Методическая статья

Создание и пересадку жировой производные стволовых клеток (ASC) листа в диабетической заживление модели

DOI:

10.3791/54539

⸱

4 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жировой производные стволовые клетки (ИСС) легко изолированы и заготавливаемым от жира нормальных крыс. ASC листы могут быть созданы с использованием клеток лист инженерии и может быть пересажены в Цукер Диабетическая жирных крыс, экспонируется полный толщина кожице с подвергаются кости и затем покрытые бислой искусственной кожи.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Искусственной кожи добилась значительных терапевтических результатов в клинической практике. Однако искусственной кожи лечение ран у больных сахарным диабетом с затрудненного кровотока или большие раны может быть продлен. На основе клеток терапии появились как новый метод для лечения диабетической язвы, и инженерии клетки лист повысилась эффективность трансплантации клеток. Ряд докладов полагают, что жировая производные стволовых клеток (ИСС), тип мезенхимальных стромальных клеток (MSC), exhibit терапевтический потенциал благодаря их относительное изобилие в жировой ткани и их доступность для коллекции по сравнению с MSCs из других тканей. Таким образом ИСС, как представляется, быть хорошим источником стволовых клеток для терапевтического использования. В этом исследовании ASC листы из эпидидимальных жировой жира нормальной Льюис крыс были успешно созданы с помощью температуры отзывчивым культуры блюда и нормальной питательной среды, содержащих аскорбиновую кислоту. ASC листы были пересажены в Цукер Диабетическая жирные (ZDF) крысы, крысы модель типа 2 диабета и ожирения, которые демонстрируют снижение заживление ран. Рана была создана на поверхности задней черепной, ASC листы были пересажены в рану, и бислой искусственной кожи была использована для покрытия листов. ZDF крыс, которые получили ASC листы лучше ранозаживляющие чем ZDF крыс без пересадки ASC листов. Этот подход был ограничен, потому что ASC листы чувствительны к сухих условиях, требующих поддержания рану влажной обстановки. Таким образом искусственная кожа была использована для покрытия листа ASC для предотвращения высыхания. Аллогенной трансплантации ASC листов в сочетании с искусственной кожи также могут быть применимы к другим неразрешимыми язвы или ожоги, например теми, которые наблюдались с периферийные артериальные заболевания и заболевания коллагена и могут назначаться пациентам, которые страдают от недоедания или при использовании стероидов. Таким образом это лечение может быть первым шагом в направлении улучшения лечебные варианты для диабетической раны исцеления.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Численность населения диабетических пациентов растет по всему миру и достиг 400 миллионов в 2015 году1; примерно 15-25% пациентов с диабетом подвержены прогрессирование диабетической язвы нижней конечности2. Диабетические язвы нижней конечности неразрешимыми и могут потребовать длительного терапевтического с реабилитации учебных после полного выздоровления. В течение длительной терапии часто приводит к значительным снижением качества жизни пациентов. Таким образом необходимо разработать новые методы лечения, которые уменьшить или предотвратить обострение для лечения диабетической раны. Для оценки Диабетическая заживление ран, мы оптимизировали Диабетическая язва-заживление модель крыс, которая имитирует практических клинических условиях, и оцениваются ли пересадка жировой производные стволовых клеток (ASC) листы, используя ячейку листа инженерных Ускоренное заживление ран.

Мезенхимальные стромальные клетки (Майкрософт) (MSCs) демонстрируют превосходный потенциал для ускорения заживления ран из-за их способности самообновления, их иммуномодулирующие эффекты и их способности дифференцироваться в различные ячейки линий3. ИСС типа КБМ, полученные из жировой ткани, и они обладают рядом преимуществ перед MSCs, полученных от других тканей, в том числе их ангиогенных потенциал и паракринными деятельности4,5. Жировая ткань относительно обильные в человеческом теле, и его доступность позволяет коллекции с использованием минимально инвазивных процедур. Таким образом ИСС были использованы экспериментально для заживления ран приложения6,7.

Предыдущие доклады показали, что прямого впрыска одноклеточных MSC суспензий в районах вокруг раны могут ускорить заживления ран8,9. Однако несмотря на сообщения о ускорение заживления ран в моделях диабетической язвы после инъекции одноклеточных суспензий, выживание время пересаженные клетки на месте раны не ясно.

