Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vivo модели для тестирования влияния гипоксии на метастазирование опухолей

12.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54532

⸱

9 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University Medical Center, 2Department of Nursing, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 3Department of Human Science, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 4School of Medicine, Georgetown University Medical Center, 5Department of Pathology and Neuropathology, Medical University of Gdańsk, 6Department of Oncology, Georgetown University Medical Center, 7Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи описывается разработка животной модели, которая позволяет напрямую проверять влияние гипоксии опухоли на метастазирование и расшифровывать механизмы ее действия. Хотя описанные здесь эксперименты сосредоточены на саркоме Юинга, аналогичный подход может быть применен и к другим типам опухолей.

Аннотация

Гипоксия была вовлечена в метастазирование саркомы Юинга (ЭС) клиническими наблюдениями и данными in vitro, однако прямых доказательств ее прометастатического эффекта нет, а точные механизмы ее действия неясны. В этой статье мы сообщаем о модели на животных, которая позволяет напрямую тестировать влияние гипоксии опухоли на распространение ЭС и исследовать основные пути вовлечения в процесс. Этот подход сочетает в себе две хорошо зарекомендовавшие себя экспериментальные стратегии: ортотопическую ксенотрансплантацию ЭС-клеток и лигирование бедренной артерии (FAL), которая индуцирует ишемию задних конечностей. Человеческие ЭС-клетки вводили в икроножные мышцы мышей SCID/бежевого цвета и позволяли первичным опухолям вырасти до размера 250мм3. На этом этапе либо вырезали опухоли (контрольная группа), либо животных подвергали ФАЛ для создания гипоксии опухоли с последующим удалением опухоли через 3 дня. Эффективность ФАЛ подтверждена значительным увеличением связывания гипоксизонда-1 в опухолевой ткани, тяжелым некрозом опухоли и полным ингибированием роста первичной опухоли. Важно отметить, что, несмотря на эти прямые эффекты ишемии, наблюдалось усиленное распространение опухолевых клеток из гипоксических опухолей. Эта экспериментальная стратегия позволяет провести сравнительный анализ метастатических свойств первичных опухолей одинакового размера, но существенно различающихся уровней гипоксии. Это также обеспечивает новую платформу для дальнейшей оценки механистической основы изменений, вызванных гипоксией, которые происходят во время метастатической прогрессии опухоли in vivo. Кроме того, хотя эта модель была создана с использованием ES-клеток, мы ожидаем, что эта экспериментальная стратегия может быть использована для проверки эффекта гипоксии при других саркомах, а также опухолях, ортотопически имплантированных в участки с четко определенным путем кровоснабжения.

Введение

Саркома Юинга (ES) является агрессивным злокачественности среди детей и подростков. 1 Опухоли развиваются в мягких тканей и костей, обычно в конечностях. В то время как наличие метастазов является наиболее мощным неблагоприятным прогностическим фактором для пациентов ES, механизмы, лежащие в основе их развития остаются неясными. 2 Опухоль гипоксия является одним из немногих факторов , вовлеченных в ES прогрессии. У пациентов, ES, присутствие не-перфузию областей в ткани опухоли ассоциируется с плохим прогнозом. 3 В пробирке, гипоксия увеличивает инвазивность ЭС клеток и запускает экспрессию про-метастатических генов. 4-6 Тем не менее, несмотря на эти линии доказательств, нет прямых доказательств для гипоксия-индуцированного ES прогрессии и распространения не существует. Кроме того, механизмы, с помощью которых гипоксия оказывает такие эффекты, в настоящее время, неизвестно. Таким образом, мы создали модель в естественных условиях , чтобы заполнить пробел между существующими в пробирке данные и клинической obserдений. Эта модель система позволяет осуществлять прямое тестирование последствий гипоксии на опухолях , происходящих в их естественной среде, с помощью магнитно - резонансной томографии (МРТ) , чтобы следовать прогрессии опухоли и метастазирование в естественных условиях в сочетании с экс естественных условиях патологических и молекулярных анализов (рисунок 1).

