Здесь мы представляем протокол, который облегчает среднюю и высокую пропускную функциональную характеристику генов и промоторных конструкций во вторичной ткани ствола дерева в сравнительно короткие сроки. Он эффективен, прост в использовании и широко применим к целому ряду пород деревьев.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование Индуцированные анализа соматической сектора (ISSA) для изучения генов и промоутеров, участвующих в формировании древесины и вторичного развития Stem
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вторичный рост стебля у деревьев и формирование связано древесины являются значительными как от биологических и коммерческих перспектив. Тем не менее, относительно мало известно о молекулярном контроле, который регулирует их развитие. Это отчасти из-за физического ресурса, и ограничений по времени часто было связано с изучением вторичных процессов роста. Ряд методов в пробирке были использованы с участием либо части растений или всей системы растений в обоих древесных и недревесных видов растений. Тем не менее, вопросы об их применимости для изучения процессов вторичного роста стволовых, Упорство некоторых видов и интенсивности труда зачастую непомерно высокой для средних и высоких приложений пропускной способности. Кроме того, при взгляде на развитие стволовых и древесины формирования вторичного специфические черты под следствием может стать только измеримы в конце жизненного цикла дерева после нескольких лет роста. В решении этих проблем альтернативы в естественных условиях рrotocols были разработаны, названный Индуцированные Анализ Соматические сектора, которые предусматривают создание трансгенных секторов соматические ткани непосредственно на вторичном стволе растения. Целью данного протокола является обеспечение эффективной, простой и относительно быстрые средства для создания трансгенного вторичной растительной ткани для гена и промотора функциональной характеристики, которые могут быть использованы в различных пород деревьев. Результаты, представленные здесь, показывают, что трансгенные вторичные стволовые секторы могут быть созданы во всех живых тканях и типах клеток во вторичной стебли различных пород деревьев и что дерево морфологических признаков, а также экспрессии промотора паттернов во вторичных стеблями можно легко оценить облегчение от средней до высокой пропускная способность функциональные характеристики.
Введение
Дерево стебли содержат значительное количество биомассы планеты и имеют огромное биологическое, культурное и коммерческое значение. Вторичные стебли создают среду обитания путем выделения ресурсов и приют для многих других форм жизни. Они доставляют множество других услуг экосистем, которые они населяют и выступают в качестве возобновляемого ресурса для производства лесной, целлюлозно-бумажной и других древесных и недревесных продуктов. Вторичное развитие стволовых и более конкретно формирование древесины определяется сложной молекулярной системы, которые регулируют развитие специфических типов клеток, биохимический состав их клеточных стенок и как они устроены с образованием тканей и органов. Анатомический молекулярную основу вторичного развития стебля и формирования древесины посрамлен многими факторами, включая изменчивость древесины и стволовых свойств внутри и между стеблями, продолжительным периодом генерации, Ауткроссинг соединяемые системы, высокая гетерозиготность, высокая генетическая нагрузка, сезонное пок, долгое зрелыйTrait периоды создания и чистой физический размер зрелых деревьев. В результате, понимание вторичного развития стволовых относительно детального знания большинства других аспектов молекулярного контроля развития растений, все еще находится в зачаточном состоянии.