В этом исследовании мы применили инженерных ячейки листа с помощью температуры отзывчивым культуры блюда. Эти блюда имеют ковалентно связанными на их поверхности10температура гибкой полимерной N- isopropylacrylamide. Привитые полимерный слой позволяет температуры клеточной адгезии к или отрыв от поверхности культуры блюдо. Поверхность блюдо становится гидрофобные при 37 ° C, позволяя клеток присоединиться и размножаться, тогда как клетки спонтанно отсоединить от поверхности, когда она становится гидрофильным при температурах ниже 32 ° C. Культивируемых клеток могут быть собраны как смежные ячейки листа с нетронутыми в ячейке развязок и внеклеточной матрицы (ECMs) просто путем снижения температуры; Таким образом Протеолитические ферменты, которые повреждают ECM, например трипсина, являются не требуется11. Таким образом клетки лист можно сохранять соединения к ячейке инженерно -повысить эффективность трансплантации клеток.

Кроме того трансплантации клеток лист увеличивает выживаемость клеток по сравнению с инъекции клеток12. В этом протоколе Цукер диабетической жирных крыс (ZDF) были отобраны как тип 2 диабет и ожирение модель с замедленного заживления ран. ZDF крысы спонтанно развиваться ожирения на около 4 недель. Они затем разработка диабета типа 2 с ожирением между 8 и 12 недель возраста, в какой момент они демонстрируют гипергликемии, связанные с инсулин сопротивление, дислипидемии и гипертриглицеридемия13. Замедленного заживления, снижением кровотока в периферических кровеносных сосудов и диабетической нефропатии наблюдаются14,,1516. Кроме того ZDF крысы может быть подходящей моделью для изучения исцеление неразрешимыми кожные язвы, таких как диабетические язвы.

Различия между людьми и грызунов в заживление механизмы, связанные с анатомические различия в коже. Заживления ран в нормальных крыс основана на рану сужением, тогда как заживление ран в организме человека основывается на образование грануляционной ткани и эпителизация. Как правило раны шинирование, используемые в моделях грызунов помогает свести к минимуму спад раневой и позволяет для постепенного формирования грануляционной ткани17, хотя ран в nondiabetic крысы почти полностью закрыт путем сжатия. Однако, диабетической раны сужением в ZDF крыс нарушается, и ранозаживляющее прежде всего происходит через эпителизация и образование грануляционной ткани; Таким образом этот процесс является больше похож на человека ранозаживляющее14.

Диабетической раны с подвергаются кости после того, как хирургическая часто встречаются клинически. Предыдущие исследования изучили диаметром 12-мм полная толщина кожи раны на спине Атинические мышей ню18,19 и диаметром 10-мм полная толщина кожи раны на спине обычных мышей20. Разработка клинических модели для тяжелых диабетической раны, большие дефекты полный толщина кожи (15 x 10 мм2) с подвергаются кости и без надкостницы были созданы, как описано выше21, крыс, ожирения и диабета типа 2.

Крыса ASC (РЦР) листы из ИСС нормальной Льюис крыс были созданы путем аллогенной трансплантации ASC листов. В клинической практике аутологичной трансплантации является невозможным, потому что диабетических пациентов с язвами часто exhibit тяжелых осложнений диабета, например неконтролируемым высоким глюкозы в крови и высокое тело массы индексов и эти осложнения причиной ранозаживляющим расстройств увеличивают сложность получения жировой ткани из этих пациентов. Кроме того ИСС от животных с диабетом экспонат изменены свойства и нарушениями функции22. Таким образом протокол, представленные здесь описывает аллогенной трансплантации РЦАУ листов от нормальных крыс и применение искусственной кожи для диабетической крысы.

Бислой искусственной кожи, используемые в настоящем Протоколе предотвращает спонтанное сужением РАН, способствует синтезу новой соединительной матрицы и напоминает истинный дермы23. В настоящем Протоколе искусственной кожи помещается на листе РЦУР и фиксированной с нитки капроновые предотвратить рану сжатие или расширение, вытекающие из кожи свободные крыса. Кроме того искусственной кожи обеспечивает трехмерную основу для листов ASC, поддерживает влажной среде для пересаженных ASC листов и раны и защищает раны от инфекции и внешних сил. Наконец не клей Туалетная помещается на рану, чтобы защитить его от внешнего воздействия, поддерживать рану влажной среде и поглощать экссудатом.

