Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Summary

Мы описываем здесь метод идентификации малых молекул-связывающих белков с помощью мечения фотоаффинностью. Преимущество этого метода заключается в том, что связывание и ковалентное мечение белков-мишеней происходит в живой клеточной среде, устраняя риск нарушения структуры нативного белка и условий связывания при лизисе клеток.

Abstract

Идентификация молекулярных мишеней малых молекул является сложным, но необходимым шагом на пути к пониманию механизма их действия. Несмотря на то, что было разработано несколько методов идентификации мишеней, которые были использованы для успешного выяснения связывающих белков различных малых молекул, эти методы имеют недостатки, которые делают их непригодными для обнаружения определенных типов взаимодействий между малыми молекулами и мишенями. В частности, нековалентные взаимодействия, которые зависят от нативных клеточных условий, таких как мембранные белки, структуры которых могут быть нарушены при лизисе клетки, часто не поддаются методам идентификации мишеней, основанным на аффинности. Здесь мы демонстрируем метод, в котором зонд, содержащий фотолабильную группу, используется для ковалентной сшивки с малым молекулосвязывающим белком в окружающей среде живой клетки, что позволяет обнаруживать и выделять целевой белок без необходимости поддержания взаимодействия после лизиса клетки. Этот метод является ценным инструментом для изучения биологически интересных малых молекул с неизвестными механизмами, как в контексте фундаментальной биологии, так и в контексте разработки лекарств.

Introduction

Биоактивные малые молекулы, в основном работают путем взаимодействия с и изменения функции одной или более "целевых" молекул, чаще всего белков, в клетке. Во время обнаружения наркотиков, когда активное соединение обнаруживается через фенотипического скрининга, определение молекулярной мишени (ов) этого соединения имеет решающее значение не только для понимания механизма действия и возможных побочных эффектов соединения, но и для потенциально обнаружения новая биология , лежащая в основе модели болезни и прокладывает путь для разработки новых механистических классов терапевтических средств ^1. Хотя идентификация цели не требуется для лекарственного средства для использования в терапевтических целях, в последние годы наблюдается все более широкое признание, что новые кандидаты наркотиков больше шансов на успех в клинических испытаниях, и, следовательно, дают более высокую прибыль от инвестиций, если подтверждено целевой известно ^2. Таким образом, наблюдается растущий интерес к методам выявления небольшоймолекулы белков-мишеней.

Классическим идентификация эксперимента мишень обычно опирается на аффинной очистки, где малая молекула представляет интерес иммобилизуют на смоле и инкубировали с лизатов целых клеток, после чего несвязанных белков вымываются , а остальные белки элюируют и идентифицированы ^3. Хотя этот метод был использован для определения целей многих малых молекул ^4, она непригодна в качестве универсального метода целевой ID по нескольким причинам. Во-первых, белок-мишень должен сохранять свою нативную конформацию после лизиса клеток для того, чтобы сохранить свою способность связываться с малой молекулой. Это может быть особенно проблематичным для мембранных белков, которые часто подвергаются конформационные изменения после удаления из их родной среды, или просто агрегировать и выпадать в осадок из раствора. Во-вторых, малая молекула должна быть химически модифицированы таким образом, что он может быть иммобилизован на смолу, сохраняя при этомего способность связываться белок-мишень. Поэтому глубокие связывающие карманы могут стать недоступными для небольшой молекулы, как только она крепится к смоле. В-третьих, аффинность связывания должно быть достаточно высоким, что взаимодействие поддерживается в течение этапов промывки, что делает идентификацию более низкое сродство взаимодействий сложных. В-четвертых, условия окружающей среды, таких как рН, концентрации ионов, или при наличии других эндогенных молекул могут изменяться в пространстве внутри клетки и являются иногда предпосылками наркотиков целевых взаимодействий. Таким образом, нахождение правильных условий для обеспечения и поддержания связывания вне клетки может потребовать значительного количества проб и ошибок.