Так как не создана трансгенная модель ES в настоящее время доступна, исследования в естественных условиях на метастатических свойств этих опухолей полагаются на инъекции человеческих клеток в иммунодефицитом мышей. В то время как использование иммунологически обесцененных животных может недооценивать влияние иммунной системы на прогрессирование заболевания, способность использовать человеческие клетки увеличивает переводимость таких исследований. Среди различных моделей ксенотрансплантатов, системные инъекции в хвостовую вену легче всего выполнить, но они опускают начальные этапы клеточного intravasation опухоли и уйти от основного сайта роста. 7-12 С другой стороны, orthoto ПИК ксенотрансплантации, которая включает в себя инъекции опухолевых клеток в кости (бедренной кости, ребра) или мышц, является более технически сложными, но и более биологически отношение к раку человека. 13-16 Тем не менее, в прошлом, высокая заболеваемость , связанная с быстрым ростом первичных опухолей часто требовали эвтаназии животных до развития метастазов. В данном исследовании мы использовали ранее установленную модель клеточных инъекций в икроножной мышцы с последующим удалением полученной первичной опухоли в сочетании с продольным мониторингом метастатической прогрессии с помощью МРТ. 17,18 Такие инъекции в икроножной мышцы в непосредственной близости к большеберцовой кости позволяют для роста опухоли в двух природных средах - ES мышц и костей - и в результате отдаленных метастазов в местах , как правило , пострадавших в организме человека. 18 Таким образом, эта модель точно повторяет метастатического процессы , происходящие у больных ES во время прогрессирования заболевания.

палатка "> Локализация первичной опухоли в нижней задней конечности также облегчает точное управление кровоснабжения ткани опухоли. бедренную артерию лигирование (FAL) является хорошо отработанной технологией используется в исследованиях ангиогенеза, чтобы блокировать приток крови к дистальных отделах нога и исследовать васкуляризации тканей в ответ на ишемию. 19,20 Важно отметить, что первоначальное снижение кровотока сопровождается залоговой открытия сосуда и реперфузии тканей наблюдается примерно через 3 дня после FAL. 20 Таким образом, когда выполняется в несущей опухоль конечности, эта модель воссоздает гипоксия / реперфузии события , которые происходят естественным образом в быстро растущих опухолей и позволяет вылету метастатических опухолевых клеток вследствие восстановления перфузии к нижней задней конечности через вновь открытые коллатеральные сосуды. 21 Важно отметить, что эта процедура должна быть выполнена , когда размер опухоли достаточно мал, чтобы предотвратить чрезмерное гипоксию в контрольных опухолей (как правило, на несущей опухоль телячьей Volумэ 150 - 250 мм 3), что обеспечивает значительные различия в уровнях опухоли гипоксии между контрольной и FAL-обработанных группах.

В дополнение к продольной мониторинга влияния гипоксии на ES задержки и частоты метастазов, эта модель также позволяет осуществлять сбор тканей и развитие новых клеточных линий из обоих первичных опухолей и метастазов. Важно отметить, что предыдущие работы было установлено, что метастазы полученные из клеточных линий демонстрировать повышенную метастатический потенциал по реинтродукции животных, что свидетельствует о том, что распространение опухоли связано с постоянными изменениями в формировании опухолевого фенотипа клеток, и, таким образом, проверки использования этих клеточных линий расшифровывать процессов метастазирования. 18 Итак , эти модели теперь могут быть использованы для генетических и молекулярных анализов , необходимых для идентификации индуцированных гипоксией метастатических путей.

Как гипоксии является про-метастатического фактор повышения пагубность различных тumors, наша модель может быть использована в качестве платформы для изучения роли гипоксии в других типах опухолей, которые естественным образом развиваются в конечностях, такие как остеосаркома и рабдомиосаркома. 21-23 Кроме того, подобный подход может быть применен к злокачественных опухолей , растущих в других местах , с анатомическими четко определенного маршрута кровоснабжения. В конечном счете, модель может быть изменена, и ее полезность продлен, в зависимости от индивидуальных потребностей в области исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Джорджтаунского университета по.