РЦУР листа тонкий, гибкий и деформируемых и может выполняться перемещение получателей сайтов, таких как биение сердца24. Инженерии клетки лист был использован для восстановления различных тканей и может создавать лечебные эффекты25,26. ASC листы, которые демонстрируют клинический терапевтический потенциал может ускорить заживление раны многих видов. Кроме того аллогенной трансплантации ASC листов, в сочетании с применением искусственной кожи, могут быть применимы для лечения сложных язвы или ожоги, например теми, которые наблюдались в периферийные артериальные заболевания или заболевания коллагена, или они могут назначаться пациентам, которые страдают от недоедания или при использовании стероидов. Такой подход увеличивает эффективность трансплантации ИСС. Заживление ран ZDF крысы модель производит тяжелые раны условие, что напоминает человека процесс заживления и имитирует клинических условий в малогабаритных экспериментальных животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы экспериментов, представленные ниже, были одобрены Комитетом по благополучию животных Медицинского факультета Токийского женского медицинского университета и соблюдены все требования Руководства по надлежащему проведению экспериментов на животных.

1. Приготовление животных, инструментов, питательных сред и блюд

  1. Приготовьте полную питательную среду с использованием минимально незаменимой среды альфа, содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина. Храните в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C до использования.
  2. Используйте взрослых самцов крыс ZDF в качестве модели диабетического ожирения 2 типа. Используйте жировую подушку самцов крыс Льюиса, чтобы изолировать жировую ткань для подготовки клеточных листов.

