Методическая статья

Углубленный Физиологический анализ клеточных популяций Defined при остром Tissue Ломтики Мыши вомероназальные органа

DOI:

10.3791/54517

⸱

10 сентября 2016 г.

 ,  , 
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II, RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем физиологический подход, который позволяет идентифицировать и глубоко анализировать определенную популяцию сенсорных нейронов в срезах острой корональной ткани вомероназального органа мыши с использованием записей целых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У большинства млекопитающих вомероназальный орган (VNO) представляет собой хемосенсорную структуру, которая обнаруживает как гетеро-, так и конвидифедиальные социальные сигналы. Вомероназальные сенсорные нейроны (VSN) экспрессируют определенный тип рецептора, связанного с G-белком (GPCR), по крайней мере, из трех различных семейств генов хеморецепторов, что позволяет обнаруживать чувствительные и специфичные хемосенсорные сигналы. Эти семейства включают в себя семейства генов V1r и V2r, а также семейство предполагаемых генов хеморецепторов, связанных с формильным пептидным рецептором (FPR) (Fpr-rs). Чтобы понять физиологию вомероназальных рецептор-лигандных взаимодействий и нисходящей сигнализации, важно определить биофизические свойства, присущие каждому конкретному классу VSN.

Описанный здесь физиологический подход позволяет идентифицировать и глубоко анализировать определенную популяцию сенсорных нейронов с использованием трансгенной линии мыши (Fpr-rs3-i-Venus). Использование этого протокола, однако, не ограничивается этой конкретной линией и, таким образом, может быть легко распространено на другие генетически модифицированные линии или диких животных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство животных в значительной степени зависят от их химических чувств, чтобы взаимодействовать с окружающей средой. Обоняние играет существенную роль в поиске и оценке пищи, избегая хищников и поиск подходящих брачных партнеров. У большинства млекопитающих, обонятельная система состоит из по меньшей мере четырех анатомически и функционально различных периферийных подсистем: основной обонятельный эпителий 1,2, в Грюнеберг ганглии 3,4, септального органа MASERA 5,6 и вомероназального органа. ВНО включает периферическую сенсорную структуру вспомогательной обонятельной системы (АОС), которая играет важную роль в выявлении химические сигналы , которые передают информацию о личности, пола, социального положения и сексуального состояния 7-10. ВНО расположен у основания носовой перегородки, прямо над неба. У мышей, это двусторонний слеп окончание трубки , заключенный в хрящевую капсулу 11-13. Орган состоит как серповидным медиальной сенсорной epitheлиево, что таит в VSNs и не-сенсорной части на боковой стороне. Между обоими эпителий лежит слизистая заполненный просвет , который соединен с носовой полостью через узкий сошниково трубопровод 14. Большой боковой кровеносный сосуд в несенсорных ткани обеспечивает сосудистый насосный механизм для облегчения ввода относительно крупных, в основном нелетучих молекул , таких как пептиды или небольшие белки в просвет ВНО через отрицательное давление 15,16. Структурные компоненты ВНО присутствуют при рождении и орган достигает взрослого размера незадолго до полового созревания 17. Тем не менее, является ли грызун AOS уже функционирующий в несовершеннолетних все еще ​​является предметом для обсуждения 18-20.

VSNs отличаются как их эпителиальной местоположения и типа рецепторов они выражают. VSNs показывают биполярную морфологию с немиелинизированных аксона и одного верхушечного дендрита, который выступает в направлении просвета и заканчивается в microvillous дендритных ручки. ВСН топорДополнения , чтобы сформировать расположенный пучком вомероназальный нерв , который покидает хрящевую капсулу в дорсо-каудального конца, восходит по перегородке, проходит решетчатой ​​пластины и проекты к вспомогательной обонятельной луковице (АОВ) 21,22. Вомероназального чувствующий эпителий состоит из двух слоев: верхушечный слой расположен ближе к стороне просвету и гаваней как V1R- и все, кроме одного типа РСП-RS-экспрессирующих нейронов. Эти нейроны coexpress G-белок α-субъединицы G αi2 и проект в передней части АОБ 23-25. Чувствительные нейроны , расположенные в более базального слоя экспресс V2Rs или РСП-RS1 наряду с G αo и отправить свои аксоны в задней области АОБ 26-28.