Ряд методов в пробирке были использованы для изучения и понимания вторичное развитие стебля, в частности древесины и формирования вторичной клеточной стенки. Эти протоколы предусматривают использование целого растения или части растения систем, где либо трансгенные растения , созданные или специфические вторичные клетки или ткани , которые трансформируются для изучения конкретных аспектов древесины и / или развитие вторичного штока 1. Трансгенные растения могут быть восстановлены пост генетической трансформации из широкого спектра растительных тканей и типов клеток, однако, прогресс идет медленно, в частности, при анализе древесного волокна черты из-за длительного регенерации и времени созревания стволовых (в порядке лет), высокие технические и труда ДеманDS, низкая пропускная способность генов-кандидатов, а также трудности в распространении некоторых видов древесных растений. Аналогичные методы были разработаны в модельной системе недревесной , таких как Arabidopsis, успешно преодолеть некоторые из этих ограничений, но не все вторичные типы стволовых клеток в подарок в эти основы и черты характера , связанные с сезонностью или продолжительности жизни не могут быть изучены в таких видов 2. В качестве альтернативы, часть системы растений, такие как Pinu сек Радиата каллусных 3 уменьшить связанные временные рамки. Эти методы , однако, ограничивается изучением отдельного типа клеток и страдают подобными ограничениями , как отмечено для экспериментов в пробирке. Точно так же, вершинные стволовые культуры 4 с участием целых стволовых эксплантов показали обещание , но пока еще не применялись для изучения специфических генов или стимуляторы , представляющих интерес. Совсем недавно, альтернативный протокол с участием волосатых корневых культур была разработана для эвкалипты и успешно5 применяется, однако, этот метод еще требует культивирования в лабораторных условиях , включает в себя вторичные корни , а не стебли и на сегодняшний день оно ограничивается одним видом деревьев.
Индуцированные анализ соматической сектора (МАСО), как описано здесь, был разработан, чтобы преодолеть некоторые из этих проблем, обеспечивая при средней до высокой пропускной способностью инструмента функционального скрининга для генов и промоторов с подозрением на роли в формировании древесины и развития вторичного стволовых тканей. МАСО в естественных условиях трансформации и скрининга системы , которая была разработана , чтобы сократить время , необходимое для получения трансгенных клеток и тканей в интактном вторичного стебля, преодолевая рабочую силу, технические и ограничения пропускной способности обычно используются в методах лабораторных условиях . Описанные здесь протоколы позволяют для одновременного создания сотен независимо друг от друга трансформированных секторов тканей и клеток в вторичные стебли в течение короткого периода времени, в породам и интересующей ткани без гenetic и / или окружающей среды изменение в относительно короткие сроки и низкая стоимость рабочей силы. ISSA методы в естественных условиях впервые были описаны для вторичного стволовых 6 и бутон 7 тканей и с тех пор был усовершенствован во вторичной стволовых ткани с помощью исследований генов и / или промоторов , участвующих в камбиального дифференциации и включают в себя: тубулина (БТУ) , 8, fasciclin типа арабиногалактан ( FLA) 9, целлюлоза - синтазы (CESA) 10, вторичная клеточная стенка-ассоциированный домен NAC (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 и действительно интересный новый ген (КОЛЬЦО) H2 белка 13. Эти исследования были проведены в средних стеблей тополя и эвкалиптовых растений и поделились соображениями относительно морфологии клеток, химии клеточной стенки и экспрессии генов.
Протоколы, описанные здесь, предназначены, чтобы объединить опыт?го знания, полученные на основе разработки и применения МАСО из ряда опубликованных и неопубликованных исследований за последнее десятилетие. Они сосредоточены на трансформации в естественных условиях вторичных стволовых тканей 6 и сосредоточиться на исследованиях с участием клона тополь белый 'пирамидальный', эвкалипт шаровидный, а также 11 эвкалипт шаровидный х camaldulensis клонов. Этот документ принимает исследователей через протокол от выращивания растений и бактерий, трансформации стволовых тканей, роста и урожая ткани, идентификации трансгенных клеток и тканей, подготовка к фенотипическим оценок и методов для сбора и анализа данных. В то время как методы были успешно применены для измерения моносахаридную состав клеточной стенки также 9,11, из - за пространственных ограничений, этот документ концентрируется на методах , используемых для измерения клетки и морфологию ткани и для понимания паттернов экспрессии генов в средней сттолько СЭМ. В соответствии с этим протоколом, как указано подходит для тех, кто хочет, чтобы получить более полное представление о роли и / или экспрессии генов, связанных с вторичным стеблями с использованием низкой стоимости, технически простой и средней до высокой пропускной способности метода.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка растительного материала
- До начала экспериментов, поднять новые саженцы предпочтительных видов деревьев из семян или резки и расти дерево / с до тех пор, диаметр ствола в зоне, предназначенной для экспериментов составляет около 1 см в диаметре.
