Методическая статья

Методы изоляции, культуры и функциональная характеристика САУ миоцитов от взрослых мышей

DOI:

10.3791/54555

⸱

23 октября 2016 г.

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы продемонстрированы для выделения САУ миоцитов (Sams) от взрослых мышей для патч зажим электрофизиологии или визуализации исследований. Выделенные клетки могут быть использованы непосредственно или могут быть сохранены в культуре, чтобы обеспечить экспрессию белков, представляющих интерес, таких как генетически кодируемых репортеров.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

САУ миоциты (Sams) действуют как естественные кардиостимуляторы сердца, инициируя каждым ударом сердца путем генерации спонтанных потенциалов действия (APS). Эти кардиостимуляторов точки доступа отражают согласованную деятельность многочисленных мембранных токов и внутриклеточного кальция езды на велосипеде. Однако точные механизмы, которые управляют спонтанное кардиостимулятора активности в SAMs остаются неуловимыми. Остро изолированные SAMs являются существенной подготовки для экспериментов рассекать молекулярной основы сердца pacemaking. Тем не менее, нечеткие анатомия, комплекс микродиссекции и привередливые ферментативные условия пищеварения предотвратили широкое применение остро изолированной ЗУР. Кроме того, методы не были доступны до недавнего времени, чтобы обеспечить долгосрочную культуру SAMs для экспрессии белка исследований. Здесь мы предлагаем протокол и демонстрации видео шаг за шагом для выделения SAMs от взрослых мышей. Способ также демонстрируется для поддержания взрослой мыши Sams в пробирке и для Expressiна экзогенных белков через аденовирусной инфекции. Остротоксичные выделяли и культивировали МССП, приготовленные с помощью этих методов пригодны для различных электрофизиологических и визуализации исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кардиостимулятор миоциты в САУ сердца (синусовый миоциты, "SAMs") порождают спонтанные, ритмические потенциалы действия (AP), которые распространяются через миокард инициировать каждый сердцебиение. Эксперименты с использованием остро изолированных Sams из многих видов были необходимы для выяснения механизмов, которые способствуют генерации пейсмекерной активности. SAMs являются узкоспециализированными кардиомиоциты, которые существенно отличаются от их аналогов в предсердий и желудочков миокарда с точки зрения морфологии, функции и экспрессии белка. Отличительной чертой спонтанных точек доступа в SAMs является спонтанной деполяризации во время диастолы , что приводит мембранный потенциал к порогу , чтобы вызвать следующую AP 1,2. Этот "кардиостимулятор потенциал" зависит от скоординированной деятельности многих различных мембранных токов в том числе "забавной тока" (I F), t- и L-типа токи кальция и обменник Curr натриево-кальциевоголор (I NCX), который приводится в действие Ca 2+ освобождения из саркоплазматического ретикулума 3,4.

В то время как остро изолированные мыши SAMs являются существенной экспериментальной подготовки для изучения pacemaking, выделение SAMs у мышей может быть сложным способом принять, потому что нечеткие анатомии и небольшой размер мыши SAN требует нюансированный микродиссекции и комбинированный ферментативных и механических диссоциации клеток требует тщательной оптимизации.

Мы предлагаем здесь подробное видео - демонстрацию протокола , который был успешно использован для выделения Sams от взрослых мышей для патч зажим записи 5-8. Насколько нам известно, нет такой визуальной демонстрации доступны из любого другого источника. Кроме того, новый метод демонстрируется , в котором изолированный Sams от взрослых мышей может поддерживаться в пробирке в течение нескольких дней, позволяя тем самым введение белков, генетически кодируемыхрепортерные молекулы или RNAi через аденовирусной инфекции 9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными Institutional Animal Care и использование комитета Университета Колорадо Медицинский центр Anschutz мимо. Стандартный протокол ниже был оптимизирован с использованием самцов C57BL / 6J 2-3-месячного возраста.

1. Подготовка запасов и расходных материалов Solution в преддверии экспериментов

Примечание: Обратитесь к материалам таблице для необходимого оборудования и расходных материалов.