Вомероназальные нейроны, вероятно , активируются сравнительно небольшими semiochemicals 29-33 (V1Rs) или белковыми соединениями 34-38 (V2Rs), которые секретируются в различных телесных жидкостей , таких как моча, слюна и слезной жидкости 37,39-41 . В экспериментов на месте показали , что VSNs также активируются формилируют пептидов и различных антимикробных / воспаление-сшитый соединений 25,42. Кроме того, гетерологично выразили FPR-RS белки имеют агонистических спектры с FPRs выраженными в иммунной системе, что указывает на потенциальную роль в качестве детекторов для болезни в конспецификов или испорченными источников пищи 25 (см ссылку 43).

Фундаментальный для понимания рецептор-лиганд отношения и вниз по течению сигнальных каскадов в конкретных группах населения ВСН является детальная оценка их основных биофизических характеристик в родной среде. В прошлом, анализ клеточной сигнализации значительно извлек выгоду из генетически модифицированных животных , которые отмечают определенную популяцию нейронов путем совместной экспрессии флуоресцентного белка в качестве маркера 30,44-49. В этом протоколе, трансгенная линия мышь, которая выражает FPR-RS3 вместе с флуоресцентным маркером (FPR-RS3-я-Венера) используется.Такой подход иллюстрирует, как использовать такой генетически модифицированный штамм мыши, чтобы выполнить электрофизиологических анализ оптически идентифицируемой популяции клеток с использованием одного нейрона записи патч-зажим в острых корональных срезов ткани ВНО. Воздуха под давлением управляемый мульти-ствольной системы перфузии для сенсорных стимулов и фармакологических агентов позволяет быстро, обратимо и фокусного нейронную стимуляцию или торможение во время записи. записи цельноклеточная в срезами препаратов позволяют детальный анализ внутренних свойств, проводимостей напряжения активированные, а также действий потенциальных моделей разряда в родной среде клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных были в соответствии с местным и Европейским Союзом законодательства о защите животных, используемых для экспериментальных целей (Директива 86/609 / EEC) и с рекомендациями, выдвинутое Европейской федерации лабораторных животных науки ассоциаций (FELASA). Оба мышей C57BL / 6 и у мышей Fpr-RS3-I-Венера были размещены в группах обоих полов при комнатной температуре на 12 ч цикле свет / темнота с пищей и водой , доступными по желанию. Для экспериментов были использованы молодые люди (6-20 недель) или другого пола. Не наблюдалось никаких явных гендерных различий зависит.

1. Получение раствора

  1. Готовят внеклеточный раствор S 1: 4- (2-гидрокси-этил) пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES) буферным внеклеточный раствор , содержащий (в мМ) 145 NaCl, 5 KCl, CaCl 2 , 1, 1 MgCl 2, 10 HEPES; рН = 7,3 (регулируют при добавлении NaOH); осмолярность = 300 мОсм (скорректированная с глюкозой).
  2. Подготовка extracelluLAR решение S 2: карбогена-окисленный (95% O 2, 5% СО 2) внеклеточный раствор , содержащий (в мМ) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, CaCl 2 , 1, 1 MgSO 4, 5 БЭС; рН = 7,3; осмолярность = 300 мОсм (скорректированная с глюкозой).
  3. Готовят 4% раствор температура агарозы с низкой желирующего (S 3) для вложения ткани: 4% низкой температуры желирующий агарозы. Растворить 2 г с низким желирующий агарозы в 50 мл S 1 в 100 мл стеклянный флакон вместе лаборатории с помощью магнитной мешалки. Для расплавления агарозы, поставил бутылку на водяной бане (с крышкой не плотно закрытой) при 70 ° С в течение приблизительно 20 мин, или пока раствор станет прозрачным при перемешивании. Охладить и держать расплавленную агарозу во второй водяной бане при температуре 42 ° С до дальнейшего использования.
  4. Приготовьте внутриклеточных решение S 4: Пипетка раствор , содержащий (в мМ) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl 2 (свободный Ca 2+ = 110 нМ), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;рН = 7,1 (регулируют при добавлении KOH); осмолярность = 290 мОсм.
  5. Изменить / отрегулировать состав S 1, S 2 и S 4 в соответствии с индивидуальной опытно - конструкторских (например, фармакологические блокаторы выделить определенные типы напряжения активируемых токов).

