Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель Серийное Concussive Травмы головы у мышей

11.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54530

⸱

12 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Program for Neurotrauma, Neuroproteomics & Biomarkers Research, University of Florida, 2Department of Psychiatry, University of Florida, 3Department of Neuroscience, University of Florida

В этой статье

Краткое содержание

Сотрясение мозга является наиболее распространенным типом черепно-мозговой травмы. Таким образом, повторяющаяся модель сотрясения мозга на животных, которая воспроизводит важные особенности травмы у пациентов, может предоставить средства для изучения сотрясения мозга строгим, контролируемым и эффективным образом.

Аннотация

Несмотря на то, что сотрясение мозга / легкая черепно-мозговая травма (ЧМТ) является наиболее частым случаем черепно-мозговой травмы, до сих пор не хватает знаний о травме и ее последствиях. Чтобы лучше понять сотрясения мозга, часто используются животные, потому что они обеспечивают контролируемую, строгую и эффективную модель. Исследования адаптировали традиционные животные модели для выполнения ЧМТ для стимуляции легкой тяжести травмы путем изменения параметров травмы. Эти модели были использованы, потому что они могут вызывать морфологически сходные повреждения головного мозга с клиническим состоянием и обеспечивать спектр тяжестей травм. Тем не менее, они ограничены в своей способности проявлять идентичные признаки травм у пациентов. Используя традиционную ударную систему, модель повторяющейся сотрясения мозга (rCHI) может вызвать сотрясение мозга легкой или средней степени тяжести, подобное человеческому. Степень травмы может быть определена путем измерения периода потери сознания (LOC) с признаком преходящего прекращения дыхания. Модель rCHI выгодна для использования благодаря ее точности и простоте в определении эффектов ЧМТ и потенциальных методов лечения.

Введение

Сотрясение, называемый также легкой черепно-мозговая травма (mTBI), является наиболее частое возникновение черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и затрагивает миллионы людей в Соединенных Штатах. Сотрясения может быть сложно диагностировать и не существует какого-либо конкретного лекарства от сотрясения мозга. Существует растущее признание и некоторые доказательства того, что мягкая механическая травма в результате спортивных травм, боевые действия , и других физически привлекательных занятий может иметь кумулятивные и хронические неврологические последствия 1,2. Тем не менее, все еще существует недостаток знаний о сотрясений и их последствий. Текущая методология ограничивает исследования патологии и лечения у людей, так как только неврологическое оценки и анализа изображений доступны для клинического диагноза. Животные модели обеспечивают средства для изучения сотрясений эффективным, строгим, и контролируемым образом с надеждой дальнейшей диагностики и лечения mTBI.

Исследования адаптировали традиционные TBIмодели, такие как контролируемые корковой воздействия (CCI), воздействие жидкости перкуссии (ИПИ), вес травмы падение и травмы взрыв, чтобы выполнить mTBI и стимулировать низкие уровни серьезности травмы путем изменения параметров травмы. Эти модели являются полезными для использования из-за их способности реплицировать травмы головного мозга морфологически сходны с клиническим состоянием; Тем не менее, они также имеют свои собственные ограничения. Тяжесть травмы, вызванной травмы ускорение (падение веса) часто сильно варьирует. Два результаты мягкого CCI - субарахноидальное кровоизлияние и фокусного - ушиб не сравнимы с типичными человеческими сотрясений. ТПП и ИПИ требуют краниотомии, которая не является клинически значимым, в то время как травмы взрыва является более спорной модели в отношении различных измерений положения экспозиции и пик давления, а также переменная вторичное повреждение во время экспозиции 3-6. Обновленный Шокирующий животную модель что может перевести доклинических исследований в клиническую Settiнг необходимо в научных исследованиях.