1. Cell Подготовка к Ортотопическая Инъекции

  1. ЭС клетки культуры человека в стандартных условиях. Используйте примерно одну 15-сантиметровым культуральный планшет, не превышающую 70% сплошности для инъекции 5 мышей.
    Примечание: Для данного исследования, СК-ES1 клетки культивировали в 5A среде McCoy с 15% фетальной телячьей сыворотки (FBS) на коллагене покрытых пластин и клеток TC71 культивировали в среде RPMI с добавлением 10% FBS и 1% 4- (2-гидроксиэтил ) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES). Оба средства массовой информации были дополнены антибиотиками - пенициллином (100 ед / мл), стрептомицина (100 мкг / мл) и Fungizone (1 мкг / мл).
  2. Промывают клетки ES с фосфатным буферным раствором (PBS) и Trypsinize на 70% слияния с 0,25% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 5 мин.
  3. Удалить клетки ES из пластины с клеточной культуры Mediа, затем центрифугировать в течение 5 мин при 200g при комнатной температуре. Повторное приостановить клеток ES в 10 мл холодного PBS, а затем подсчитывают количество клеток.
  4. Центрифуга ЭС клетки в течение 5 мин при 200g при комнатной температуре, а затем вновь приостановить на 2 х 10 7 (SK-ES1) или 10 7 (TC71) клеток на мл в холодном PBS. Держите конечной суспензии клеток на льду во время выполнения инъекций.

2. Ортотопическая инъекция ЭС клеток в икроножной мышцы

  1. Используйте 4-6 недельных самок SCID / бежевых мышей.
  2. Для того, чтобы придать ЭС клеток, мягко держать мышь и стабилизировать свою левую ногу между четвертым и пятым пальцами, обнажая медиальной стороны нижней задней конечности.
  3. С помощью иглы 28 G ½, вводят 0,1 мл предварительно приготовленной суспензии клеток, содержащей либо 2 х 10 6 (SK-ES1) или 10 6 (TC71) ES клеток в икроножной мышцы (фиг.2А).
    Примечание: Хотя максимальный объем для внутримышечного инъекцections, как правило, 0,05 мл, для этой конкретной процедуре, увеличение объема до 0,1 мл необходимо из-за большого количества клеток вводили. Эта процедура была одобрена Institutional уходу и использованию животных комитета Джорджтаунского университета по.
    1. Вставьте иглу в икроножной мышцы кпереди примерно в 30 - под углом 45 градусов в направлении гребня большеберцовой кости / бугра.
    2. Слегка снять иглу, как только она касается гребня большеберцовой кости / бугристости. Медленно вводят раствора клеточной суспензии, постепенно извлечение иглы для сброса давления.
  4. Мониторинг вводили мышам в течение ближайших 24 часов на признаки бедствия.
    Примечание: Исследователи с меньшим опытом в обработке животных следует рассмотреть вопрос о обезболивающее мышей для инъекций опухолевых клеток. Некоторые учреждения могут потребовать анестезии по соображениям безопасности.

3. Мониторинг роста первичной опухоли

  1. Контролировать рост первичных опухолей dAily, пока размер опухоли не достигнет желаемого объема.
    Примечание: В настоящем исследовании, объем теленок 250 мм 3, использовали в качестве отправной точки эксперимента (Фигура 2В). Как правило, она занимает около 1 - 2 недели для опухоли, чтобы достичь такого размера.
    1. Измерьте размер теленка ежедневно с цифровыми измерителями через его медиальной-боковых и передне-задней длины.
    2. Определить объем теленка по формуле (Д ж ^ 2/6) х 3,14, где D является более длинный диаметр и d является более короткий диаметр несущих опухоль нижней задней конечности.
      Примечание: Размер нормального теленка взрослых мышей составляет приблизительно 40 - 50 мм 3. Его объем будет увеличиваться за счет роста опухоли и на более поздних стадиях теленок будет в основном состоит из опухолевой ткани.

4. бедренной артерии Лигирование (FAL) для индуцирования гипоксией в условиях опухолевого роста задних конечностей

