В следующем отчете описывается, как воспроизвести модель неартериальной передней ишемической оптической нейропатии (rNAION) у грызунов, используя соответствующие параметры красителя, контактных линз и лазера. Мы также раскрываем соответствующие шаги для оценки поражения rNAION in vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Грызун Модель Nonarteritic ишемическая оптическая нейропатия передняя (rNAION)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Неартериальная передняя ишемическая нейропатия зрительного нерва (NAION) — это очаговое ишемическое поражение зрительного нерва, которое поражает 1/700 человек на протяжении всей жизни. NAION приводит к отеку зрительного нерва, избирательной потере нейронов ганглиозных клеток сетчатки (РГК) и атрофии зрительного нерва. Была разработана модель NAION у грызунов, которая выражает большинство особенностей и последствий NAION, применимая как к крысам, так и к мышам. В этой модели используется фокальный лазер с длиной волны 532 нм для освещения фотоактивного красителя Rose Bengal (RB), вызывающего повреждение капилляров и утечку в целевом переднем зрительном нерве (ламинарной области). После индукции rNAION наблюдается ранняя ишемия зрительного нерва, отек зрительного нерва и внутриневральное воспаление с последующей селективной РГК и потерей аксонов. Поскольку зрительный нерв является трактом белого вещества ЦНС, модель rNAION применима для механистических исследований селективной ишемии белого вещества, а также для нейропротекторного анализа и краткосрочных и долгосрочных механизмов глиального и нейронального ответа на ишемию.
Введение
Nonarteritic передней ишемической оптической невропатии (NAION) является координационным ишемическое поражение передней части зрительного нерва (ON) 1. NAION является наиболее частой причиной внезапной зрительного связанных нерва потери зрения у людей в возрасте старше 50 лет 2. Механизм считается синдром отсека , что приводит к интраневрального отека, и вызывает сжатие капилляров , снабжающих аксоны в пределах зрительного нерва 3.
Поскольку ПО на самом деле является центральной нервной системы (ЦНС) тракта, грызун NAION модель (rNAION) может быть использован для изучения механизмов и ответы на изолированных ударов белого вещества ЦНС. Таким образом, модель rNAION может быть полезным в рассекает множество проблем, связанных с инсультом, связанных с повреждением белого вещества. Он может быть использован для оценки различных нейропротекторное стратегий и агентов в белой материи инсульта.
Одним из наиболее привлекательных особенностей модели является то, что онабезболезненный, неинвазивный процедура. Мощность лазера можно регулировать для получения различной степени ишемического повреждения. Еще одной особенностью является то, что она опирается на лазерных индуцированных супероксидных радикалов повредить эндотелий капилляров, производя прогрессивную капиллярную дисфункцию. Именно эта дисфункция и прогрессирующий отек, который, как полагают, в высшей степени сходен с механизмом, который вызывает NAION. Исследования показали , что он не вызывает прямой капиллярный свертываемость, но работает по крайней мере , двух механизмов: супероксид - индуцированной гибели и зачистке некоторых из клеток эндотелия капилляров 4, и NFkB (ядерного фактора каппа-легкой цепи-энхансер активированных В - клеток ) , связанный воспалительный вверх регулирование в оставшихся эндотелием, с увеличенным перенос жидкости через клеточные мембраны в интерстиции 5. Закрытие зрительного нерва капилляров и сжатие, вызванные интерстициальной результате накопления жидкости в глазного нерва ишемии. Схематическое изображение отображается вРисунок 2. Модель rNAION может быть использован в обоих крыс и мышей вида 6,7, и может варьироваться в уровне его серьезности, от мягкого поражения до полной, но безболезненное разрушение зрительного нерва и сетчатки, такие в качестве центральной окклюзии артерии сетчатки (КрАО).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол был утвержден в Университете штата Мэриленд Уходу за животными и Комитетом по использованию (IACUC; Балтимор, штат Мэриленд, США)
1. Экспериментальная установка
- Сделать заказ разработан контактные линзы из прозрачного оптического качества круговой диаметром 7 мм, оргстекло толщиной 3 мм. Вырезать круглые линзы с сверлильный станок. С помощью стандартного бурового долота, чтобы сделать внутреннюю кривую, и, наконец, полируют внешние и внутренние кривые, используя контактные линзы полировальный ультрадисперсного зернистости (1000/3000).