2. Подготовка рабочего пространства

  1. Заполните оксигенировать ломтик хранения камеры с S 2 , по меньшей мере за 30 мин до рассечения, место на льду для температуры и рН перестройки и кислородсодержащих соединений раствора непрерывно.
  2. Заполните резервуар для среза суперфузии при записи установки с S 2 и непрерывно оксигенации.
  3. Перед вскрытием, заполнить vibratome камеру с S 2 и организовать дробленый лед вокруг камеры. В качестве альтернативы, передача запасной лед холодный окисленный раствор из оксигенировать камеры в vibratome камеру и держать непрерывно оксигенировать.
  4. Упорядочить хирургические инструменты и расходные материалы.
  5. Поместите лед пакет геля под рассекаетмикроскоп, крышка с бумажным полотенцем, чтобы предотвратить ВНО ткани от замерзания до нижней части блюда.
  6. Чистый лезвие бритвы коротким полоскание в 70% этаноле и дистиллированной воды и смонтировать на vibratome. Заменить на каждой сессии нарезания.

3. ВНО Вскрытие и встраивание

  1. Жертвоприношение животных путем кратковременного воздействия СО 2 и обезглавить с помощью острых хирургических ножниц. Примечание: Поскольку время от ущерба животному положить капсулу VNO на льду имеет решающее значение, минимизировать время до менее чем за 2 мин. Для поддержания жизнеспособности тканей, встраивать как полностью расчленены ВНО в агарозе менее чем за 30 мин.
  2. Снимите нижнюю челюсть с большими хирургическими ножницами. Введите через полость рта и вырезать кости нижней челюсти и мышцы каждой из сторон по отдельности.
  3. Поместите оставшуюся часть головы с ног на голову в большую чашку Петри.
  4. Отодвигать кожу верхней челюсти и вокруг кончика носа со средними щипцами, чтобы получить более широкий доступ крезцы.
  5. Используйте кости ножницы , чтобы отрезать большую часть резцами при ~ 45 ° угол в ростральной направлении (рис 1А). Это облегчит удаление капсулы VNO из носовой полости.
    Примечание: Не обрезать до корня зуба, чтобы предотвратить повреждение кончика капсулы ВНО.
  6. Возьмите жесткую верхнего нёба на своей ростральной части со средними пинцетом и аккуратно отогните в одной части на плоском угле (рис 1B).
    Примечание: Несколько раз промыть охлажденной льдом S 2.
  7. С помощью микро пружинные ножницы, чтобы разрезать костную слияние между наконечником сошника кости и челюсти. Вставьте ножничные наконечники с изогнутой частью наконечника направлены наружу от ВНО и аккуратно вырезать кости небольшими шагами на левой и правой стороны сбоку по отношению к капсуле ВНО.
  8. Чтобы удалить капсулу ВНО, использовать микро пружинные ножницы, чтобы вырезать через сошника кости в хвостовой части и осторожно поднимите уотег кость из пASAL полости с использованием средних щипцов. Немедленно передать ВНО в небольшую чашку Петри под микроскопом стерео на упаковке льда геля, где будет выполняться остальные шаги рассечение.
  9. Промыть ВНО в небольшом количестве охлажденного льдом S 2 , чтобы предотвратить ткани от высыхания.