  1. Подготовьте хирургические инструменты, необходимые для этой операции: текущвед или заостренные тонким пинцетом, заостренные щипцы, хирургические ножницы и держатель иглы. Стерилизовать эти инструменты перед операцией с использованием автоклава или горячего шарика стерилизатор. Кроме того, есть прекрасные ватные тампоны готовы к этой операции.
    Примечание: Рекомендуется, чтобы инструменты повторно стерилизуют при кончиков по мере необходимости во время процедуры.
  2. Вводят анальгетика (Карпрофен 5 мг / кг) подкожно (SQ). Для того, чтобы обнаружить и подтвердить, гипоксию, впрыснуть hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 мг / кг).
    Примечание: Эта доза соответствует 1,5 мг на мышь и достигается путем инъекции 0,1 мл 15 мг / мл раствора hypoxyprobe в PBS внутрибрюшинно (IP). Hypoxyprobe затем обнаруживается посмертных в тканях животных с помощью иммуногистохимии.
  3. Поместите мышь в наркоз индукционной камере, содержащей 3 - 5% изофлуран в 100% кислорода, при скорости потока 1 л / мин.
  4. Оставьте мышь в индукционной камере до тех пор, пока не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное из Induction камера. Поместите животное в положении лежа на спине на стерильной драпировки расположен на вершине согревающей площадку на рабочей поверхности. Используйте носовой конус, чтобы подключить его к непрерывному потоку 1 - 3% изофлуран в 100% кислорода при расходе 0,8 л / мин.
    1. Применяют стерильные немедикаментозным глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Тщательно депилировать хирургическую область, нанесите крем для удаления волос, оставляя его на коже в течение не более 10 сек. Затем вытрите крем для удаления волос с использованием этанола подготовительную площадку.
  5. Расширить и закрепить задней конечности с куском ленты примерно 45 градусов от средней линии мыши. После того, как задних конечностей безопасно, протереть пораженный участок кожи с 10% повидон / йода тампоном / раствор, затем этанолом, повторяя еще два раза каждый. В течение оставшейся части хирургической процедуры, использовать стерео микроскоп для получения увеличенного изображения области задней конечности.
  6. Используя острые щипцы и хирургические ножницы, надрезать в скв, длиной около 1 см, от середины бедра по направлению к паховой области. Использование засоленных увлажненных тонкой ватные тампоны, аккуратно смахнуть подкожно-жировой ткани вокруг мышцу бедра.
  7. Тщательно выявить основные бедренной артерии с помощью тупой диссекции через подкожной жировой ткани. Стабилизировать рану и операционное поле, чтобы выставить сосудистую верхне-средней части приводящей мышцы.
  8. Использование тонких щипцов, осторожно прокалывают через мембранозной бедренной оболочки подвергать сосудисто-нервного пучка. С помощью чистого набора тонких щипцов, рассекают и отделяют бедренную артерию из бедренной вены и нерва на проксимальном месте вблизи паховой области, дистальный к паховой связкой. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать прокалывания бедренной вены стенки.
  9. После рассечения, пройти прядь 6-0 шелковой нити под бедренную артерию и дистальнее ветви латеральной огибающей бедренную артерию (LCFA). Закупоривать бедренной артерии с использованием двойных узлов (рисунок 3).
  10. Закрыть разрез с помощью 6-0 полипропиленовых наложения швов. После закрытия надрез, вводят SQ 0,5 мл теплого физиологического раствора для баланса жидкости терапии. Место животное на вершине завернуто теплой площадку в клетке восстановления и непрерывно контролировать до бодрствования.
  11. Наблюдение за животными в течение первых 6 ч после операции и вводят анальгезирующее средство (Carprofen 5 мг / кг, SQ) каждый день в течение 3-х дней. Удалить швами 10 дней после операции с использованием стерильных ножниц.

5. Первичная Опухоль Иссечение по ампутации ноги

Примечание: ампутацию несущих опухоль нижнего задней конечности , когда размер теленок достигает 250 мм 3 для контрольной группы , или через 3 дня после FAL для гипоксического группы.