- Приготовьте 2,5 мМ бенгалроза (RB) в рН 7,4 фосфатного буферного солевого раствора (PBS) заранее, фильтр стерилизуют с шприцевой фильтр 0,45 микрон и хранить 1 мл аликвоты в -20 ° C в светонепроницаемый контейнер на срок до 6 месяцев.
Примечание: Использование альбиносов беспородных самцов животных, таких как Sprague Dawley минимизирует зависимые различия отклика деформации, позволяет в более легкой индукции и снижает изменчивость, которая может произойти с течки cycliнг женского пола. - Настройка частоты в два раза неодима-иттрий-алюминиевого граната (Fd-YAG) офтальмологической медицинский лазер, который генерирует лазерное излучение 532 нм. Установите лазер на Haag-Streit офтальмологической щелевой лампы с использованием стандартного офтальмологического лазера адаптер. Это коммерчески доступное устройство обеспечивает одновременную визуализацию глаз и лазерного применения пятна животного. Медицинский лазер также имеет прицельную луч для надлежащей фокусировки и центровка, используя тот же размер пятна, как лазерной индукции. Параметры мощности лазера следующим образом:
- Для индукции rNAION крыс: использовать 500 мкм Размер пятна / 50 мВт мощности лазера / 1000 мсек / 1000 мс интервал.
- Для мыши индукции rNAION: изменить размер пятна до 300 мкм для небольших диска зрительного нерва и оставить другие параметры так же, как настройки крысы.
- Повседневно используют измеритель мощности лазера для обеспечения выходной мощности лазера.
2. Методика экспериментальной
- Включите мощности лазераи установить соответствующий параметр лазера. Подогреть лазер по крайней мере пять минут перед использованием.
- Взвешивание животных, чтобы определить соответствующую дозу для кетамина / ксилазина и RB красителем. Обезболить животное путем внутрибрюшинной инъекции 1 мл / кг смеси 80 мг / мл кетамина и 4 мг / мл ксилазина.
- Оставьте животное в отапливаемом клетке до полного наркозом. Проверьте отсутствие ответа на аверсивных раздражители (хвост или ноги ущемление). Проверьте животных для глубины анестезии каждые 10 мин.
- Разбавить зрачки животного с 1% тропикамид и анестезию поверхности глаза с 0,5% пропаракаина. При использовании пигментных животных, таких как Лонг-Эванс, 2,5% neosynephrine глазные капли будет увеличиваться расширение зрачков.
- Используйте ножницы, чтобы вырезать усики близко к морде на стороне, чтобы быть вызван, чтобы избежать блокирования зрения.
- Поместите каплю 1% метилцеллюлозы или другого капли офтальмологических муфты к внутренней стороне заказных контактных линз, а затем применить линзу на тон крысиных глаз.
- Место животное на платформе, скорректированной на высоту щелевой лампы. Установить голову животного под углом 45 ° таким образом, что глаз перпендикулярно щелевой лампы и лазерный луч.
- Визуализируйте глаз через офтальмологической щелевой лампы. Убедитесь, что направляющий луч нужного размера, а также сосредоточены и сосредоточены непосредственно на визуализируется зрительного нерва. Сфотографировать глазного дна сетчатки глаза с помощью цифровой камеры с высокой ASA (1200 - 2000) скорости, установленной на одном из глаз кусочков щелевой лампы с выполненный на заказ адаптера.
Примечание: Способность видеть хориоидального судов показывает прозрачность сетчатки. Это очень важный признак для того, чтобы иметь возможность обнаружить позже ишемия сетчатки, которая может запутать интерпретацию, если оно имеет место. rNAION является зрительного нерва ишемия, что приводит к потере изолированной RGC, в то время как результаты ретинальные ишемией повреждения сетчатки затрагивая все клетки внутренних слоев сетчатки. - По желанию, дополнительно изображение сетчатки глаза изрительного нерва с использованием спектрального домена-оптической когерентной томограф (SD-OCT 8) , чтобы оценить неразделанный индуцированный глаз. Сканирование в фас (рис 3б), а также 7 сканов в поперечном сечении сетчатки (рис 3C). SD-Октябре изображения использует тот же контактные линзы, используемый для лазерной индукции.