Ключевым вопросом при моделировании мягкий TBI является определение экспериментальной травмы тяжести, которая наиболее близко повторяет травмы в клинических условиях. В последнее время различные исследовательские группы разработали закрытую черепно - мозговую травму или Шокирующий травмы головы (CHI) Модель 7-10. CHI является модификацией CCI без трепанации, но он по-прежнему использует традиционную электронную систему магнитного воздействия для формирования удара головой. Хи может вызвать сотрясение мозга в диапазоне от легкой до умеренной путем регулирования параметров воздействия. Потеря сознания (ЛОК) можно наблюдать сразу же после удара путем обнаружения уменьшения частоты дыхания или переходного прекращения дыхания. Период LOC используется для определения степени тяжести травмы. Эта статья включает в себя немного улучшенный и обновленный вариант повторяющейся CHI (rCHI) модели у мышей, наряду с подробным протоколом шаг за шагом и репрезентативных результатов. RCHI модель исследования СТРАТЕГИИповторно полезны при определении mTBI эффектов и возможных методов лечения, тем более, что нет индивидуальная модель животного способен подражать все сотрясением индуцированных патологических изменений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с протоколами # 201207692 утвержденным Institutional Animal Care и использование комитета Университета Флориды по и в соответствии с национальными институтами здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Уход за животными

  1. Используйте 3-4-месячных мышей C57BL 6J мужчина /. Обеспечить постельные принадлежности, гнездовой материал, пищу и воду в неограниченном количестве . Держите мышей при температуре окружающей среды, контролируемых при температуре 20 - 22 ° C с постоянными 12 ч свет / 12-часовых темных циклов.

2. Предварительная подготовка сдавление

  1. Приложить на заказ силиконовой резины с покрытием металлический наконечник к электромагнитному стереотаксической ударного устройства. Убедитесь , что плоское дно наконечника параллельна поверхности наконечника зонда (Рис . 1А)
  2. Обезболить мышь с 4% изофлуран с последующей поддерживающей анестезии 2,5% изофлуран. Проверьте анестезию с помощью расходомера. Monitoг уровень анестезии до животного достигает хирургического уровня анестезии, показывая потерю снятия педали рефлекса.
  3. Поместите мышь в положении лежа на грелку. Используйте воронкообразную носовой обтекатель держать мышь под наркозом. Полностью брить голову с помощью триммера. Используйте вазелин глазной мази на глазах мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом.

3. Влияние Параметры настройки

Примечание: Система воздействия включает блок управления для установки параметров удара, исполнительный механизм для выполнения сдавление и цифровой стереотаксической рамы с осями 3-движения.

  1. Заданная скорость ударного устройства до 4 м / сек и времени выдержки до 240 мс на блоке управления.

4. Позиционирование Impact центр

  1. Поместите мягкую грелку под тела животного, чтобы поддерживать температуру тела около 39 ° С. Установите мышь в стереотаксической рамы в Pronе положение с решеткой с тупым концом уха.
  2. Опустите кончик воздействия близко к голове мыши, перемещая Z-драйвер. Отрегулируйте плоский наконечник удара (диаметром 9 мм) путем перемещения х и у водителей на полпути к целевой координаты над стреловидного шва.
  3. Убедитесь , что один край наконечника удара вертикально , параллельно воображаемой горизонтальной линии , проведенной между двумя ушами (Рисунок 1C). Центр воздействия соответствует центральному стреловидного шва на полпути между interfrontal и ламбдовидного швов (Interaural 9 мм до Interaural 0 мм, боковые 4,5 мм).

5. Влияние глубины установки

  1. Для того, чтобы правильно установить глубину воздействия, используйте дополнительный наконечник зонда для замены изолированный силиконовой резины покрытием наконечник удара.
  2. Для того, чтобы убедиться, что нет никакого смещения центра удара после включения подсказок, установите X и Y канала на цифровой стереотаксической панели управления до нуля перед переключением подсказки.
  3. Перемещение Probе наконечник к центру зоны воздействия вручную перемещая X-и Y-дисков.
  4. Зажим контактный датчик к хвосту мыши.
  5. Перемещение дробилку (Z диск) вниз, пока наконечник зонда не соприкасается с поверхностью участка воздействия.
  6. Установите Z-канала на панели управления стереотаксической нулю.
  7. Переместить наконечник удара обратно в зону воздействия вручную регулируя х и у водителей (не нулевые кнопки на цифровой стереотаксической панели управления) до Х- и Y-водителей равны нулю (где наконечник удара был ранее расположен).
  8. Отвести привод, передвинув переключатель втягивания на блоке управления. Вручную переместите дробилку вниз (драйвер Z) на 4 мм.