Примечание: Время, необходимое может варьироваться в зависимости от темпов роста растений, следовательно, позволяют от трех до девяти месяцев для этого шага.
2. Создание бинарного вектора
- Провести работу из этого раздела к разделу 7 в лаборатории или оранжерее , где Agrobacterium tumefaciens могут быть обработаны и что соответствующие индивидуальные средства защиты , предусмотренной для лаборатории используется.
- Подготовьте бинарный вектор, содержащий либо представляющего интерес гена нокдаун или сверхэкспрессии кассеты и β-глюкуронидазы (GUS) репортерного гена кассетой или интересующего промотора, слитый с геном GUS в зависимости от типа исследования.
Примечание: Есть целый ряд бинарного вектора BACkbones, которые могут быть получены на коммерческой основе или с помощью исследовательских сетей, а также многочисленных методов, доступных для вставки генов и промоторы, представляющие интерес в бинарные векторы. В контексте данного протокола к экспериментатору, чтобы принимать решение о том, как создать бинарный вектор. - Преобразование двоичного вектора в обезоруженный штамм A. tumefaciens с помощью электропорации или теплового шока 14 и хранить надлежащим образом до тех пор , пока необходимы для проведения экспериментов.
- Повторите шаг 2.2 для любого положительного и / или отрицательного контроля.
Примечание: Отрицательные элементы управления должны включать в себя бинарный вектор, не содержащий ген интерес для интересующего гена исследования и промотора GUS для интересующего промотора исследования. Положительный контроль за промотором процентного исследования должны включать вируса мозаики цветной капусты (промотор 35S CaMV35S), слитый с GUS репортером.
3. Подготовка А. tumefaciens для модифицирования
- По крайней мере, за неделю до EXPERimentation, возьмите небольшое количество (около 1 мкл) А. tumefaciens подготовлен на этапе 2.2 и 2.3 и распылены на отдельной среде LB с агаром 14 пластин , содержащих соответствующие антибиотики для бактериальной селекции. Grow при температуре 28 ° С в термостате с образованием малых колоний и затем хранят при температуре 4 ° C до тех пор, пока это необходимо.
- 48 часов до эксперимента, передать одну колонию А. tumefaciens от каждой пластины на отдельные 50 мл с крышкой пробирки , содержащие 5 мл подогретого (28 ° С) с LB сред 14 , содержащий соответствующие антибиотики для бактериальной селекции и не перемешивать со скоростью 200 оборотов в минуту на шейкере инкубаторе в течение приблизительно 48 часов при 28 ° С до тех пор , смесь очень мутным.
- Между 4-6 ч до инокуляции стеблей растений (раздел 4) добавляют 1 мл LB / A. tumefaciens смесь в свежий 50 мл с завинчивающейся крышкой трубки , содержащей 19 мл (1:20 разведение) свежей теплой (28 ° C) LB среды с соответствующими антибиотикамибактериальная выбор. Если оптическая плотность (ОП) при 600 нм (OD 600, как измерено с помощью спектроскопии) больше 0,1, разбавленных в дальнейшем с теплым LB , пока это не будет достигнуто.
- Поместить разведенный LB / A. tumefaciens смесь обратно на шейкере инкубаторе и встряхивают при тех же условиях (200 оборотов в минуту, 28 ° С) до OD 600 между 0.4-0.6 и удалить.
- Центрифуга LB / A. tumefaciens смесь в течение 15 мин при 1000 х г и 4 ° С.
- Слейте жидкость и сразу ресуспендирования А. tumefaciens осадок в 1 мл охлажденного MS носителя 15, передают в 2 мл микропробирок и хранить на льду , пока не потребуется для прививки (раздел 4). Это решение называется Прививка Media.