- Вводят 1 мл / кг внутривенно RB через хвостовую вену, и ждать в течение 30 секунд, а затем активировать мощность лазера. Эта задержка позволяет RB распределить равномерно по всей циркуляции. Мы используем 50 мВт лазерный импульс длительностью в один сек / импульс. Большие энергии (≥ 60 мВт) может привести к повреждению сетчатки глаза или вызвать ишемию сосудов сетчатки.
Внимание: Убедитесь , что каждый имеет пару фильтровальных лазерной безопасности стекол соответствующей длины волны блокировки для предотвращения паразитной лазерного света , попадающего глаз исследователя.
Примечание: Администрация лазера должна быть быстро передан после инъекции IV RB, так как краситель быстро выводится из обращения, Чем дольше лазерная индукция, тем сильнее зрительного нерва ишемия. Как правило, животные дают 7 - 12 сек импульсы в быстрой последовательности. Контакта лазерного излучения с циркулирующим красителем дает зрительный нерв сосуды красивый золотистый блеск , который можно увидеть через щелевой лампы (рис 4В). Это доказывает, краситель вводили системно и распределяется в поток крови. Если свечение слабое, или вообще без него (рис 4А), краситель не вводили внутривенно. В этом случае, не дают вторую инъекцию немедленно, так как животное необходимо будет восстанавливаться в течение по крайней мере за два дня до реинжекцией. - Сразу же после индукции, снимите контактные линзы. Накройте оба глаза с офтальмологической тройной антибиотик (Neosporin / полимиксин / бацитрацинового) мазь с дексаметазона, и поместить животное на разогреве площадку 37 ° C в одной клетке размещались под пристальным наблюдением до полного выздоровления.
- Очистите контактную линзу с дистиллированной жАтера и вытереть насухо с неабразивным чистящей тканью для использования в будущем.
- Через два дня после индукции оценки зрительного нерва отек обоими фундус цветной фотографии и SD-OCT анализа 8.
Примечание: Если сравнить степень зрительного нерва отека дает оценку тяжести зрительного нерва ишемии. В течение двух дней, зрительный нерв запас диска размыты, а вены сетчатки слегка расширены по сравнению с контралатеральной (ООН-индуцированный) глаз. Выполните электроретинография (ЭРГ) и вспышки визуально вызванного потенциала (ВЭП 11) на две и четыре недели после индукции для анализа электрофизиологии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Включена контактная линза центральной визуализации сетчатки глаза (Рисунок 1). Фокусное пятно лазера освещает оптический диск на задней части сетчатки (рисунок 2). Нормальная ун-индуцированной Сетчатка показана изображается с помощью щелевой лампы био-микроскоп (рис 3A) и SD-OCT (рис 3B и 3C). Во время лазерной индукции, когда краска не присутствует в кровотоке, лазерный свет не приводит к емкости и дисковой флюоре...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя существует целый ряд моделей повреждения зрительного нерва (зрительный нерв давки 12, зрительного нерва рассечение 13, и пион 14), модель rNAION гуманно, адаптируемой к обоим крыс и мышей. Это более близко напоминает человеческое клиническое состояние NAION. Это условие включает в себя прогрессивной передней зрительного нерва, отек Синдром передней зрительного нерва отсека, фокусное аксонов ишемию, изолированных сетчатки ганглий клеток аксонов повреждения и потери в течение длительн...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим многие студенты и ребята, которые работали на этой модели, чтобы повысить ее эффективность, и понять ее механизмы. Особая благодарность д-ру х. Мэри Джонсон (Университет штата Мэриленд-Балтимор), Nitza Гольденберг-Коэн (Шнейдерман Детская больница, Петах-Тиква, Израиль), Чарльз Чжан (Эйнштейн медицинский колледж, Бронкс, Нью-Йорк), и Валери Touitou (Hopital Salpetrie, Париж, Франция). Это исследование было частично финансируется RO1 EY015304 к SLB.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 50 мВт 532 нм лазер | Iridex | Стандартный офтальмологический лазер | |
| 0 - 100 мВт 532 нм лазер | Технологии | Заменитель iridex | |
