорофор внедренной полимеров в расплаве слишком низкое (это приводит к низкой пропускной способности эксперимента изображений), не увеличивают концентрацию Флуорофор внедренной полимеров в образце до достижения approprIate плотность пятна флуоресценции достигается.
      7. Если Флуоресцентные изображения, полученные из Флуорофор внедренной полимеров в расплаве размыты, увеличивают частоту кадров приобретения изображений.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это часто требует меньшего ROI, как правило, 64 х 64 пикселей.
4. получение изображений
   1. После того, как условия эксперимента оптимизированы, оставьте установленный образец на предметный столик микроскопа в течение часа таким образом, что образец достигает условий равновесия.
   2. Запись 500 - 1000 последовательности флуоресцентного изображения флуорофора внедренной полимеров в расплавленном состоянии при 100 - 200 Гц частотой кадров. Если формат файла по умолчанию не TIFF, конвертировать все последовательности изображений в формате TIFF.

4. Анализ диффузионного движения

1. Среднеквадратичное смещение (MSD) анализ
   1. Обрезка последовательности флуоресцентного изображения таким образом,что каждая последовательность изображений содержит одну и целенаправленный рассеивающий флуорофора внедренной полимера с использованием программного обеспечения для обработки изображений, например ImageJ.
   2. Когда вырезанный последовательности изображений содержат более 10 кадров, разделить последовательности изображений на множество последовательностей таким образом, что каждая последовательность состоит из 10 кадров.
   3. Определить положение молекул в каждой последовательности изображений точно двумерной гауссовой подгонки изображений.
   4. Определить коэффициент диффузии (D) отдельных молекул среднеквадратичного смещения (MSD) анализ диффузионных траекторий (т.е. зависящих от времени положениях молекулы) , используя уравнение ²⁰
      
      где х _я и у _меня есть позиции молекулы в изображении кадра I, а п обозначает номер кадра с промежутком времени & Delta ; t от кадра I.
   5. Участок коэффициентов диффузии вчастота гистограммы.
      Примечание: Как правило, гистограмма строится из более чем 100 молекул.
2. Интегральная функция распределения (CDF) анализ
   ПРИМЕЧАНИЕ: CDF, Р (г ^2, я Δ T) соответствует кумулятивной вероятности нахождения диффундирующих молекул в пределах радиуса г от начала координат по истечении определенного времени запаздывания я Д т.
   1. Вычислить квадратным смещение во время встречающийся отстает от 1Δt, 2Δt, ···, iΔt для всех диффузионных траекторий, полученных в п.4.1.3.
      Примечание: Эти расчеты дают общую м _я квадратным перемещений на некоторое время отстает от iΔt.
   2. Расчет чисел квадратным смещений (L _I) в пределах общего набора данных м _я, которые меньше , чем R ² при различных значениях г ² (0 я против г ² участки соответствуют CDF, P (R ^2, iΔt).
3. Анализ CDFs с различными моделями диффузии
   Примечание: Полученные CDFs обтянуты различных моделей диффузии; однородная модель диффузии, несколько режимов диффузии , в которых распределение D описывается гауссовым (одной гауссовой модели), а также несколько режимов диффузии , в которых распределение D описывается множественной Gaussian (множественный гауссова модель).
   1. В однородной модели диффузии, определяют средний D путем установки CDF с помощью уравнения ²¹
      
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любое отклонение от уравнения означает гетерогенную диффузии молекулы.
   2. В одной гауссовой модели, определяют распределение вероятностей D описывается гауссовым (F (D)) путем подгонки CDF с использованием ¹⁵
      on3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54503 / 54503equation3.jpg "/>
      
      где A, W, и D ₀ являются амплитуда, ширина, и центром гауссовой.
   3. В двойной гауссовой модели, определяют распределение вероятностей J - ^й компонент D описывается гауссовым (F (D)) путем установки CDF с помощью ¹⁴
      