2. Изоляция и культура rASC

  1. Получить жировую ткань от крыс Льюиса (8 - 33 недели, самец) под общей анестезией с использованием изофлурана.
    1. Подготовьте грызуну аппарат искусственной вентиляции легких и 4% изофлуран. Подготовьте несколько стерильных ватных наконечников, чистые марли, скальпель, иглодержатель, операционные ножницы, пару щипцов и нейлоновый шов 5-0. Стерилизуйте хирургические инструменты и принадлежности.
    2. Приготовьте 100-миллиметровую чашку Петри с 10 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) для временного сохранения полученной жировой ткани. Перед началом операции взвесьте чашку Петри с помощью PBS с помощью весов, чтобы измерить собранную жировую ткань. Разложите хирургические инструменты и принадлежности на стерильной простыне.
    3. Обезболивайте крыс с помощью изофлурана в концентрации 3-4% через аппарат искусственной вентиляции легких для грызунов и поддерживайте уровень изофлурана в 2-3% во время операции. Контролируйте глубину анестезии, наблюдая за глубиной и частотой дыхания каждой крысы.
    4. Надев стерильные перчатки, расположите крысу в лежачем положении на стерильной простыне. Выбрейте операционную область электрической бритвой и очистите брюшную полость крысы с помощью стерильной марли, смоченной в 70% этаноле.
    5. Сделайте разрез кожи длиной около 5 см с помощью скальпеля в боковой нижней части живота крысы. Обнажите и рассеките наружную косую мышцу. Затем обнажите жировую ткань придатка яичка, окружающую придаток яичка. Аккуратно вытяните жировую ткань придатка яичка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жировая ткань может быть получена с любой стороны брюшной полости крысы.
    6. Иссекайте только жировую ткань придатка яичка, не допуская повреждения придатка яичка, яичка и кровеносных сосудов придатка яичка (рисунок S1). Замочите иссеченную жировую ткань в PBS в чашке Петри, чтобы предотвратить сухость и утяжелить ткань.
    7. Закройте мышцу живота 5-0 ВИКРИЛОМ и кожу нейлоновым швом 5-0. Затем верните каждую прооперированную крысу в отдельную клетку (по одной крысе на клетку).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за крысами до тех пор, пока они полностью не выздоровеют.
  2. Выделите rASC из 2 - 3 г жировой ткани (вырезанной у крысы Льюиса и обработанной в соответствии с ранее описанным методом)27. Вкратце, ферментативно расщепляют иссеченную жировую ткань 0,1% коллагеназой типа А при 37 °С в течение 1 ч для получения стромально-васкулярной фракции (SVF; Рисунок S2).
    1. Приготовьте несколько 100-мкм клеточных фильтров, несколько 50-мл-пробирок, несколько 15-мл-пробирок и два скальпеля на биологически чистом скамейке. Включите центрифугу и прогрейте водяную баню до 37 °C. Кроме того, приготовьте примерно 50 мл стерильного PBS в пробирке объемом 50 мл с 0,1% (конечная концентрация) коллагеназы типа А.
    2. Измельчите жировую ткань на мелкие кусочки с помощью двух скальпелей.
    3. Переместите всю измельченную жировую ткань в пробирку объемом 50 мл и добавьте PBS, чтобы довести общий объем до 15 мл.
    4. Оставьте трубку объемом 50 мл в вертикальном положении на 5 мин. Выбросьте верхний слой и соберите нижний слой, за исключением мусора.
    5. Добавьте 0,1% раствора коллагеназы типа А в 50-мл пробирки с PBS, содержащей верхний слой, чтобы ферментативно переварить жировую ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подогрейте примерно 20 мл PBS на 2 - 3 г жировой ткани на водяной бане при температуре 37 °C.
    6. Наклоните и осторожно встряхните пробирку объемом 50 мл при 120–130 об/мин в течение 1 часа на водяной бане при температуре 37 °C.
    7. Положите пробирку объемом 50 мл в вертикальное положение на 5 минут после встряхивания.
    8. Отфильтруйте раствор с помощью клеточного фильтра 100 мкм и перелейте раствор в новую пробирку объемом 50 мл. Раздайте отфильтрованный раствор в две пробирки по 15 мл.
    9. Центрифугируйте раствор в пробирках объемом 15 мл в течение 5 минут при 700 x g. Аккуратно снимите верхний слой надосадочной жидкости и оставьте 5 мл нижнего слоя раствора. Не отсасывайте гранулы.
    10. Добавьте примерно 5 мл полной питательной среды в каждую 15 мл пробирки, до 10 мл на 15 мл пробирки и осторожно повторно суспендируйте гранулу.
    11. Повторите шаги 2.2.8 - 2.2.9. Затем получите SVF.
  3. Приготовьте два блюда по 60 см2 культуры. Соберите SVF после двух центрифугий при 700 × г в течение 5 минут. Суспензируйте SVF и нанесите 10 мл раствора SVF на каждую 60-сантиметровую чашку для 2 культур.
  4. Заквашивайте чашки в течение 24 ч при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2.
  5. Приготовьте PBS и 0,25% трипсин-этилендиамин тетрауксусную кислоту (ЭДТА), храните в течение нескольких месяцев при 4 °C до использования.
  6. После первоначального покрытия (24 ч) промойте элементы PBS 3 раза, чтобы удалить неприкрепленные элементы и мусор. Добавьте свежую готовую среду.
  7. Пройдите клетки, которые почти субсливаются на 3-й день. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 в течение 3 - 5 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Завершите этап трипсинизации в течение 10 минут, чтобы предотвратить повреждение клеток.
  8. Понаблюдайте за клетками под световым микроскопом после трипсинизации, чтобы убедиться, что все клетки основательно отделились от посуды. Затем добавьте в посуду 9 мл готовой питательной среды.
  9. Посчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
  10. Субкультивируйте клетки при плотности 1,7 х 10 по3 клетки/см2 каждые 3 дня до пассажа 3. Культивируйте субкультивируемые клетки при 37 °C во влажной атмосфере инкубатора с 5% содержаниемCO2.