  1. Бритье волос от несущей опухоль конечности от дистальной большеберцовой кости к тазовой области с машинки для стрижки волос, осторожно держа животное. Вводят анальгетика (Carprofen 5 мг / кг, SQ) перед процедурой.
  2. Поместите мышь в анестезии индукции чянтарный, содержащий 3 - 5% изофлуран в 100% кислорода, при скорости потока 1 л / мин. Оставьте мышь в индукционной камере до тех пор, пока не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное от индукции камеры.
  3. Место животное в правом боковом лежачем положении на стерильной драпировки, помещенном на согревающего площадку на своей рабочей поверхности. Используйте носовой конус, чтобы подключить его к непрерывному потоку изофлюрана 1 - 3% в 100% кислорода при расходе 0,8 л / мин. Применяют стерильные немедикаментозным глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы
  4. Подготовьте место операции с использованием 10% повидон / йода тампон / раствор, затем этанолом, с повторением 3 раза. Нанесите стерильную марлю (например, хирургическое драпировку) над мышью , чтобы получить стерильный операционного поля.
  5. Сделать средней бедренной кости окружную разрез кожи, а затем тупым и втягивание кожи проксимальнее. Выставляют медиальной бедренной кости сосудисто-нервный ножку на срединный стороне ноги, а затем перевязатьрядом с паховой связки с использованием 4-0 с покрытием (полиглактином 910) рассасывающийся шовный материал.
  6. Выполните середины бедренной рассечение мышечных групп с ножницами, а затем тупым рассечением мягких тканей до тазобедренного сустава. Используя резак кости, выполнить середины бедренной остеотомии. С помощью стерильной тонкой ватным тампоном или губкой впитывающийся желатина, слегка нажмите на сайт остеотомии, чтобы свести к минимуму и предотвратить кровотечение.
  7. Закройте покрывающей кожи с помощью хирургической раны клипов и вводят 0,5 мл теплого солевого баланса SQ для инфузионной терапии. Место животное на вершине завернуто теплой площадку в клетке восстановления и непрерывно контролировать до бодрствования.
  8. После операции, собирают образцы тканей от первичных опухолей для РНК, ДНК или выделения белка, оснастки заморозить в жидком азоте и хранят при -80 ° С. Для получения первичной культуры клеток, собирают образцы ткани на этом этапе, как это описано в разделе 9 ниже. Закрепить оставшиеся ткани конечности в 10% нейтральном буферном формалине для гистологии и immunochemisпопробуйте, включая обнаружение hypoxyprobe-1.
  9. Монитор животных для передвижения, боли и потребления пищи в течение первых 6 часов после операции, а затем каждый день в течение 3-х дней. Вводят анальгетика (Carprofen 5 мг / кг, SQ) ежедневно в течение 3-х дней. Удалить раны клипы через 10 дней после ампутации, используя для удаления Рана клипа.

6. Мыши для мониторинга наличия метастазов

  1. Обратите внимание на мышей ежедневно, и оценивать их для клинических признаков метастазирования, по крайней мере два раза в неделю.
    1. Обратите внимание животных на наличие macrometastases, представляющих как массы, которые развиваются в различных местах, как правило, плечи контралатеральной ноги и челюсти. С этой целью, тщательно ощупывать головы, шеи и области подмышек и контралатеральной задних конечностей. Проверьте наличие метастазов внутренних органов через вздутие живота наряду с МРТ сканирования.
    2. Проверка на наличие метастазов в легких путем нажатия мечевидный отросток (нижний конец грудины) с незах пальцев. 24
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это давление уменьшает диафрагменное способность дыхания. Мыши с развитыми метастазами в легкие признаки дыхательной недостаточности проявляется кропотливой дыхания.
    3. Наблюдать за животными для неврологических симптомов, таких как паралич ног и атаксия предлагая метастазы в центральную нервную систему.
    4. Монитор мышей по крайней мере один раз в неделю для потери веса, как признак прогрессирования потенциального заболевания. Тело потеря веса более чем на 15% от предварительно процедурного веса считается гуманным конечной точки.

7. Магнитно-резонансная томография (МРТ) для обнаружения Метастазы

  1. Выполните МРТ для обнаружения метастазов в требуемых временных точках. 18
    Примечание: В данном исследовании был использован горизонтальный спектрометр 7-Тесла. МРТ проводили в дни 15 и 35 после ампутации для клеток SK-ES1 и на 15-й день для TC71 клеток.
  2. Поместите мышь в анестезии индукции ChambeR, содержащий 1 - 3% изофлуран в газовой смеси 30% кислорода и 70% закиси азота.
  3. Оставьте мышь в индукционной камере до тех пор, пока не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное от индукции камеры.
  4. Передача под наркозом мыши на стереотаксической держатель с дыханием и температуры monitorization с непрерывным введением 1,5% изофлуран и 30% закиси азота. Применяют стерильные немедикаментозным глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы. Изображение животного или в 40 или 23 мм Bruker объема мыши катушки для всего тела или визуализации головного мозга, соответственно в.
  5. Используйте двумерную, T2-взвешенные RARE последовательность: TR = 3000 мсек, TE = 24 мс, матрица = 256, FOV = 4,35 х 3,0 см, толщина среза = 0,5 мм, Rare коэффициент = 4 и средние = 4. 18
  6. Поместите животное в теплой клетке восстановления и непрерывно контролировать до бодрствования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши быстро восстанавливаться, так как неглубокий плоскость анестезии используется.
  7. Наблюдение за животными в течение первых 6 часов после того, как изображения, чтобы убедиться, что нет никаких побочных эффектов анестезии.