  1. Готовят 1 л каждого из следующих растворов , как указано в таблице 1: Низкая, Ca 2+ / Mg 2+ Тирода, модифицированная сульфатная-Brühe (KB) Раствор, и бычьего сывороточного альбумина (БСА) Раствор Complete Тирода. Использование сверхчистых фильтруется деионизованной воды для всех растворов. Разделите каждое решение на аликвоты по 50 мл и хранят при температуре 20 ° С в течение до шести месяцев. Оттепель отдельные аликвоты непосредственно перед экспериментами, и хранить до одной недели на 46; С.
  2. Приготовьте 50 мл 10 мМ NaCl и 1,8 мМ CaCl 2 Адаптации раствора путем растворения NaCl и CaCl 2 в сверхчистой фильтруется деионизированной воды (таблица 1). Хранить при комнатной температуре на срок до шести месяцев.
  3. Подготовка 4,75 фермента единица активности (U) аликвот эластазы пипеткой в ​​микроцентрифужных пробирках. Хранить при температуре 4 ° С в течение до трех месяцев.
  4. Приготовьте 375 мкг аликвот (сверхчистых H 2 O) коллагеназы-фермента протеазы смесь с помощью пипетки в микроцентрифужных пробирках. Хранить при температуре -20 ° С в течение до трех месяцев.
  5. Приготовьте два пожарных полировкой пипетки Пастера, один для переноса ткани (~ 1,5 мм Окончательный диаметр отверстия; Рисунок 1Aiv и рисунок 1С) и один для диссоциации (~ 2 мм в диаметре; рис и 1Aiii Рисунок 1C).
    1. Score пипетки Пастера с резаком стекла и сменной вдоль счет, чтобы произвести отверстие немного больше, чем требуемый размер. Огонь-Польское обрезанный конец каждого пипетку в течение ~ 30-60 сек на слабом огне на горелку, чтобы произвести толстую полированную стенку и отверстие нужного диаметра. Убедитесь, что открытие огня полированного свободен от каких-либо трещин или шероховатостей.
  6. Подготовьте два рассечение блюда путем добавления ~ 25 мл силиконового эластомера смешивают в соответствии с инструкциями производителя к каждому 100 мм чашки Петри (рис 1ai и рис 1В). Дайте отвердеть при комнатной температуре в течение 48 ч.
  7. Для культуры только: подготовить 25-50 мл каждый Покрытие среднего и культура Средние согласно Таблице 2 Хранение до двух недель при температуре 4 ° С..

2. Готовят растворы для использования на День карцер

Примечание: Следующие суммы предназначены для изоляции синоатриальной миоцитов от одной мыши.

  1. Добавить 2,5 мл Низкий Ca 2+ / Mg 2+ Тирода (рН 6,9) к каждому из трех небольших, с круглым дном трубки культурыs. Место труб в ванне 35 ± 1 ° C воды.
  2. Добавить 2,5 мл Low Ca 2+ / Mg 2+ Тирода в один большой с круглым дном культуры трубки. Для этой трубки, добавьте 1 аликвоты (4,75 U) эластазы и одну аликвоту (375 мкг) коллагеназы-протеазы фермента смесь. Вихревой перемешать. Место трубки в 35 ± 1 ° С водяной бане.
  3. Добавить 2,5 мл KB средней до трех дополнительных небольших, с круглым дном пробирки культуры и один дополнительный большой, с круглым дном трубки культуры. Место труб в ванне 35 ± 1 ° C воды.
  4. Добавить ~ 7 мл раствора БСА в одну большую Bottomed культуральную пробирку. Держите эту трубку при комнатной температуре.
  5. Поместите 20-40 мл раствора Complete Тироде в 50 мл стакане (рис 1Aii). Добавьте 10 USP / мл гепарина, вихрем перемешать и поместить стакан в C водяной бане в 35 ° ± 1.