6. Воздействие

  1. Trigger влияние, нажав на выключатель воздействия на блоке управления и достичь глубины деформации 4 мм.

7. Пост-сдавление

  1. Измерьте время от воздействия до первого дыхание мыши не с помощью таймера.
  2. Удалить животное от прибора и поместить их на теплую подушку, чтобы поддерживать температуру тела. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее.
  3. Разрешить для восстановления перед возвращением животное обратно в чистую клетку. Не вернуть животное в компании других животных, пока полностью не выздоровел.
  4. Обратите внимание и взвесить мышей ежедневно. Если мыши обнаруживают признаки боли, внутрибрюшинно вводят их с Мелоксикама на 1 - 2 мг / кг каждые 12 - 24 ч.

8. Повторные Impaction

  1. Дайте Мышей дополнительные травмы на дни 4, 7 и 10 после первоначальной травмы (72 ч интервал между ударами).

9. Иммуногистохимия (IHC)

  1. Transcardial перфузия
    1. Обезболить мышей через внутрибрюшинной инъекции 200 м / кг фенобарбитала.
    2. Оценка и обеспечить хирургической плоскости анестезии с помощью пальца щепоткой. SecЮр мышь в положении лежа на спине, аккуратно записывая на пленку передние лапы и задние лапы к поверхности Пенополистирол работы внутри химической вытяжкой.
    3. Сделайте надрез через кожу вдоль средней линии грудной клетки от чуть ниже мечевидного отростка до ключицы. Сделайте два дополнительных разрезов кожи на мечевидного отростка и продолжить вдоль основания брюшной ребрам с боков.
    4. Откройте грудной полости и обнажить сердце путем разрезания через грудную мускулатуру и ребрам.
    5. Закрепить бьющееся сердце с тупыми щипцами и сделать 1 - мм разрез 2 в левом желудочке.
    6. Немедленно вставить бабочки иглу в правое предсердие. Начните вливание 20 мл физиологического раствора медленно толкая шприц.
    7. Переход от физиологического раствора до 4% параформальдегидом. Продолжить перфузии с 20 мл параформальдегида.
    8. Обезглавьте мыши и снимите кожу с помощью ножниц. Изолировать мозг из черепа с помощью резака кости.
  2. Сryostat секционирования
    1. Код для вставки в ткани мозга оптимальной температуры резания (ОКТ) состава и заморозить при температуре -80 ° C. Поместите мозг в криостата в сагиттальной ориентации. Срезанные срезы головного мозга толщиной 5 мкм.
  3. Окрашивание
    1. Сухие замороженные срезы при комнатной температуре в течение 1 часа.
    2. Инкубируйте слайды с 100 мкл 2% козьей сывороткой и 0,1% Тритон Х-100 в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    3. Вымойте слайды 3 раза 300 мкл PBS. Затем инкубировать слайды с анти-GFAP (1: 200) или анти-ферритин антитело (1: 200), отдельно в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Вымойте слайды 3 раза 300 мкл PBS. Затем инкубировать слайды в течение 2 ч при комнатной температуре с биотин-конъюгированными вторичными антителами.
    5. Вымойте слайды 3 раза 300 мкл PBS. Затем инкубировать слайды с раствором авидинбиотиновом комплекс (ABC) (1:50) при комнатной температуре в течение 30 мин.
    6. Вымойте слайды 3 раза 300 мкл PBS. Затем инкубировать в 3,3'-диаминобензидино растворе (DAB) субстрата (50 мл PBS, 10 мкл H 2 O 2, 10 мг ДАБ таблетки, фильтра перед использованием) в течение 5 - 8 мин. Обратите внимание на слайды под микроскопом, пока не появятся позитивные клетки.
    7. Промыть слайды в медленном проточной водопроводной водой в течение 5 мин. Чистые слайды с лабораторией-вытирать. Затем установите секции с монтажной средой и покровное.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этой модели (рис 1 AC), были короткие периоды задыхаясь и мелких дыханий. Потеря сознания (бессознательного) определяется как уменьшение частоты дыхания или транзиторной прекращение дыхания перед возобновлением нормального дыхания. Влияние на центр головы вызвало кратковременное бессознательное состояние (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 сек при каждом ударе по отдельности, рис 1D). Мозг мышей показали нормальную морфологию Н & Е гистоло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для того, чтобы имитировать мозговые травмы морфологически сходны с клиническим состоянием, симптомы после сотрясения ожидаются. симптомы после сотрясения обычно включают в себя головную боль, головокружение, головокружение, усталость, проблемы с памятью и сна, проблемы с концентрацией внимания, а также беспокойство и подавленное настроение. Поскольку соматические симптомы могут быть еще не измеримы на животных моделях, изменения двигательных и когнитивных функций и эмоционального поведения используются в качестве крите...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют финансовой заинтересованности в раскрытии информации.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансированием гранта Florida Health (Фонд исследований травм головного и спинного мозга) (KKW).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
аппарат для анестезииEagle Eye Anesthesia, IncМодель 150 анестезия
Электромагнитный импакторLeicaBiosystemsImpact One Стереотаксический импакторвыполняет удар
Цифровой стереотаксический инструментLeicaBiosystems39462501креплением мыши и позиционированием наконечников
Сицилон с резиновым покрытием металлический наконечникPrecision Tool & Инженерия, Gainesvill FLизготовленный на заказударный наконечник
литий-ионный универсальный триммерWAHL Товары для дома9854-600скрепки для бритья волос мыши
заказнаконечник щупа
аппликаторы с хлопковым наконечникомMEDLINEMDS202055насадка для скраба с физиологическим раствором
Ткань Tek O.C.T.ASKURA FINETEK США INC4583тканевое встраивание
анти-GFAPDako CA93013антитело для ИГХ
анти-ферритинSigmaF6136антитело для ИГХ
VECTASTAIN Elite ABC  набордля векторных лабораторийPK-6100ИГХ система детектирования
Permount монтаж среднийFisher ScientificSP15-100
Aperio XT ScanScope сканерLeica Microsystems Inc,слайдысканирование
Leica AutoStainer XLLeica патологоанатомическая компанияST2010H& E окрашивание
DAB Система обнаружения sigmaD3939IHC
на