4. Прививка завод стволовых с А. tumefaciens
- Начало экспериментирования в конце весны или в начале лета, используя растения, созданные в разделе 1, которые имеют активную и быстро растущую камбий. Хорошим диагностическим признаком дляактивный и быстро растущий камбий является то, что флоэма может быть легко отслаивается от ксилемы.
- Найти четкий прямой участок стебля у основания растения и удалить все листья и ветви.
- Используя острый скальпель (предпочтительно № 11) или лезвие бритвы, создать 1 см 'окно камбиальный' 2 в свободном сечении ствола путем введения двух параллельных вертикальных надрез через флоэмы 20 мм в длину и один 5 мм друг от друга то горизонтальный срез, который соединяет две вертикальные надрезы на их базальной конце.
- Пил флоэма полоса создана надрез вверх подвергая развивающиеся ксилемы ткани и добавить достаточное количество инокуляции носителя со стадии 3.6, чтобы смачивать поверхность открытой развивающейся ксилемы с помощью пипетки (обычно 5-10 мкл). Сразу вставьте флоэмы полосу.
- Свяжите флоэмы полосу к штоку плотно парафильмом.
- Повторите шаги 4.2 до 4.5 для любых дополнительных камбиальными окон для гена (ов) или промотор (ы), представляющие интерес создаваяюбые новый камбиальные окна не менее 1 см выше или ниже других окон камбиальных и при 90 ° офсет.
- Выполните шаги 4.2 до 4.5 для векторов положительного и отрицательного контроля (шаг 2.4), гарантируя, что каждый вектор добавляется к той же основы каждого растения, используемого в эксперименте.
- Монитор роста диаметр ствола и периодически жатву для GUS анализа (раздел 5), когда радиальный рост не менее 5 мм наблюдается в стеблях.
Примечание: Величина радиального роста необходима зависит от количества ткани, необходимой для анализа вниз по течению.
5. Заготовка для GUS гистологического Пробирной
- Вырежьте 'камбиального окно' из ствола удаление любой ткани не является частью нового роста в окне камбия.
- Для исследований, относящихся к зрелой ксилемы и флоэмы морфологии клеток / тканей, кожура флоэмы из ксилемы.
- Для исследований, где требуется зона камбия оставаться нетронутыми или промоторные паттерны экспрессии должны быть оценкие изд, нарезать камбиальный окна в поперечном направлении с помощью лезвия бритвы или другим острым лезвием в диски от 0,5 до 1 мм толщиной.
- Поместите обработанные камбиальные ткани окно в 14 мл круглодонных пробирки и прополоскать дважды в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7 14. Убедитесь , что ткань полностью погружен, остается в растворе в течение по меньшей мере пяти минут , а весь избыток раствор удаляют в конце второй полоскание.
- Добавьте 5 мл GUS реагента (0,5 мМ Х-Gluc (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуроновой кислоты), 10 мМ ЭДТА, 0,5% Тритона Х-100 об / об, 0,5 мМ калий феррицианида (III), 0,05 мМ ферроцианида калия (II), доводили до конечного объема с помощью 0,1 мМ фосфатный буфер с рН 7, см . Hawkins и др 16) в каждую пробирку. Если ткань не полностью погружен, добавить дополнительный реагент GUS.
- Инкубируйте пробирки в течение 10 мин при 55 ° C в темноте.
- Инкубируйте пробирки для дальнейшего 12-16 часов на шейкере инкубаторе при температуре 37 ° С в темнотеиспользуя легкое перемешивание (от 30 до 60 оборотов в минуту), чтобы обеспечить перемешивание.
- После удаления из шейкера инкубатора случайным образом проверить рН реагента GUS в небольшой части труб с помощью лакмусовой бумаги с диапазоном рН 0-7.
- Если какой-либо из трубок имеют рН ниже 6 затем маркировать их. Продолжайте проверять остаток трубок, чтобы подтвердить рН и этикетку, если рН 6 или ниже.
Примечание: Образцы с рН ниже 6 не могут быть пригодны для анализа. Эти образцы должны быть исключены из дальнейшего анализа.