Фотоаффинное мечение обходит эти проблемы, позволяя ковалентную связь маленькой молекулы и его мишенью в нативной контексте клетки. Вместо того, чтобы иммобилизацию небольшую молекулу с большой громоздкой смолой, молекула вместо химически модифицированы, чтобы установить два небольших функциональный гroups: а Фотоактивируемая фрагмент, который позволяет ковалентного сшивания с белком-мишенью при облучении с определенной длиной волны света, а репортер группа, которая позволяет целевой белок, чтобы быть обнаружены и затем выделяют. Живые клетки обрабатывают с фотоаффинной зондом, зонд связывается и ковалентно сшивает с белком-мишенью, и зонд-белковый комплекс, затем выделяют нетронутым. Специфичность зонда связывания с мишенью демонстрируется путем проведения эксперимента конкуренции параллельно, где избыток исходного соединения, который используется, чтобы конкурировать в сторону связывания зонда с белком-мишенью.

Конструкция и синтез фотоаффинной зондов сильно варьируется от одной маленькой молекулы к другой, и не будет рассматриваться в этом протоколе; Тем не менее, несколько отличных дискуссий по этому вопросу были опубликованы ^5-9. Основным фактором является то, что зонд сохраняет биологическую активность исходного соединения, поэтому presumabLY привязки к той же цели (ов). Отношения структура-активность (SAR) исследования должны быть выполнены, чтобы определить, какие части молекулы могут быть изменены без потери биологической активности. Множество различных химических групп , которые были использованы в качестве сшивающих агентов фотоактивируемых, в том числе diazirine, бензофенон и арил азид, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки ^10. Кроме того, есть несколько тегов репортер, которые были использованы для изоляции зонд-связывающих белков. Репортерные группы могут быть функциональными сами по себе, такие как обычно используемые биотином или флуоресцентных меток, или могут быть предшественниками , которые требуют дальнейшей функционализации после стадии фотосшивки, которые имеют преимущество быть меньше и , таким образом , менее вероятно , к компромиссу биоактивность ^11.

В этом протоколе, мы использовали фотоаффинной зонд, содержащий diazirine фотосшивающих группу и терминала алкина для присоединения репортерной группы через Cu (I) -catalyzред Azide-алкине Шарплесс-Hüisgen циклоприсоединения (или щелчок) реакция ^12-15. Исследования SAR, зондировать дизайн и синтез, и результаты этих исследований были опубликованы в другом месте ^16-18.

Protocol

Примечание: Этот протокол был адаптирован из МакКиннон и Тонтона ¹⁰ для использования в живых клетках.

1. Получение культивируемых клеток

1. Готовят стерильные 6-см чашки для культивирования клеток количества отсчетов, требуемых (см ниже).
   Примечание: Одно блюдо из клеток используется в состоянии обработки, но если больше белка требуется 2 или 3 блюда могут быть приготовлены в состоянии и в сочетании после УФ-облучения.
   1. Подготовьте по крайней мере 3 блюда клеток; Отрицательный контроль только ДМСО (D), единственным методом лечения зонд (P), и зонд + конкурент (C).
   2. Необязательно, подготовить 4 - ^е блюдо как без контроля УФ, лечиться с зондом , но не подвергнутый УФ - светом.
      Примечание: Если несколько молекул конкурента должны быть испытаны, такие как различные аналоги небольшой интерес молекулы, подготовить дополнительные конкурирующие пластины по мере необходимости.
2. Добавить клетки HEK293T в культуральных чашках в 4 мл культуральной среды. Используйте 3,5 млн гргезов на чашку.
   Примечание: Число ячеек должны быть определены для каждого типа клеток, так что клетки почти 100% сплошности в начале эксперимента, с целью достижения максимального выхода белка. Для HUVEC, используют 0,3 миллиона клеток на чашку. Хорошее приближение 1/10 клеток в см чашку сливающийся 15. HEK293T клетки должны быть культивированы в модифицированной по способу Дульбекко орлов среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина.
3. Возвращение клетки в культуральную инкубатор (37 ° С, 5% СО ₂₎ в течение ночи.