8. Эвтаназия и аутопсия

  1. Усыпить мышей один раз животных, присутствующих с метастазами обнаруживаемых с помощью МРТ и / или клинических симптомов прогрессирования заболевания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании мышей умерщвляли в дни 50 и 25 после ампутации для животных, несущих SK-ES1 и TC71 ксенотрансплантаты соответственно. В некоторых случаях, ранее эвтаназии было необходимо из-за высокой заболеваемостью метастаз.
  2. Усыпить мышей под воздействием CO 2 на уровне 1,5 л / мин (CO 2 на 10 - 30% от эвтаназии камеры объем / мин). Для обеспечения гибели животных, выполнять шейки дислокации после воздействия CO 2.
  3. Спрей всю мышь с 70% этанола и поместить его в ламинарный. Собирают кровь путем сердечной пункции с помощью иглы 25 G ½ с 1 мл шприца и передачи сбора крови втбыть, содержащий 2 мг ЭДТА.
  4. Соберите следующие ткани: селезенка, надпочечники, яичники, почки, печень, легкие, мозг, правая нога, костный мозг от обоих плечевые кости и позвоночника, а также макроскопических метастазов, присутствующих в других местах. 25,26
  5. Закрепить половину каждой ткани в 10% нейтральном буферном формалине для гистологии и иммунохимии, включая обнаружение hypoxyprobe-1. Привязка заморозить другую половину в жидком азоте, а затем хранят при -80 ° С для РНК, ДНК или белка изоляции. 25,26 Для получения первичной культуры клеток, собирают образцы ткани , как описано в разделе 9 ниже.

9. Первичные культуры клеток

  1. Для выполнения первичной культуры клеток, рассекают ткани от ампутированной конечности (раздел 5 выше), или во время аутопсии (раздел 8 выше) в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком.
  2. Подготовка среды для культивирования клеток, подходящие для клеточной линии, используемой для ортотопических инъекций, с добавлением пенициллина (200 ед / мл),стрептомицин (200 мкг / мл), Fungizone (1 мкг / мл), и 0,2% Mycoplasma профилактический антибиотик. Поместите 2,5 мл среды первичной культуры в 6-см клеточной культуральный планшет.
  3. Выберите жизнеспособные участки опухоли тканей от первичных опухолей или метастазов, а затем изолировать от двух до трех сегментов на 2-3 мм каждый с помощью стерильных ножниц.
    Примечание: жизнеспособные ткани опухоли обычно находится на краях опухоли и может быть различен с некрозом ее розоватого или красноватого цвета, значительный блеск и общий внешний вид влажного. В противоположность этому, некротические ткани обычно наблюдается в центре опухоли и представляет в виде беловато-кремового цвета / массы с тусклым, сырный внешний вид. 27
  4. Перенесите выделенные сегменты в 6-см для культивирования клеток планшет, содержащий первичную культуральную среду, описанную в шаге 9.2.
  5. Культуры клеток при стандартных условиях, как описано в разделе 1 (примечание) и 9.2. 18,28 Проверьте культуру для клеточного выроста , вытекающий из кусочков ткани, ВГIch должны наблюдаться в течение нескольких дней. После того, как клетки достигают слияния, Trypsinize и распространять их в соответствии со стандартными методами культивирования клеток.
    Примечание: Первичная культура клеток может быть в дальнейшем использован для оценки роста и метастатических свойств клеток, полученных из контрольных и гипоксических опухолей, а также их молекулярных характеристик, как было описано выше. 18