  10. Отдельные хрящевые капсулы, которые содержат мягкие ткани ВНО, захватывая заднюю часть сошника кости со средними щипцами. Поместите капсулу для спинной , так что раскол между обоими ВНО становится видимым (рис 1D я).
  11. Используйте кончик тонких щипцов для разделения обоих хрящу ВНО капсулы из центральной кости при сохранении сошника кости скована в задней части.
    Примечание: Используйте пинцет только на краю капсулы хряща и быть очень осторожным, чтобы не проколоть через хрящ, как хрупкое чувствующий эпителий легко повреждается.
  12. После того, как два ВНО разделены, начать удаление хрящей, инкапсулирующего пихтыт ВНО.
  13. Возьмите верхний край капсулы с одним тонким пинцетом и откололись хрящевой стенки, который ранее был прикреплен к уотег кости (медиальная сторона).
  14. Для того, чтобы удалить остатки хрящей превратить ВНО с изогнутой боковой стороной к нижней части блюда и надежно придавить хрящ на одной стороне с помощью щипцов. Аккуратно перенести второй тонкий пинцет с задней стороны при очень плоском углу между хрящом и VNO, чтобы ослабить соединение между тканью и хрящом.
  15. Медленно снимите ВНО от хряща, держа его на своем каудальном конце, чтобы избежать повреждения чувствительного эпителия.
  16. После того, как ВНО будет рычажная из капсулы, убедитесь, чтобы удалить все оставшиеся мелкие детали хрящей, как все оставшиеся кусочки хряща отделится ткани от окружающих агарозы в процессе нарезания.
  17. Поместите небольшую каплю ледяной S 2 на первом расчлененным ВНО , чтобы предотвратить повреждение тканей. Большой кровеносный сосуд на боковой стороне Вильл становятся видимыми указывая , что этот орган до сих пор нетронутыми и не был сильно поврежден во время рассечения (рис 2А II). В случае, если кровеносный сосуд получил повреждения, он по-прежнему будет целесообразно вести с нарезка ВНО тех пор, пока общая морфология не было явно нарушено.
  18. Немедленно рассекают второй ВНО.
  19. Чтобы встроить ВНО, заполнить как небольшие чашки Петри на ободе с растопленным S 3 (хранится в водяной бане при температуре 42 ° С, см 1.3).
  20. Держите ВНО на широком хвостового конца с тонким пинцетом, чтобы избежать повреждения чувствительного эпителия.
  21. Опустить VNO в агарозы и переместить его в горизонтальном направлении назад и вперед несколько раз, чтобы удалить пленку внеклеточном растворе, а также любые воздушные пузырьки с ее поверхности.
  22. Поместите ВНО вертикально с хвостовым наконечником, обращенной к нижней части блюда. Вместо того, чтобы щипать ВНО с пинцетом непосредственно, отрегулируйте ориентацию, перемещая кончик пинцетом в тесном Proximiти к ВНО.
    Примечание: Ориентация во вложении имеет решающее значение, поскольку он определяет плоскость среза и доступность сенсорных нейронов во время эксперимента.
  23. Поместите посуду на гелевой рукавицей и подождать, пока агароза не затвердеет.
    Примечание: Не изменяйте ВНО ориентацию, как только агарозы начал твердеть, так как это будет отделить ткани от окружающей агарозы.