      
      где А _J представляет собой долю каждого компонента диффузионной и α _{мкВт дж} и D _{0 J} являются амплитуда, ширина, и центром J - ^й компонент гауссовой.
4. Расчет теоретической вероятности DISTRIпределение коэффициента диффузии
   Примечание: распределения вероятности D , происходящих из - за статистических ошибок (р (D) d D) рассчитываются для различных моделей диффузии; однородная модель диффузии, несколько режимов диффузии , в которых распределение D описывается гауссовым (одной гауссовой модели), а также несколько режимов диффузии , в которых распределение D описывается множественной Gaussian (множественный гауссова модель).
   1. В однородной модели диффузии вычислить статистическое распределение вероятностей D с помощью уравнения ²²
      
      где N есть число точек данных в диффузионной траектории (N = 10 см 4.1.2), D ₀ средний коэффициент диффузии (определяется анализом КОР, см 4.2.3.1) и D является экспериментальным путем коэффициент диффузии для индивидуальной траектории.
   2. вединая гауссова модель диффузии, вычислить статистическое распределение вероятностей D с помощью уравнения ¹⁵
      
      где F (D) обозначает распределение вероятностей D определяется с помощью анализа КОР (см 4.2.3.2) и D ₀ средний коэффициент диффузии (определяется анализом КОР, см 4.2.3.2).
   3. В двойной гауссовой модели диффузии, вычислить статистическое распределение вероятностей D с помощью уравнения ¹⁴
      
      где F (D _J) обозначает распределение вероятностей J - ^го компонента D (D) _J определяется анализом КОР (см 4.2.3.3) и D _0j является средний коэффициент диффузии J - ^го компонента (определяется CDF анализ см 4.2.3.3).

Results

Периленовой диимид внедренной 4-вооруженную звезду и 8-образную форму двухцикличный поли (ТГФ) s были синтезированы с использованием электростатического самосборки и ковалентной фиксации (ESA-CF) процесса (Рисунок 1, Рисунок 2). В заданный промежуток времени одной молекулы флуоресцентного изображения были измерены для 4-вооруженных (рисунок 3а) и 8-образную форму (рис 3b) полимеры. В замедленной флуоресценции изображения...

Discussion

В 4- х вооруженных и 8-образные полимеры получают по протоколу ESA-CF (Рисунок 1), что является важным шагом для синтеза. ^12,24 Монофункциональное и бифункциональный линейный поли (ТГФ) s с N -phenylpiperidinium концевыми группами были синтезировали в соответствии с предыдущей процедуре. ¹¹ ионный обмен осуществляли путем повторного осаждения ацетонового раствора предшественника полимера с трифлат противоионами в водном растворе , содержащем избыточное количество карбоново...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
THF	Godo
Wakosil C-300	Wako Pure Chemical Industries
Ацетон	Godo
Toluole	Godo
n-Hexane	Godo
CHCl3	Kanto Chemical Bio-Beads
S-X1	Bio-Rad
Метилтрифлат	Nacalai Tesque
Triflic Anhydride	Nacalai Tesque
Potassium Hydroxide	Wako Pure Chemical Industries Этанол
	Wako Pure Chemical Industries
Poly( тетрагидрофуран)	Олдрич
Хлороформ	Wako Pure Chemical Industries
Погружное масло	Cargille	Тип 37 / Тип A
Equipment
2-Neck 100-мл круглодонная колба
Стакан
Воронка
Фильтровальная	бумага Ватман
Дефлегматор Конденсатор
Шприц
Водяная баня
Магнитная мешалка
Ротационный испаритель
Микроскоп чехлы крышки (24 x 24 мм, No 1)	Мацунами Стекло	CO22241
Банка для окрашивания	AS ONE Corporation	1-7934-01
Ультразвуковой очиститель	VWR International	142-0047
Инвертированный микроскоп	Olympus	IX71
Ar-Kr ионный лазер	Coherent	Innova 70C
Компенсатор Berek	Newport	5540
Фильтр возбуждения	Semrock	LL01-488-12.5
Дихлорное зеркало	Omega оптический	500DRLP
Фильтр излучения	Semrock	BLP01-488R-25
Объектив и зеркало	Thorlabs
EM-CCD камера	Andor Technology	iXon
Объектив (100X, N.A. = 1.3)	Olympus	UPLFLN 100XOP
Обогреватель	объектива Bioptechs Препаративный
GPC	Япония Аналитическая промышленность	LC-908