2. Обработка клеток и фотосшивающих

1. На следующий день, предварительно аликвоты следующие препараты в 1,5 мл микропробирок:
   1. Для первой обработки, добавьте 4 мкл ДМСО до 2 пробирки и 4 мкл 10 мМ конкурента (т.е. немодифицированного исходного соединения) до 1 трубки.
   2. Для второй обработки, добавляют 16 мкл ДМСО в 1 пробирку и 16 мкл 50 &# 181; M фотоаффинное зонд 2 трубок.
      Примечание: Оптимальная концентрация может быть различным для различных зондов (обсуждение см), но между 200-500 нмоль является хорошей отправной точкой (здесь мы используем 200 нм). Концентрация конкурента должна превышать зонда, по меньшей мере в 20 раз (в данном случае мы используем 10 мкМ). Конечная концентрация ДМСО должна быть одинаковой во всех пластинах и не должна превышать 0,5% (20 мкл объем).
2. Доведите клеточные пластины в капот культуре клеток и добавить предварительно аликвоты препараты из стадии 2.1.1 следующим образом: Аспирируйте 1 мл культуральной среды, ресуспендируя предварительно аликвоты препарата в средствах массовой информации, и осторожно добавляя его обратно к падению пластины мудрым. Добавить ДМСО в (D) пластины ДМСО и зонд (P) пластины, а также добавить конкурента на конкурс (C) пластины. Возвращение пластины в культуральную инкубаторе в течение 30 мин.
3. С огнями в капот культуре серым цветом, добавить предварительно аликвоты зонд с шага 2.1.2 зонд (P) и конкуренции (C) плиты и добавитьДМСО в ДМСО (D) пластины, как описано выше. Возвращение пластины в культуральную инкубаторе в течение 1 часа.
4. Во время инкубации, подготовить следующие пункты; Лоток льда, который может поместиться все из пластин; ледяной буфера для лизиса (PBS [рН 8,5] + ингибитор протеазы 1x коктейль [полный EDTA-свободный, разведенным из маточного раствора 50x сделанного в воде]; 200 мкл / чашку); микроцентрифужных трубки помечены D, P или C для каждого из различных условий обработки, на льду.
5. За 15 мин до конца 1 ч инкубации, установить УФ-лампы (365 нм) в холодной комнате и включите его, чтобы разогреть лампу.
6. Через 1 ч инкубации с зондом, поместите посуду на лед. Промывают клетки осторожно с помощью 5 мл охлажденного льдом PBS (рН 7,4) для удаления избытка зонда. Повторно покрывают клетки с 4 мл охлажденного льдом PBS.
7. Поместите блюдо клеток, сосредоточенных на 3 см под УФ-лампой на верхней части рукавицей, чтобы минимизировать нагрев от лампы. Облучают в течение 3 мин. Удалить блюдо в лоток льда и повторить для всех образцов.
8. осле облучение, аспирация PBS от клеток и добавляют 200 мкл охлажденного льдом PBS (рН 8,5) с ингибиторами протеазы к каждой пластине. Открепления клеток от пластины с помощью резинового скребка и передачи на предварительно меченных микропробирок на льду.
9. Добавить SDS до конечной концентрации 0,4% (10 мкл 10% SDS в 250 мкл образца).
   ВНИМАНИЕ: SDS порошок является опасным. Избегайте вдыхания порошка SDS, надев маску на нос и рот.
10. Лизировать клетки путем обработки ультразвуком суспензии в течение 10 импульсов (выход 1, рабочий цикл 30%) и инкубировать на льду в течение 1 мин до второго раунда 10 импульсов.
11. При необходимости удалить 2 мкл суспензии, и проверить под световым микроскопом, чтобы обеспечить полный лизис клеток.
12. Кипение образцы на горячей плите, установленной на 95 & deg; С в течение 5 мин для завершения клеточного лизиса и денатурации все белки.
13. Измерение концентрации белка в каждом образце с использованием спектрофотометрического моюще-совместимого анализа белка, такие как гое Dc анализ протеина по ^19, в соответствии с инструкциями производителя, с помощью спектрофотометра , установленного для измерения оптической плотности при 750 нм.
14. Нормализация концентрации белка до 2,5 мг / мл (или, если концентрации ниже, чем 2,5 мг / мл, нормализуют к пробе с низкой концентрацией белка) добавлением PBS, рН 8,5 + 0,4% ДСН, при необходимости (например, если образцы 5 мг / мл в 250 мкл, добавляют 250 мкл PBS с рН 8,5 + 0,4% SDS, чтобы получить конечную концентрацию 2,5 мг / мл).