- Если какой-либо из трубок имеют рН ниже 6 затем маркировать их. Продолжайте проверять остаток трубок, чтобы подтвердить рН и этикетку, если рН 6 или ниже.
- Слейте реагента GUS и заменить с достаточным количеством 70% этанола, чтобы покрыть ткань.
- Хранить при температуре 4 ° С до тех пор, пока это необходимо.
6. Определение трансгенной ткани
- Использование щипцов, вынуть все камбиальный окна ткани из трубки и поместить в небольшой поднос или чашку Петри, чтобы обеспечить микроскопической визуализации.
- Использование рассекает микроскопа между 1X и 4X увеличением, идентифицировать и подсчитывать количество клеток или тканейкоторые имеют ярко-синее окрашивание. Синие окрашивали клетки или ткани, называются как сектор с этого момента. Tally их следующими способами.
- Для образцов , где флоэма была удалена (этап 5.1.1), подсчитать количество секторов в камбия ткани , найденной на поверхности развивающегося ксилемы (камбиального сектора, рис 1а).
- Для образцов , которые были вырезаны на диски (этап 5.1.2), подсчет секторов число , найденное в различных клеток или тканей типов (рис 1b, 1c, 1d). Секторы могут быть найдены в следующих типах тканей: перидермы (перидермы сектора, рис 1e), флоэмы (Флоэма сектора, Рисунок 1F), камбиальный ткани (камбия сектор, рис 1 г, 1 ч, 1I), раневой паренхимы (Wound Паренхима сектор, Рисунок 1j) и в tyloses (Tylose сектор, Рисунок 1k).
- Во время микроскопического аssessment обеспечить, чтобы обе стороны диска были просмотрены и что секторы, которые происходят на двух дисков совпадают, так что цифры не будут завышенными.
- Поместите только ткань, содержащую секторы обратно в пробирку, содержащую 70% этанола и хранят до тех пор, пока это необходимо.
- Повторите шаг 6,1 до 6,3 для любых дополнительных камбиальными окон, включая положительного и / или отрицательного контроля.
- Рассчитывают среднюю эффективность преобразования для каждого типа сектора для каждого гена или интересующего промотора и управления по отдельности путем деления общего количества секторов на общее количество 1 см 2 камбиальными окна , чтобы получить среднее число трансформации событий на см 2 камбий Инокулировали (ATScm -2).
- Перейдите к шагу 7.2 и 8 для анализа паттернов экспрессии промотора и шаг за шагом 7.1, 7.2 или 7.3 методики оценки клеток и морфологии тканей в камбиального ткани.
7. АнализКлеток и тканей Морфология в камбиальных тканей
Примечание: Ниже приведены выбор методов, которые были успешно использованы для анализа МАСО полученных образцов.
- Анализ области ксилемы клеток, площадь светового потока, толщины клеточной стенки и области клеточной стенки с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM).
Примечание: Этот протокол требует минимальной подготовки образцов и позволяет при относительно высокой пропускной способности анализа сектора, касающейся морфологических признаков, изложенных.- От этого шага вперед, пожалуйста, убедитесь пальто лаборатории, средства защиты глаз и перчатки используются всякий раз, когда древесный ткань обрабатывается и обрабатывают.
- Определить камбиальный сектор для анализа и сделать надрез приблизительно 0,5 мм по обе стороны от него с помощью одного края лезвия бритвы , чтобы создать диск (рис 2а).
- Обрежьте излишки ткани ксилемы оставляя около 1 мм ксилемной ткани касательной стороне сектора (рис 2b).
- ОсторожныйLY разрезать в поперечном направлении через центр сектора с использованием свежей двойной кромки лезвия бритвы (рисунок 2в).
- Сделайте два дополнительных неглубоко радиальных надрезов на поперечной плоскости обе стороны от сектора разграничить трансгенной ткани (рис 2d). В качестве GUS-окрашивание не будет проникать глубоко в ткани следуют вдоль радиальных файлов клеток в любую сторону от окрашенного ткань, находящаяся на поверхности камбия.