4. Корональные ВНО ткани нарезка

  1. Используйте маленькую лопаточку, чтобы удалить агарозы блок с маленьким блюдом в крышке большую чашку Петри, перевернуть вверх дном агарозы оставляя хвостовую кончик ВНО вверх.
  2. Вырезать блок в пирамидальной формы с помощью хирургического скальпеля (3-4 мм на конце, 8-10 мм в нижней части). Будьте осторожны, чтобы не повредить внедренный ткани.
  3. Используйте супер клей, чтобы зафиксировать блок пирамидальной формы в центре vibratome образца пластины и подождите ~ 1 мин для клея, чтобы полностью высохнуть.
  4. Передача образца пластины к нарезания грHamber и подготовить вторую ВНО, соответственно. Удерживающую плиту со второго образца при температуре 4 ° С до использования.
  5. Используйте вибрирующие лезвия микротома со следующими параметрами: толщина: 150-200 мкм; Скорость: 3.5 а.е. = 0,15 мм / сек; частота: 7,5 а.е. = 75 Гц. Перенесите ломтики в Oxygenating камере до использования после краткого осмотра срезов морфологии под микроскопом рассекает. Ломтики может храниться в течение нескольких часов.

5. Одноклеточные Электрофизиологические Записи

  1. Для записей, используйте вертикальное фиксированной столик микроскопа оснащенную целей погружения в воду, Dodt или инфракрасного дифференциального мешая контраста (ИК-ДИК) и эпи-флуоресценции, а также охлаждаемой ПЗС-камеры. Для получения данных, используйте патч-зажим усилителя, этап головки, AD / DA платы интерфейса и ПК (в том числе программное обеспечение для записи).
  2. Подготовить запас 10-20 патч-пипеток (4-7 МОм). Напряжения Пипетки из боросиликатного стекла капилляров (1,50 мм OD / 0,86 мм ID) USINга микропипетка съемник и противопожарная польский с microforge.
    Примечание: Огонь полировки наконечников имеет решающее значение при обновлении сравнительно небольшие VSNs. Это поможет предотвратить разрывания клеточной мембраны при подаче отрицательного давления для того, чтобы получить высокую запечатывание. После того, как полирование отверстие пипетки должно быть приблизительно 1 мкм.
  3. Держите пипетки в банку для хранения пипеток, чтобы предотвратить повреждение и накопление пыли до использования.
  4. Подготовка системы перфузии путем заполнения резервуаров раствора и трубки в соответствии с экспериментальным дизайном.
    Примечание: Удалить пузырьки воздуха из трубки полностью, как они будут сильно мешать электрофизиологических записей.
  5. Отрегулировать давление для достижения ~ 3 мл / мин поток.
    Примечание: Высокое давление вызовет движение среза ткани, а также прекращение электрофизиологических записей.
  6. Передача ломтик ВНО в камеру формирования изображения и зафиксировать положение среза с помощью якоря из нержавеющей стальной проволокой с 0,1 мм толщиной Synthetic волокна (рис 2B - C).
    Примечание: Не закрывайте кусочек ткани с одним из синтетических нитей волокна, а скорее агарозы окружающий срез.
  7. Камера изображения Переход к записи установку и непрерывно переливать срез с окисленной S 2 при комнатной температуре с помощью приложения ванны.
  8. Отрегулировать всасывающую капилляр к поверхности раствора, чтобы создать медленное отсасывание для обеспечения постоянного обмена раствор бани. Отрегулируйте 8-в-1 мульти-бочка "перфузионного карандаш" выше и ближе к несенсорных части среза ВНО , который содержит кровеносные сосуды (рис 2С, 3А) 50. Это будет полезно организовать перфузионного карандаш и записи пипетку, чтобы быть лицом к ломоть с противоположных направлений.
  9. Подключение электрода и раствора ванны, используя L-образный мост агара (заполненный 150 мМ KCl).
  10. Заполните патч пипетки с пипеткой раствором S 4.
  11. Установите пипетку над серебряным хлоридом покрытием заплаты электрода, подключенного к стадии головки без соскабливания покрытия и прикрепить надежно.
  12. Нанесите небольшое положительное давление (приблизительно 1 мл в расчете на 10 мл пластмассовый шприц) на патч пипетки перед входом в ванну.
  13. Опустите пипетку в ванну с помощью микро - манипуляторы достаточно далеко , чтобы быть в состоянии погрузить цели , не задев его (рис 2D).
  14. Монитор сопротивление пипеток (R Пип, между 4-7 МОм) с использованием программного обеспечения электрофизиологии , подключенного к стадии головы.
    Примечание: Если R пип является <4 МОм кончик стекло разобьется. Если R пип> 10 МОм, наконечник скорее всего засорен и пипетка необходимо заменить.