3. Присоединение флуоресцентной метки с помощью Click химии для визуализации меченых белков

1. Удалить 40 мкл лизата и переноса клеток в новую пробирку микроцентрифужных. Хранить оставшиеся лизатов для реакции с биотин-азид (этап 4).
2. Добавьте следующие реагенты в следующем порядке: 0,2 мкл плавиковый азид (1 мМ маточного раствора в ДМСО), 0,58 мкл ТСЕР (100 мМ запас в воде с 4 экв добавили раствор NaOH, приготовленный свежий), и 3,38 мкл TBTA (1.7 мМ запас в соотношении 4: 1 трет-бутанола в ДМСО). Vortex перемешать.
3. Добавить 1,14 мкл CuSO ₄ -5Н ₂ O (50 мМ в воде) , чтобы начать реакцию. Vortex кратко и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
4. Добавляют 50 мкл 2x SDS буфера для образца для гашения реакции. На данный момент, запустить образцы непосредственно на SDS-PAGE геле ²⁰ для достижения наилучших результатов, или в магазине в течение ночи при необходимости -20 ° C.
5. Если замораживать образцы, разогревать в течение 5 мин при 95 ° С перед загрузкой в ​​гель.
   Примечание: Так как молекулярная масса белка - мишени , как правило , не известно , на данном этапе, то целесообразно , чтобы запустить 2 гелей с различной концентрацией акриламида (т.е., 8% и 15%), или широкий гель градиента диапазон молекулярной массы (то есть, 4-15%), чтобы обеспечить полный охват молекулярной массы.
6. Когда фронт красителя достиг конца геля, продолжать работать гель еще в течение 5 мин, чтобы гарантировать, что все избыточного unreacted плавиковый азид полностью вышла из геля.
7. Удалите гель в контейнер с DDH ₂ O и инкубировать в течение 10 мин при осторожном перемешивании, чтобы смыть все излишки плавиковый азид.
8. Поместите гель на стеклянную пластинку и сканирования геля с использованием Typhoon флуоресцентного сканера геля в соответствии с инструкциями изготовителя.

4. Вложение биотина Tag с помощью Click Химия для аффинной очистки меченых белков

1. Из оставшихся лизатах из шага 3.1, используйте максимальное количество после того, как белка нормализации таким образом, что все образцы имеют такой же объем (например, если после нормализации до 2,5 мг / мл в результате объемы проб 500, 550 и 600 мкл, использовать 500 мкл каждого).
2. Предварительно очистить лизаты путем добавления к 50 мкл высокой емкости стрептавидин агарозном бисером, предварительно промытой 2x с PBS (рН 7,4). Инкубируют 1 час при 4 ° С с вращением.
3. Гранул шарики центрифугированием при 1000 мкг в течение 3 мин. Удалить тон супернатант в новую пробирку микроцентрифужных на льду и выбросить шарики.
4. Удалить 1-2% образца ДМСО в новую пробирку с надписью "вход". Добавьте эквивалентный объем 2x SDS буфера образца и хранят при -20 ° С.
5. На 500 мкл лизата, добавьте следующие реагенты: 1,38 мкл биотин-азид (10 мМ исходного раствора в ДМСО), 5,5 мкл ТСЕР, и 32,5 мкл ТБТА. Vortex перемешать.
6. Добавить 11 мкл CuSO ₄ -5H ₂ O в 500 мкл лизата и вихрем кратко. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
7. Добавляют 4 объемов образцов ацетона, охлажденной до -20 ° С. Вихревой образцы и инкубируют в течение ночи при температуре -80 ° С, чтобы полностью осадить белки и удаления непрореагировавшего биотин-азида.
8. Центрифуга образцов при 17000 х г в течение 15 мин при 4 ° С для осаждения осажденных белков.
9. Аспирируйте супернатант полностью, и resolubilize белки путем обработки ультразвуком в 150 мкл PBS (рН 7,4) + 1% SDS.
10. Добавить 600 мкл PBS (рН 7,4), чтобы разбавить концентрацию SDS до 0,2%.
11. Добавьте образцы к 30 мкл предварительно промытой высокой емкости стрептавидин агарозном бисером и инкубировать 1 час при 4 ° С с вращением.
12. Гранул шарики центрифугированием при 1000 мкг в течение 3 мин. Аспирируйте супернатант, содержащий несвязанных белков и выбросьте.
13. Добавить 1 мл промывочного буфера (400 мМ NaCl, 50 мМ Трис, 0,2% SDS, рН 7,4) с бортами и инкубировать 5 мин при комнатной температуре с вращением.
14. Повторите шаги 4.12 и 4.13 3 раза.
15. Аспирируйте промывочный буфер полностью из бисера, и добавить 30 мкл 2x SDS буфера для образца.
16. Выдержите в течение 5 мин на C тепла блока 95 °, чтобы освободить белки из бисера.
17. Центрифуга бусин в течение 1 мин при 13000 х г при комнатной температуре.
    Примечание: На данный момент, образцы можно хранить при температуре от -20 ° С до готовности для запуска SDS-PAGE. Если замораживать образцы, разогревать в течение 5 мин при 95 ° С перед использованием.
18. Внимательнопипетки буфера для образцов , содержащих белки прочь гранул, и загружают на SDS-PAGE ²⁰ (см важные соображения ниже). Шарики могут быть сохранены для позже, если дополнительного испарения необходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения белка серебром пятна, лучшие результаты получаются при использовании густой гель 1 мм. Если группа должна быть вырезаны из серебряной окрашивали гель для масс-спектрометрии (МС) анализа, подготовить все реагенты свежие из стерильных растворов и оставить пустой хорошо между образцами на геле. Для каждой группы вырезаны из зонда полосу, параллельный срез должен быть взят из ДМСО полосу таким образом, что фоновые белки могут быть вычтены. Для проверки достоверности белка ID Вестерн-блот, очень важно также загрузить образец входного сигнала с шагом 4.4 при работе гель SDS-PAGE.
19. Выполните стандартный протокол либо окрашиванием серебром ²¹ или Вестерн - блот - ²² для обнаружения целевой белок (белки).