- Приложить подготовленную поверхность камбиального сектора до стадии с контактным шлейфом СЭМ крепление с помощью СЭМ проводящую ленту (рис 2E) и сохранить в эксикаторе , пока это необходимо для визуализации SEM.
- Повторите шаги 7.1.2 7.1.6 для любых дополнительных секторов, включая те из отрицательного контроля.
- С помощью сканирующего электронного микроскопа в режиме низкого вакуума (энергия 5 кВ, пятно 3,0 нм), визуализировать и сфотографировать клеток / ткани в секторе, а также клетки / ткани непосредственно примыкает сектор (рис 2F). Сумма увеличениязависит от особенностей, представляющих интерес. Для ксилемы волокон, 2,000X подходит (рис 2 г).
- После того, как камбиального сектор визуализированы и фотографии, сделанные при соответствующем увеличении, измерения ксилемы клеток / тканей морфологические черты, представляющие интерес с помощью изображения измерительного программного обеспечения.
- Для статистического анализа, проведение множественных парных анализа с использованием двойного Т-теста для сравнения разницу между морфологическими измеренным в трансгенной секторе и прилегающей к ней нетрансгенной контрольными клетками / тканью (измеряется в пределах 0,5 мм от края сектора) для каждого сектора, чтобы определяют р -стоимость.
- Повторите шаг 7.1.10 для отрицательного контроля.
- В тех случаях, когда положительный контроль показывает низкое значение р (а <0,05), вычисляют разность между трансгенными и прилегающей к нему нетрансгенные клеток / ткани для морфологического признака. Используйте это 'значение разности' в непарный т-тест, чтобы сравнить эффект интересующего гена с negatив контроль, чтобы определить значение р.
- Гистохимическая анализ камбия клеток / морфологии ткани или экспрессии промотора образцов стволовых клеток / тканей с использованием световой микроскопии.
Примечание: В то время как больше времени, этот метод позволяет больше вариантов анализа , включая аспекты динамики камбиальных, например, камбиального ширины, а также паттернов экспрессии промотора. Кроме того, если не в состоянии получить доступ к сканирующего электронного микроскопа, этот протокол может быть использован в качестве альтернативы для шага 7.1.- Акцизный сектор интереса , используя лезвие бритвы и некоторые окружающие ткани в виде небольших блоков (не более 1 мм 3) и место непосредственно в 1-3 мл 100% этанола в пробирку с завинчивающейся крышкой в течение не менее 2 дней при температуре 4 ° С на шейкере. Подготовьте небольшой блок таким образом, который обеспечит поверхности интерес к получить доступ микротома.
- Повторите эти действия для любых дополнительных секторов, включая те из отрицательного контроля.
- Удалите жидкость и заменить 25% этанол: 75% LR белая смесь в течение 2-х дней поддерживались условия.
- Повторите шаг 7.2.3 с 50% этанола: 50% LR белый, 25% этанол: 75% LR белого, а затем, наконец, дважды с 100% LR белый.
- Поместите небольшой блок в Встраивание Mold с поверхностью интереса к выровненной короткого конца и тщательно покрывают свежим LR белый и полимеризуется в соответствии с инструкциями производителя.
- Вырезать 5 мкм срезах из выбранной поверхности на роторном микротоме и крепление на предметном стекле. С помощью окрашивания Safranin O (0,01%), чтобы визуализировать клеточную стенку, и / или другие функции.
- Добавить монтажные средства массовой информации, место покровное стекло и позволяют установить в течение ночи.
- Просмотр под световым микроскопом между 100X и 600X увеличения и захвата изображения.
- Захват морфологические черты от изображений с помощью измерительного изображения программного обеспечения.
- Для статистического анализа количественных морфологических признаков, следуют на шаге от 7.1.10.