3. Создание листов rASC

  1. Приготовьте несколько термочувствительных посуды для культур диаметром 35 мм. Предварительно покрыть чашки FBS (или полной средой, содержащей FBS) при температуре 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 в течение более 1 ч.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Чашка для культуры диаметром 35 мм, чувствительная к температуре, является коммерчески доступным продуктом.
  2. Подготовьте термопланшет и инкубируйте при температуре 37 °C для проведения следующих экспериментальных процедур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте каждую процедуру, используя чувствительные к температуре чашки для культивирования на термопластине с температурой 37 °C, чтобы предотвратить самопроизвольное отделение клеток от чашки.
    1. Перед экспериментом нагрейте всю питательную среду, используемую в процедурах, до 37 °C.
    2. Проход семян 3 rASCs, полученных от крыс Льюиса, на чувствительную к температуре культуральную чашку диаметром 35 мм с плотностью 1,5 x 10 5 клеток/чашку в течение 3 дней с использованием общего объема 2 мл полной питательной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда rASC помещаются на новую чашку для культуры, чашку следует медленно покачивать вперед и назад, влево и вправо в инкубаторе для достижения равномерного посева rASC и равномерной толщины листа rASC.
    3. Замените 2 мл среды на 2 мл полной питательной среды, содержащей 16,4 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты, фосфата магния, n-гидрата (АК), на 3-й день после посева в термотарелки с температурой и инкубированными на термопланшете при температуре 37 °C.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Растворенный АА может храниться при температуре -30 °C в течение нескольких месяцев.
    4. Культивируйте клетки в течение дополнительных 4 - 5 дней и заменяйте среду каждые 2 дня свежей средой, содержащей АК.
    5. Подтвердите пролиферацию и генерацию ASC под световым микроскопом, чтобы определить, образовались ли промежутки между клетками в непрерывном клеточном листе.
  3. Перенесите листы клеток из инкубатора на стол на 15 - 20 минут, чтобы охладить их до комнатной температуры; наблюдайте, как ячейки самопроизвольно отделяются в виде непрерывного клеточного листа. Соберите лист rASC с поверхности чашки с помощью пары щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно листы rASC можно обрабатывать с помощью пары щипцов. При необходимости можно использовать передаточную мембрану для переноса клеточного листа из чашки для культивирования в место раны, если клеточный лист хрупкий и хрупкий.

4. Подготовка модели раны с дефектом кожи на всю толщину и трансплантация листов rASC