  15. Визуализируйте ломтик ВНО с CCD-камеры с помощью инфракрасного оптимизированной дифференциального интерференционного контраста (DIC) и идентифицировать FPR-RS3-я-Венера клеток, экспрессирующих (или аналогичным образом маркированные нейроны) с помощью флуоресцентной подсветкии соответствующий фильтр куба.
  16. Фокус и целевой флуоресцентный или нефлуоресцентной клетки в зависимости от экспериментального проектирования.
  17. Для того, чтобы приблизиться к телу клетки, использовать ручные колеса для максимальной чувствительности. Из-за положительного давления, небольшая вмятина в клеточной мембране сомы становится видимым, как только наконечник пипетки находится в непосредственной близости.
  18. Освободить положительное давление и применить небольшое отрицательное давление, чтобы всасывать в клеточной мембране, чтобы получить высокую запечатывание (1-20 ГОм). Применить короткое и нежное всасывание, чтобы разрушить клеточную мембрану и установить конфигурацию целой клетки.
  19. Контролировать устойчивость доступа к постоянно во время эксперимента.
    Примечание: включают в себя только нейроны , проявляющих малый и стабильное сопротивление доступа (≤3% от входа R, изменение <20% в течение эксперимента) в анализе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы получить представление о биофизических и физиологических свойств определенных клеточных популяций, мы проводим острые коронарные срезы ткани мыши ВНО (Рисунок 1 - 2). После рассечения, ломтики можно хранить в ледяном окисленной внеклеточный раствор (S 2) в течение нескольких часов. При установке записи, постоянный обмен со свежим насыщенным кислородом раствором (рис 2D) обеспечивает жизнеспособность тканей в те...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ВНО является хемосенсорных структура, которая обнаруживает semiochemicals. На сегодняшний день большинство вомероназальных рецепторов остается быть deorphanized, как было выявлено лишь несколько пар рецептор-лиганд. Среди тех, V1rb2 был описан быть специально активирован мужского мочевого феромонов 2-гептаноне 30, V2rp5 быть активирован для самцов феромонов ESP1 57, а также V2r1b и V2rf2 быть активированы с помощью пептидов ГКГ SYFPEITHI 48 и SEIDLILGY 58, соответственно. Пред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Ивана Родригеса и Бенуа фон дер Вейда за создание линейки мышей FPR-rs3-i-venus, их конструктивную критику и плодотворные дискуссии. Работа финансировалась за счет грантов Фонда Volkswagen (I/83533), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) и Excellence Initiative федерального правительства и правительств земель Германии. Магистр наук является профессором Фонда Фольксвагена.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Химикаты
Агароза (низкая температура желирования)PeqLab35-2030
АТФ (Mg-АТФ)Sigma-AldrichA9187
Бис (2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота (BES)Sigma-AldrichB9879
Хлорид кальцияSigma-AldrichC1016
Этиленгликоль тетрауксусная кислота (EGTA)Sigma-AldrichE3889
ГлюкозаSigma-AldrichG8270
GTP (Na-GTP)Sigma-Aldrich51120
(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES)Sigma-AldrichH3375
Магния хлоридSigma-AldrichM8266
Хлорид калияSigma-AldrichP9333
Гидроксид калияSigma-Aldrich03564
Хлорид натрияSigma-AldrichS7653
Гидрокарбонат натрияSigma-AldrichS5761
Гидроксид натрияSigma-AldrichS8045
NameCompany<strong>Номер в каталогеКомментарии
>Хирургические инструменты и расходные материалы
Большая чашка Петри,обезглавливание 90 мм VWR
Маленькая чашка Петри,VWR35 мм для вскрытия VNO, чашка для встраивания в агарозу
Острые большие хирургические ножницыFine Science Toolsобезглавливание, удаление нижней челюсти
Прочные костные ножницыFine Science Toolsрежущие резцы
Средние щипцы, пинцет Dumont #2Fine Science Toolsдля снятия кожи и неба
Микропружинные ножницы, 8,5 см, изогнутые, лезвия 7 мм Fine Science Toolsвырезает VNO 
Две пары тонких щипцов, пинцет Дюмон #5Fine Science Инструментыдля рассечения VNO из хрящевой капсулы
Малый шпатель из нержавеющей стали FineScience Инструментыдля работы с агарозным блоком и срезами тканей
Хирургический скальпельдля разрезания агарозного блока в пирамидальную форму
NameCompanyКаталожный номерКомментарии
Оборудование
УсилительHEKA ElektronikEPC-10
Капилляры из боросиликатного стекла (1,50 мм OD/0,86 мм ID)Научные продукты
Leica MicrosystemsDFC360FX
Фильтр кубический, возбуждение: BP 450-490, подавление: LP 515Leica MicrosystemsI3
Люминесцентная лампаLeica MicrosystemsEL6000
Нагревательная пластина магнитная мешалкаSnijders34532
Microforge Микроманипулятор NarishigeMF-830
 Луигс и NeumannSM-5