- Для качественного анализа морфологических признаков,сравнить и описать закономерности, наблюдаемые для гена или интересующего промотора, а отрицательный и / или положительного контроля.
- Анализ микрофибрилла Угол (MFA) в мацерированного волокнах с использованием световой микроскопии.
- Акцизной трансгенный ксилемы ткани непосредственно из сектора, а также из не-трансгенной ткани , прилежащей к ней ( в пределах 0,5 мм, рис 2h), поместить в отдельные 1,5 мл пробирки. Повторите эти действия для любых дополнительных секторов, включая те из отрицательного контроля.
- Выполните шаги 7.3.3 на 7.3.5 в вытяжном шкафу.
- Добавьте 250 мкл перекиси водорода и 250 мкл ледяной уксусной кислоты в каждую пробирку.
- Поместите трубку в тепловой блок при температуре 90 ° С в течение 2 часов в вытяжном шкафу.
- Удалите ткань из пробирки и тщательно промыть дистиллированной водой, по крайней мере в два раза.
- Использование водорастворимого монтажный носитель, крепление ткани на предметное стекло и дразнят друг от друга с острыми щипцами до наложения покровное стекло.
- Посмотретьпод световым микроскопом и захвата изображений отдельных волокон при увеличении более чем 400X.
- Для определения угла микрофибрилла волокон, измерить угол между пит отверстий и / или клеточной стенки бороздок и длинной оси волокна (рис 2i) с использованием изображения измерительного программного обеспечения.
- Для статистического анализа, следуют дальше от стадии 7.1.10.
8. Анализ Promoter паттерны экспрессии
- Анализ промоторных паттерны экспрессии во вторичных стволовых тканях.
- Подсчитывать частоту каждого типа сектора для интересующего промотора, а также положительным и отрицательным контролем, как отмечено на этапе 6.2.2.
- Сравните частоту различных типов сектора для интересующего промотора с положительным контролем с использованием критерия хи-квадрат тесты для установления р-значения. Дальнейший анализ специфичности клеток / тканей может проводиться с использованием шага 7.2 по мере необходимости.
- Если более чем один промоторинтерес исследуется затем повторить это сравнение делает анализ между всеми промоутерами интересов и положительного контроля.
- Если секторы или синее окрашивание наблюдается в отрицательном контроле , то добавьте к этому анализу или отказаться в зависимости от степени или при подозрении на эндогенное окрашивание (см Обсуждение).
- Анализ промоторных паттернов экспрессии Во время камбиального производного развития и дифференциации.
- Использование рассекает микроскоп, визуализировать все камбиальный секторов (рис 1g, 1h, 1i) , идентифицированные на шаге 6.2 , и определяют наличие / отсутствие синего окрашивания в трех типах тканей , полученных из камбия; флоэма (P), развитие ксилемы (X1) или развитую ксилемы ткани (X2) (рис 3а).
- В каждом шаге 8.1.2, сравните частоту наличия / отсутствия GUS окрашивания в Р, X1 и X2 областей промотора Interest с положительным контролем с использованием критерия хи-квадрат тесты для установления р-значения. Дальнейший анализ специфичности клеток / тканей может проводиться с использованием шага 7.2 по мере необходимости.