Ссылки

  1. Baugh, C. M., et al. Chronic traumatic encephalopathy: neurodegeneration following repetitive concussive and subconcussive brain trauma. Brain Imaging Behav. 6 (2), 244-254 (2012).
  2. McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J. Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
  3. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75 Suppl (4), S34-S49 (2014).
  4. Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimers Res Ther. 6 (5), 64(2014).
  5. Gold, E. M., et al. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. RegenMed. 8 (4), 483-516 (2013).
  6. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  7. Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Front Neurol. , 5-12 (2014).
  8. Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Sci Rep. 10 (5), 11178(2015).
  9. Zhang, J., et al. Inhibition of monoacylglycerol lipase prevents chronic traumatic encephalopathy-like neuropathology in a mouse model of repetitive mild closed head injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 443-453 (2015).
  10. Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
  11. Lumpkins, K. M., Bochicchio, G. V., Keledjian, K., Simard, J. M., McCunn, M., Scalea, T. Glial fibrillary acidic protein is highly correlated with brain injury. J Trauma. 65 (4), 778-782 (2008).
  12. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  13. Liu, H., et al. Increased expression of ferritin in cerebral cortex after human traumatic brain injury. Neurol Sci. 34 (7), 1173-1180 (2013).
  14. Jordan, B. D., et al. The clinical spectrum of sport-related traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 9 (4), 222-230 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель Серийное Concussive Травмы головы у мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.