Съемник микропипеток, вертикальный двухступенчатыйNarishigePC-10 
МикроскопLeica MicrosystemsCSM DM 6000 SP5
Шумоподавление 50/60 Гц (HumBug)Quest Scientific
Objective Leica MicrosystemsHCX APO L20x/1,00 Вт
ОсциллографTektronikTDS 1001B
Осмометр GonotecOsmomat 030
Перфузионная система 8-в-1AutoMate Scientific
pH-метр пять легкихMettler Toledo
Банка для хранения пипетокWorld Precision Instrumentse212
Записывающая камера Луигс и Мини-камераSlice
Бритвенные лезвияWilkinson Sword GmbHWilkinson Sword Classic
Кислородная камера для хранения ломтиков; альтернативными коммерческими камерами являются: e., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) или предварительная камера (BSC-PC; Warner Instruments)изготовленный
стереомикроскопLeica MicrosystemsS4E
Триггерный интерфейс HEKA ElektronikTIB-14 S
Вибратом Leica MicrosystemsVT 1000 S
Водяная баня МеммертWNB 45
, рассечение капсулы VNO крышка ПЗС-камера Neumann на заказ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  3. Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
  4. Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
  5. Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
  6. Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
  7. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  8. Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
  9. Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
  10. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  11. Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
  12. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
  13. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
  14. Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
  15. Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
  16. Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
  17. Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
  18. Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
  19. Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
  20. Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
  21. Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
  22. Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
  23. Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
  24. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
  25. Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
  26. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  27. Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
  28. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  29. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
  30. Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
  31. Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
  32. Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
  33. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  34. Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
  35. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  36. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
  37. Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
  38. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  39. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
  40. Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
  41. Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
  42. Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
  43. Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
  44. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  45. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  46. Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  47. Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
  48. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
  49. Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
  50. Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
  51. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  52. Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
  53. Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
  54. Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
  55. Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
  56. Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
  57. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  58. Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
  59. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Single Cell ElectrophysiologyVomeronasal Sensory NeuronsFpr rs3 i Venus MicePatch Clamp RecordingTissue DissectionVibratome SectioningFluorescence ImagingChemosensory Detection

Похожие статьи