| Адаптер для лазерной лампы | Iridex | SMA сопряженный адаптер для лазерного выхода | |
| Coherent Fieldmate лазерный измеритель с термоскопом | Когерентные | другие также подходят | |
| Офтальмологический смотровой биомикроскоп с щелевой лампой | Various | Haag-Streit является лучшим; более дешевые версии доступны на ebay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Фотоиндуцирующее средство |
| Fundus Контактная линза или стеклянная крышка слип | custom/Cantor and Nissel (Великобритания) | Специально разработанная плосковыпуклая пластиковая линза для осмотра глаз и индукции | |
| Тропикамид 1% | |||
| Tamiya полировальный состав | Tamiya, INC | 87068 | полировка контактных линз |
| 2,5% Гипромеллоза (Гониовисц)/1% Метицеллюлоза | HUB Pharmaceuticals | средство для соединения контактных линз | |
| 2,5% Неосинефрин Офтальмальные капли | Alcon labs | для расширения зрачков | |
| Тропикамид 1% | Alcon labs | средство для расширения зрачков | |
| 0,5% Пропаракаин | Alcon labs | топический Анестетик | |
| 30 г игла инсулиновый шприц | Различное | Различное | для внутривенного введения розовой бенгалии |
| Офтамическая антибиотическая мазь с добавлением дексаметазона (Тройная антибиотическая мазь) | Различное | Различное | Применять после индукции для минимизации рубцевания роговицы |
| Гейдельбергская корпорация Спектральный домен-Оптический когерентный томограф | Гейдельберг Корпорация | по измерениям оптической когерентности на базовом уровне и после индукции; не является существенным для индукции |
Ссылки
- Banik, R. Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy: An Update on Demographics, Clinical Presentation, Pathophysiology, Animal Models, Prognosis, and Treatment. J. Clin. Experimental Ophthalmol. 10, 1-5 (2013).
- IONDT study group. Characteristics of patients with nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy eligible for the Ischemic Optic Neuropathy Decompression Trial. Arch Ophthalmol. 114, 1366-1374 (1996).
- Tesser, R. A., Niendorf, E. R., Levin, L. A. The morphology of an infarct in nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Ophthalmology. 110, 2031-2035 (2003).
- Bernstein, S. L., Johnson, M. A., Miller, N. R. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) and its experimental models. Prog Retin Eye Res. 30, 167-187 (2011).
- Nicholson, J. D., et al. PGJ2 Provides Prolonged CNS Stroke Protection by Reducing White Matter Edema. PLoS One. 7 (12), (2012).
- Goldenberg-Cohen, N., et al. Oligodendrocyte Dysfunction Following Induction of Experimental Anterior Optic Nerve Ischemia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 2716-2725 (2005).
- Bernstein, S. L., Guo, Y., Kelman, S. E., Flower, R. W., Johnson, M. A. Functional and cellular responses in a novel rodent model of anterior ischemic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 4153-4162 (2003).
- Berger, A., et al. Spectral-Domain Optical Coherence Tomography of the Rodent Eye: Highlighting Layers of the Outer Retina Using Signal Averaging and Comparison with Histology. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Huang, T. L., et al. Protective effects of systemic treatment with methylprednisolone in a rodent model of non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION). Exp Eye Res. 131, 69-76 (2015).
- Mantopoulos, D., et al. An Experimental Model of Optic Nerve Head Injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, 6222(2014).
- You, Y., et al. Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination. J. Vis. Exp. (101), e52934(2015).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System. J Vis Exp. (51), e2241(2011).
- Wang, Y., et al. A Novel Rodent Model of Posterior Ischemic Optic Neuropathy. JAMA Ophthalmol. 131 (2), 194-204 (2013).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Chang, S. W., Lin, K. H., Tsai, R. K. Efficacy of Intravitreal Injections of Antivascular Endothelial Growth Factor Agents in a Rat Model of Anterior Ischemic Optic Neuropathy. IOVS. 56, 2290-2296 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
