Методы продемонстрированы для выделения САУ миоцитов (Sams) от взрослых мышей для патч зажим электрофизиологии или визуализации исследований. Выделенные клетки могут быть использованы непосредственно или могут быть сохранены в культуре, чтобы обеспечить экспрессию белков, представляющих интерес, таких как генетически кодируемых репортеров.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Методы изоляции, культуры и функциональная характеристика САУ миоцитов от взрослых мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
САУ миоциты (Sams) действуют как естественные кардиостимуляторы сердца, инициируя каждым ударом сердца путем генерации спонтанных потенциалов действия (APS). Эти кардиостимуляторов точки доступа отражают согласованную деятельность многочисленных мембранных токов и внутриклеточного кальция езды на велосипеде. Однако точные механизмы, которые управляют спонтанное кардиостимулятора активности в SAMs остаются неуловимыми. Остро изолированные SAMs являются существенной подготовки для экспериментов рассекать молекулярной основы сердца pacemaking. Тем не менее, нечеткие анатомия, комплекс микродиссекции и привередливые ферментативные условия пищеварения предотвратили широкое применение остро изолированной ЗУР. Кроме того, методы не были доступны до недавнего времени, чтобы обеспечить долгосрочную культуру SAMs для экспрессии белка исследований. Здесь мы предлагаем протокол и демонстрации видео шаг за шагом для выделения SAMs от взрослых мышей. Способ также демонстрируется для поддержания взрослой мыши Sams в пробирке и для Expressiна экзогенных белков через аденовирусной инфекции. Остротоксичные выделяли и культивировали МССП, приготовленные с помощью этих методов пригодны для различных электрофизиологических и визуализации исследований.
Введение
Кардиостимулятор миоциты в САУ сердца (синусовый миоциты, "SAMs") порождают спонтанные, ритмические потенциалы действия (AP), которые распространяются через миокард инициировать каждый сердцебиение. Эксперименты с использованием остро изолированных Sams из многих видов были необходимы для выяснения механизмов, которые способствуют генерации пейсмекерной активности. SAMs являются узкоспециализированными кардиомиоциты, которые существенно отличаются от их аналогов в предсердий и желудочков миокарда с точки зрения морфологии, функции и экспрессии белка. Отличительной чертой спонтанных точек доступа в SAMs является спонтанной деполяризации во время диастолы , что приводи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры на животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными Institutional Animal Care и использование комитета Университета Колорадо Медицинский центр Anschutz мимо. Стандартный протокол ниже был оптимизирован с использованием самцов C57BL / 6J 2-3-месячного возраста.
1. Подготовка запасов и расходных материалов Solution в преддверии экспериментов
Примечание: Обратитесь к материалам таблице для необходимого оборудования и расходных материалов.
- Готовят 1 л каждого из следующих растворов , как указано в таблице 1: Низкая, Ca 2+ / Mg....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протоколы , описанные здесь , были ранее использованы для выделения спонтанно активных МССП от взрослых мышей, которые подходят для множества различных накладными исследований зажим 5-8. Кроме того, протоколы позволяют изолированных SAMs, которые можно поддерживать в культуре в течение одной недели. Перенос генов в культивируемые клетки может быть осуществлено с помощью аденовирусной инфекции 9. Результаты, представленные в этом разделе, вытекают из нашей предыдущей.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В настоящем документе представлены подробные протоколы для изоляции и культуры полностью дифференцированных САУ миоцитов от взрослых мышей. Протокол изоляции надежно производит спонтанно активные Sams мыши, подходящие для любого немедленного электрофизиологического анализа или последующей культуры. Подобные протоколы были зарегистрированы многими другими группами (например, см ссылки 11,12,10,13-17). Тем не менее, наш протокол для поддержания взрослой мыши Sams в пробирке сохраняет характерную морфол.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы благодарим доктора Кристиана Рикерта за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантом Национального института сердца, легких и крови (R01-HL088427) для CP. EJS была поддержана 5T32-AG000279 от Национального института по проблемам старения. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Набор для приготовления 501264 Стрептомицин Гиклон SV30010
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| эластомеров Sylgruard/Elastomer | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5 КГ | |
| Боросиликатные 9-дюймовые пипетки | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Маленькие пробирки с круглым дном Fisher | Scientific | 352059 | |
| Большие пробирки с круглым дном Corning | 14-959-11B | ||
| Elastase | Worthington Биохимический | LS002279 | |
| Либераза ТМ | Roche | 5401119001 | Раствор для диссоциации тканей |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Мышиный ламинин | Corning | CB-354232 | |
| 12 мм круглые стеклянные покровные стекла | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-луночная культуральная пластина | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Пластик, одноразовая переводная пипетка | Fisher Scientific | ||
| микроножницы | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Щипцы | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Тканевые щипцы | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Ножницы для рассечения радужной оболочки | глаза WPI, Inc. | ||
| Препарирующие штифты | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| глюкоза | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| таурин | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-глутамат | Sigma | G1501 | |
| K-аспартат | Sigma | A6558 | |
| MgSO< sub>4 | Sigma | M7506 | |
| креатин | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Амфотерицин-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Изопротеренол | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-бутандион моноксим (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Бычья сыворотка альбумин (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Инсулин | Sigma | I3146 | |
| Трансферрин | Sigma | I3146 | |
| Селен | Sigma | I3146 | |
| Пенициллин | GE Healthcare | SV30010 | |
Ссылки
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