Results

Результаты , представленные здесь , были получены с помощью фотографического сродства зонда противогрибкового лекарственного итраконазол, использование которых ранее было опубликовано ^16. Эти результаты демонстрируют использование живых клеток методом фотоаффинное маркировки, чтобы успешно идентифицировать главную итраконазол-связывающий белок, как 35 кДа мембранный белок зависимые от напряжения Анион канала 1 (VDAC1).

Discussion

Различные подходы к определению целевых малых молекул могут быть широко сгруппированы в две категории: сверху вниз, где клеточный фенотип препарат используется, чтобы сузить свои потенциальные цели на основе их известных функций, или снизу вверх, где целевая идентифицируется непосредственно с помощью химического или генетического средства ^3. Сверху вниз или фенотипические исследования могут идентифицировать определенные клеточные процессы , пострадавших от препарата (например, транскрипции / трансляц...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP)	Life Technologies	20490	Сделайте новый день использования. Приготовьте 100 мМ бульона в воде с 4 эквалайзерами NaOH.
Трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил] амин (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Приготовьте бульон 1,7 мМ в соотношении т-бутанол к ДМСО 4:1, храните при -20°; °C.
сульфат меди (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Приготовьте бульон 50 мМ в воде, храните при комнатной температуре.
Биотин-азид	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Приготовьте 10 мМ запас в ДМСО, храните при -20  °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Подготовить 1 мМ запас в ДМСО, хранить при -20  °C.
очки с УФ-лампой 365 нм	Spectroline	FC100	блокирующие ультрафиолетовое излучение.
Таблетки ингибитора протеазы, не содержащие ЭДТА	Roche Life Science	11873580001	Приготовьте 50-кратный раствор в воде и храните при температуре -20  °C.
Ультразвуковой аппарат	Branson	Sonifier 250	Комплект на выход 1, режим работы 30%.
Флуоресцентный гелевый сканер	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Используйте красный лазер для обнаружения Alexa-fluor 647.
Набор для анализа белка Dc с моющим средством	Bio-Rad	5000112
высокопроизводительными шариками стрептавидина и агарозы	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, с низким содержанием глюкозы	ThermoFisher Scientific	11885092
фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная	ThermoFisher Scientific	26140079
раствор пенициллина/стрептомицина	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	ЛК2676