  1. Подготовьте грызуну аппарат искусственной вентиляции легких и 4% изофлуран. Подготовьте несколько стерильных ватных наконечников, чистую марлю, нейлоновый шов 5-0, скальпель, надкостничный распатор, иглодержатель, операционные ножницы и пару щипцов. Стерилизуйте хирургические инструменты и принадлежности. Разложите хирургические инструменты и принадлежности на стерильной простыне.
  2. Приготовьте PBS и поддерживайте его при комнатной температуре вместе с небольшим количеством искусственной кожи и неадгезивной повязкой. Предварительно срежьте искусственную кожу (15 х 10 мм) и неадгезивную повязку (20 × 15 мм). Перед использованием искусственной кожи смочите внутренний слой коллагеновой губки искусственной кожи в физрастворе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Искусственная кожа состоит из двух слоев: внешнего слоя силиконового листа и внутреннего коллагенового спонжа.
  3. Используйте крыс ZDF (16 - 18 недель, самец, 500 - 600 г) в качестве ранозаживляющей модели при диабете 2 типа и ожирении.
  4. Обезболивание крыс ZDF путем ингаляции 4% изофлурана с использованием аппарата искусственной вентиляции легких у грызунов. Вызывайте анестезию с помощью изофлурана в концентрации 4-5% через аппарат искусственной вентиляции легких у грызунов и поддерживайте ее на уровне 3-4% во время операции. Контролируйте глубину анестезии, наблюдая за глубиной и частотой дыхания каждой крысы с помощью зажима пальца ноги.
  5. Надев стерильные перчатки, расположите крысу в положении лежа на стерильной простыне. Очистите голову крысы с помощью стерильной марли, смоченной в 70% этаноле, побрейте операционную зону электрической бритвой, а кожу после бритья очистите стерильной марлей, смоченной в 70% этаноле.
  6. Создайте квадратный дефект кожи во всю толщину (15 x 10 мм2) на голове крыс под наркозом ZDF путем удаления кожной ткани от эпидермиса к надкостнице. Иссеките кожу и кожную ткань скальпелем и удалите надкостницу с помощью надкостничного распатора.
  7. Непосредственно перед трансплантацией переместите rASC на 35-миллиметровой термочувствительной чашке для культивирования из инкубатора в среду комнатной температуры.
  8. Наблюдайте, как rASC на 35-миллиметровой термочувствительной чашке для культур самопроизвольно отделяются в виде листа от поверхности чашки после образования раны. Собирайте листы rASC после 7 дней культивирования на чувствительных к температуре посудах для культур. Удалите заквашенную среду и трижды промойте лист rASC с PBS. Замочите лист rASC в PBS до пересадки, чтобы предотвратить высыхание.
  9. Поместите лист rASC непосредственно на дефект черепа с помощью пары щипцов. Если клеточный лист хрупкий и хрупкий, мембрана может быть использована в качестве каркаса для переноса клеточного листа из чашки для культивирования в место раны.
  10. Накройте лист rASC и дефект с помощью искусственной кожи (15 x 10 мм2) и закройте рану примерно 10 швами с помощью нейлонового шва 5-0. Чтобы защитить рану, наложите на искусственную кожу неадгезивную повязку (20 x 15мм2) с использованием нейлоновых швов 5-0, чтобы сохранить раневую среду влажной и впитать экссудат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неадгезивные повязки будут удалены крысами ZDF в течение нескольких дней после нанесения. Поэтому необходимо регулярно наблюдать за крысами после трансплантации. Обычно неадгезивную повязку заменяют каждые 2 дня под общим наркозом.
  11. Верните каждую прооперированную крысу в отдельную клетку до полного выздоровления (по одной крысе в клетке). После периода наблюдения усыпить крыс с использованием утвержденного метода передозировки изофлурана.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол, пытались установить новый терапия на основе ячеек для неразрешимыми диабетической раны. Кратко (как показано на рис. 1) аллогенной РЦАУ листы были созданы из нормальных крыс с помощью инженерных ячейки листа и затем были пересажены с помощью бислой искусственной кожи на полный толщина кожи дефекта на диабетической крысы. Световой микроскоп изображения хорошим примером РЦАУ листа (рисунок 2A) и плохой пример РЦАУ листа (рис. 2B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важных шагов для успешного культивирования листа РЦАУ заключаются в следующем: 1) температура должна поддерживаться на приблизительно 37 ° C во время культивирования на блюда температуры отзывчивым культуры. В процессе создания листа РЦУР каждая процедура была выполнена на термо табличке, 37 ° C, и каждый реагент был разогрет до 37 ° C для предотвращения клетки от спонтанно отсоединение от блюдо31. 2) получателя ZDF крысы должны контролироваться для предотвращения удаления не клей соус, к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие Авторы раскрывают финансовых отношений, имеющих отношение к этой публикации: Теруо Окано является основателем и директором Совета клеток семян Inc., которая лицензирует технологии и патентов от Токио женщины медуниверситета, и Окано Теруо и Масаюки Ямато заинтересованных в клетки семян Inc. Токио женщины медуниверситета получает средства исследования от клеток семян Inc. Другие авторы заявляют, что они не имеют финансовых отношений, имеющих отношение к этой публикации.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят доктор Юкико Koga отделение пластической и реконструктивной хирургии, Juntendo школа медицины при университете, за предоставление практических рекомендаций. Мы также благодарим г-н Hidekazu Murata диабетический центр Токио женщин медицинской школы медицины университета за отличную техническую поддержку. Это исследование было поддержано создание инновационных центров для передовых междисциплинарных исследований области программы проекта для развивающихся инновационных систем «ячейки листа ткани инженерного центра (CSTEC)» от министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ) из Японии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
α-MEM глутамаксInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Пенициллин/стрептомицинLife Technologies15140-122
Коллагеназа АRoche Diagnostics10 103 578 001Мангейм, Германия
60 см<суп>2 Чашка для культуры тканей PrimariaBD Biosciences353803Франклин Лейкс, Нью-Джерси
Фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко (PBS)Life Technologies1490-144
0,25% трипсин-этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА)Life Technologies25200-056
L-аскорбиновая кислота фосфат магния соль n-гидратWako013-19641
35-мм термочувствительная чашка для культуры (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Токио, Япония
Микротеплая пластина (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Аппарат искусственной вентиляции легких для грызуновStoelting#50206Wood Dale, IL
4% изофлуранPfizer Япония114-13340-3Токио, Япония
Искусственная кожа (Pelnac® )Smith & ПлемянникPN-R40060  Токио, Япония
Неадгезивная повязка (Hydrosite plus® )Smith & Племянник66800679известен как Аллевин неадгессинг<суп>&рег; в США
5-0 нейлоновый шовный материалAlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBESgreiner bio-one227 261
15 мл центрифуга пробиркаCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEALHU-FRIEDYP14Чикаго, Иллинойс

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
  2. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
  3. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  4. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  5. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
  8. Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
  9. Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
  10. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
  11. Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
  12. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  13. Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
  14. Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
  15. Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
  16. Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
  17. Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
  18. Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
  19. McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
  20. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  21. Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
  22. Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
  23. Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
  24. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  25. Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  26. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  27. Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
  28. Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
  29. Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
  30. Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
  31. Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Zucker ZDF

Похожие статьи