- См шаги 8.1.2.1 и 8.1.2.2 для дополнительных соображений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя этот протокол все живые вторичные стволовых клеток и тканей типа были , как было показано , чтобы быть восприимчивы к A. tumefaciens преобразований и определены в типах сектора на основе типа клеток , первоначально преобразованной и оно последующего развития модели роста. Типы сектора включают перидермы, флоэмы, камбия, раневой паренхимы и тилозу (рисунок 1b, 1c, 1d) и могут быть найдены в местах , соответствующие опис...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол МАСО является относительно простой и эффективный метод для создания трансгенных стволовых тканей в древесных пород в пространстве нескольких месяцев для анализа генов и промоутеров, представляющих интерес, участвующих в древесине и стволовых образование. Немного усилий, за сохранение растений в живых, требуется выращивать трансгенный стволовых тканей после прививки , которая стоит в отличие от методов в пробирке , где обширное культивирование требуется для поддержания ткани или растений, где производст...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность за финансовую поддержку аспекта работы через Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) и LP0211919 (GB) и отраслевых партнеров Sappi и Mondi, а также Австралийскую премию для аспирантов (EM) от Австралийского исследовательского совета и премию для молодых новаторов и ученых через Австралийское министерство сельского хозяйства (LT). Мы также хотели бы поблагодарить Зандера Майбурга, Цин Вана, Коллин Макмиллан и Саймона Саутертона за многочисленные обсуждения и идеи, которые они выдвинули во время разработки этого протокола, а также Мартина Раника, Миника Де Кастро, Хулио Нахеру, Валери Фрассиан, Анжелику Мануэль и Ноэми Дефе за помощь в лабораторной работе.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Растения | NA | NA При | необходимости проконсультируйтесь с местными поставщиками питомников о растениях |
| Штамм агробактерий | NA | NA | Существует множество возможных способов получения штаммов Agrobactrium. Мы рекомендуем вам проследить за ситуацией в вашем местном исследовательском сообществе, поскольку в вашей стране и регионе могут быть ограничения на получение бактерий. |
| Бинарный вектор (ген и промотор) | NA | NA | Мы разработали ряд векторов для протокола ISSA с использованием системы Gateway Recombinase. К ним относятся сверхэкспрессия, нокауты РНК-интерференции и векторы слияния промоторов на основе модифицированных векторов pCAMBIA и с удовольствием предоставленные по мере необходимости. Кроме того, существует множество векторов, доступных для исследовательского сообщества. |
| LB media | Sigma | L3022 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| LB media с агаром | Sigma | L2897 | Аналогичный продукт может быть получен от другой компании |
| Антибиотики | Sigma | NA | Каталожный номер будет зависеть от антибиотика, который вам нужен, так как ряд антибиотиков используется для бактериального отбора в бинарных векторах. Этот продукт может быть получен от a ассортимент компаний |
| 50 мл Пробирки с завинчивающейся крышкой | Fisher Scientific | 14-432-22 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| 2 мл Микропробирка | Watson Bio Lab | 132-620C | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| MS | Media Sigma | M9274 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| Лезвие скальпеля No 11 | Sigma | S2771 | Этот же продукт может быть получен от другой компании |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | Это лучший продукт для использования для привязки камбиального окна после создания |
| 14 мл тубы с круглым дном | Thermo Scientific | 150268 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| EDTA | Sigma | E6758 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| Triton | Sigma | X100 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| X-Gluc | X-GLUC напрямую | Вам нужно будет зайти на сайт для заказа - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Феррицианид калия(III) | Sigma | 244023 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| Ферроцианид калия(II) | Sigma | P9387 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| Лезвие для бритвы с одним лезвием | ProSciTech | L055 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| Лезвие для бритвы с двумя лезвиями | ProSciTech | L056 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| Образец флакона с завинчивающейся крышкой | ProSciTech | L6204 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| Ethanol | sigma | E7023 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| LR белый | ProSciTech | C025 | Тот же продукт может быть получен от другой компании |
| Embedding Mold | ProSciTech | RL090 | Мы рекомендуем этот сорт, однако существует множество доступных вариантов |
| Водный Соулable монтажный материал | ProSciTech | IA019 | Один из примеров монтажного носителя, который можно использовать, однако существуют и другие варианты, которые можно изучить. |
| Перекись водорода | Sigma | 216763 | Аналогичный продукт может быть получен от другой компании |
| Ледяная уксусная кислота | Sigma | A9967 | Аналогичный продукт может быть получен от другой компании |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | Аналогичный продукт может быть получен от другой компании |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | Этот инструмент использовался в рамках данного исследования, но можно использовать любой другой SEM, который работает в режиме низкого вакуума. | |
| Программное обеспечение | можно получить по следующему URL-адресу http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Ссылки
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