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После инъекции ES клеток в икроножной мышцы, первичные опухоли могут расти до размера теленка 250 мм 3 (фиг.1, 2). Время, необходимое для опухолей, чтобы достичь этого объема, как правило, находится в диапазоне от 10 - 15 дней для TC71 до 20-25 дней для SK-ES1 ксенографтов соответственно. Опухоли в объеме теленка 250 мм 3 демонстрируют относительно низкий уровень эндогенного гипоксии (приблизительно 3% опухолевой ткани), основанный на hypoxybrobe-1 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наша модель предполагает сравнение метастаза в двух экспериментальных группах - контрольной группы, где опухоли разрешено развиваться в задней конечности с последующей ампутацией при достижении объема теленка 250 мм 3, и гипоксия-облученной группе, в которой tumor- подшипник задней конечности подвергается FAL в том же объеме, с последующим отсечением через 3 дня. Даже если в этих опытах FAL-обработанные опухоли ампутированы с небольшой задержкой, по сравнению с контрольными опухолями, их размер не увеличивает...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH): UL1TR000101 (ранее UL1RR031975) через Программу клинических и трансляционных научных наград, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 и 1R21CA198698 JK. МРТ проводилась в Лаборатории доклинических исследований визуализации (PIRL) Комплексного онкологического центра Джорджтауна-Ломбарди, а обработка тканей — в Общем ресурсе гистопатологии и тканей Комплексного онкологического центра Джорджтауна-Ломбарди, оба поддержаны грантом NIH/NCI P30-CA051008. Авторы благодарят Дэна Чалоторна и Джеймса Э. Фабера из Департамента клеточной биологии и физиологии Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл за их помощь в проведении посмертной рентгеновской ангиографии, а также за предоставление знаний и опыта в области коллатерогенеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
SK-ES1 Клетки саркомы Юинга человека (ES)ATCC
TC71 Клетки ESЛюбезно предоставлено доктором Торецки
McCoy's 5A (модифицированный) MediumGibco от Life Technologies12330-031
RPMI-1640ATCC30-2001
PBSCorning Cellgro21-040-CV
FBSSigma-AldrichF2442-500mL
0,25% трипсин-ЭДТА (1x)Gibco by Life Technologies25200-056
Пенициллин-стрептомицинGibco by Life Technologies15140-122
Фунгизон® АнтимикотикGibco от Life Technologies15290-018
MycoZap™ ПрофилактическийLonzaVZA-2032
Коллаген типа I Крысиный хвост высокая концентрацияBD Biosciences354249
SCID/бежевых мышейHarlan or Charles River250 (Charles River) или 18602F (Harlan)
мл Инсулиновые шприцы со стационарно прикрепленными 28  G ½ иглаBD329424
физиологический раствор (0,9% натрия хлорид для инъекций, USP)Hospira, INCNDC 0409-7984-37
Цифровые штангенциркулиWorld Precision Instruments, Inc501601
Хирургические инструментыFine Science Tools
Римадил (карпрофен) Инъекционный Zoetis
Hypoxyprobe-1 (пимонидазола гидрохлорид твердый)HPI, IncHP-100 мг
гипоксизонд-2 (CCI-103F-250 мг)HPI, IncCCI-103F-250 мг
Повидон-йод ТампонPDIS41350
Стерильная спиртовая салфеткаFisher HealthCare22-363-750
LubriFresh P.M. (глазная смазка мазь) Major PharaceuticalsNDC 0904-5168-38
VWR Абсорбирующие пеленки с водонепроницаемым влагозащитным барьеромVWR56617-014 
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper с лезвием размера 50 Oster078005-050-002 (машинка для стрижки), 078919-006-005 (лезвие)
Nair Лосьон с детским масломChurch & Дуайт Ко., Инк.
Silk 6-0Surgical Specialties Corp752B
Проленовый (полипропилен) шовный материал 6-0Ethicon8680G Викрил
(полиглактин 910) шовный материал 4-0 EthiconJ386H
Аппликаторы Fisherbrand (очищенный хлопок)Fisher Scientific23-400-115
GelFoam Абсорбируемые стоматологические губки - размер 4Pfizer Pharmaceutical9039605
Autoclip Аппликатор для зажимов для ранBD427630
СтереомикроскопOlympusSZ61
Autoclipremover BD
Aound clipBD427631
MRI 7 TeslaBruker Corporation
Paravision 5.0 программное обеспечениеBruker Corporation
CO2 система эвтаназииVetEquip
25 G 5/8 Игла (для прокола сердца)BD305122
шприц 0,1 мл (для сердечный прокол)TerumoSS-01T
K3-EDTA Микропробирка 1,3 млSarstedt41.1395.105
10% нейтральный формалин с масломFisher ScientificSF100-4
человека 1427637

Ссылки

  1. Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
  2. Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
  3. Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
  4. Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
  5. Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372(2010).
  6. Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
  7. Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
  8. Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
  9. Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
  10. Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
  11. Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
  12. Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
  13. Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128(2014).
  14. Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
  15. Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
  16. Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
  17. Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
  18. Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
  19. Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
  20. Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
  21. Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
  22. Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
  23. Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
  24. Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
  25. Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
  26. Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
  27. Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
  28. Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
  29. Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
  30. ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Гипоксия опухолилигирование бедренной артерииортотопический ксенопересадкаклетки саркомы Юингаокрашивание Hypoxyprobe-1анализ метастазоврост первичной опухолиишемия конечностеймыши SCID Beige
В Vivo модели для тестирования влияния гипоксии на метастазирование опухолей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.