Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Summary

Мы описываем здесь метод идентификации малых молекул-связывающих белков с помощью мечения фотоаффинностью. Преимущество этого метода заключается в том, что связывание и ковалентное мечение белков-мишеней происходит в живой клеточной среде, устраняя риск нарушения структуры нативного белка и условий связывания при лизисе клеток.

Abstract

Идентификация молекулярных мишеней малых молекул является сложным, но необходимым шагом на пути к пониманию механизма их действия. Несмотря на то, что было разработано несколько методов идентификации мишеней, которые были использованы для успешного выяснения связывающих белков различных малых молекул, эти методы имеют недостатки, которые делают их непригодными для обнаружения определенных типов взаимодействий между малыми молекулами и мишенями. В частности, нековалентные взаимодействия, которые зависят от нативных клеточных условий, таких как мембранные белки, структуры которых могут быть нарушены при лизисе клетки, часто не поддаются методам идентификации мишеней, основанным на аффинности. Здесь мы демонстрируем метод, в котором зонд, содержащий фотолабильную группу, используется для ковалентной сшивки с малым молекулосвязывающим белком в окружающей среде живой клетки, что позволяет обнаруживать и выделять целевой белок без необходимости поддержания взаимодействия после лизиса клетки. Этот метод является ценным инструментом для изучения биологически интересных малых молекул с неизвестными механизмами, как в контексте фундаментальной биологии, так и в контексте разработки лекарств.

Introduction

Биоактивные малые молекулы, в основном работают путем взаимодействия с и изменения функции одной или более "целевых" молекул, чаще всего белков, в клетке. Во время обнаружения наркотиков, когда активное соединение обнаруживается через фенотипического скрининга, определение молекулярной мишени (ов) этого соединения имеет решающее значение не только для понимания механизма действия и возможных побочных эффектов соединения, но и для потенциально обнаружения новая биология , лежащая в основе модели болезни и прокладывает путь для разработки новых механистических классов терапевтических средств ^1. Хотя идентификация цели не требуется для лекарственного средства....

Protocol

Примечание: Этот протокол был адаптирован из МакКиннон и Тонтона ¹⁰ для использования в живых клетках.

1. Получение культивируемых клеток

1. Готовят стерильные 6-см чашки для культивирования клеток количества отсчетов, требуемых (см ниже).
   Примечание: Одно блюдо из клеток используется в состоянии обработки, но если больше белка требуется 2 или 3 блюда могут быть приготовлены в состоянии и в сочетании после УФ-облучения.
   1. Подготовьте по крайней мере 3 блюда клеток; Отрицательный контроль только ДМСО (D), единственным методом лечения зонд (P), и зонд + конкурент (C).
   2. Необязательно, подготовить 4 -....

Results

Результаты , представленные здесь , были получены с помощью фотографического сродства зонда противогрибкового лекарственного итраконазол, использование которых ранее было опубликовано ^16. Эти результаты демонстрируют использование живых клеток методом фотоаффинное маркировки, чтобы успешно идентифицировать главную итраконазол-связывающий белок, как 35 кДа мембранный белок зависимые от напряжения Анион канала 1 (VDAC1).

Discussion

Различные подходы к определению целевых малых молекул могут быть широко сгруппированы в две категории: сверху вниз, где клеточный фенотип препарат используется, чтобы сузить свои потенциальные цели на основе их известных функций, или снизу вверх, где целевая идентифицируется непосредственно с помощью химического или генетического средства ^3. Сверху вниз или фенотипические исследования могут идентифицировать определенные клеточные процессы , пострадавших от препарата (например, транскрипции / трансляц.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP)	Life Technologies	20490	Сделайте новый день использования. Приготовьте 100 мМ бульона в воде с 4 эквалайзерами NaOH.
Трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил] амин (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Приготовьте бульон 1,7 мМ в соотношении т-бутанол к ДМСО 4:1, храните при -20°; °C.
сульфат меди (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Приготовьте бульон 50 мМ в воде, храните при комнатной температуре.
Биотин-азид	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Приготовьте 10 мМ запас в ДМСО, храните при -20  °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Подготовить 1 мМ запас в ДМСО, хранить при -20  °C.
очки с УФ-лампой 365 нм	Spectroline	FC100	блокирующие ультрафиолетовое излучение.
Таблетки ингибитора протеазы, не содержащие ЭДТА	Roche Life Science	11873580001	Приготовьте 50-кратный раствор в воде и храните при температуре -20  °C.
Ультразвуковой аппарат	Branson	Sonifier 250	Комплект на выход 1, режим работы 30%.
Флуоресцентный гелевый сканер	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Используйте красный лазер для обнаружения Alexa-fluor 647.
Набор для анализа белка Dc с моющим средством	Bio-Rad	5000112
высокопроизводительными шариками стрептавидина и агарозы	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, с низким содержанием глюкозы	ThermoFisher Scientific	11885092
фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная	ThermoFisher Scientific	26140079
раствор пенициллина/стрептомицина	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	ЛК2676