3. Подготовить дополнительные решения и материалы для культивируемых клеток (пропустить эти шаги для Остротоксичные изолированных клеток)

  1. В стерильной культуре ткани капот, поместите два 12 мм круглые покровные стекла на мышь в отдельные лунки 24-луночного планшета.
    Примечание: Пластина 24 также используется, поскольку колодцы представляют собой удобный размер, который служит для ограничения объема для последующих вирусных инфекций.
  2. Пипетка приблизительно 200 мкл 100 нг / мл раствора ламинин мыши, разведенного в стерильный физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS), на каждом покровном.
  3. Инкубируйте покровные с ламинин на время изоляции (по крайней мере 1 ч) в термостате при 37 ° С.
  4. Предварительно теплый гальванического покрытия среднего и культуральную среду (с шага 1.7 и таблице 3) до 37 ° С.

4. САУ Изоляция

  1. В химическом вытяжном шкафу, поместите курсор в одной камере коробки двухкамерной и обезболить с ~ 200 мкл жидкого изофлуран, введенного с помощью ватного тампона в другую камеру. Подтверждение анестезии (обычно в пределах ~ 30-60 сек) с носком крайнем случае. Эвтаназиимышь шейным смещением.
    Примечание: пустой 1 мл пипетки коробка может быть использована для формирования коробки двухкамерным; повернуть стойку вниз головой в коробке, чтобы создать отдельный отсек для изофлуран, чтобы предотвратить мышь от контакта его непосредственно.
  2. Удалить мех из груди с ножницами и разрезам грудной клетки , чтобы разоблачить грудной полости с помощью щипцов внешние ткани (рис 1Aviii) и рассечение ножницами (рис 1Avix). Купайтесь грудной полости с ~ 2 мл нагретый Complete Тирода с гепарин с использованием пипетки передачи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте купания грудной полости, когда это необходимо, не позволяют препарат высохнуть.
  3. Под микроскопом рассекает, тщательно удалить легкие и тимуса с использованием внутренних ножниц (рис 1Avi) и рассечение пинцет (рис 1Avii).
  4. В то время как нежно держа верхушку сердца с внутренними щипцов рассечение, тщательно вырезать нижнюю полую вену и Aорта с внутренними ножницами, чтобы удалить сердце из полости грудной клетки. Перенести сердце одному из рассечение блюд силиконовых и омыться ~ 4 мл утепленные гепарин Полная Тирода с помощью пипетки передачи.
  5. Orient сердце таким образом, что задние сосуды видны и лицевой стороной вверх, с правом предсердии животного на правом экспериментатора и левого предсердия на левом экспериментатора. После того, как ориентированные, иммобилизации сердце закрепив через вершину в силиконовую рассечение блюдо.
  6. Расположить паз между желудочками и предсердиями (прозрачный кольца над желудочками).
  7. Используя внутренние ножницы рассечение, сделать надрез в канавке, держа ближе к желудочков, чем предсердия. Промыть канавку и надрез с дополнительным нагретый гепарин Полная Тирода по мере необходимости, чтобы обеспечить четкое представление о предсердия и клапанов. Продолжайте разрезать вдоль канавки, чтобы отделить предсердия от желудочков.
  8. Передача предсердной ткани ко второму силиконовое рассечение блюдо и омыться ~ 3 мл утепленные гепарин Полная Тирода.
  9. Orient ткань так, что правое предсердие животного находится теперь на левом экспериментатора, а левое предсердие справа.
    Примечание: правое предсердие является более прозрачным, в то время как левое предсердие имеет больше темно-красного тона.
  10. Закрепление ткани через нижнюю и верхнюю полую cavae и правого и левого предсердия придатков, растягивая препарат осторожно. Удалите все оставшиеся жир или другие ткани, чтобы обеспечить четкое представление о подготовке (будьте осторожны, чтобы не врезаться в стенку предсердия, как синусовый узел является весьма сложным и может быть легко повреждена).
  11. Откройте переднюю стенку предсердия путем перерезания полых вен. Повторно установите штифты по мере необходимости визуализировать межпредсердной перегородки.
  12. Разрежьте вдоль межпредсердной перегородки, чтобы удалить левое предсердие. Re-контактный препарат, растяжка мягко.
  13. Удалить тон в правом предсердии придаток и освободить САУ путем разрезания вдоль крист, которая терминальной появляется в виде темно-оранжевой полосой, граничащей с ушка предсердия.
  14. Повторно придавить узловую ткань и вырежьте его в поперечном направлении (перпендикулярно кристе терминальной) производить три одинаковых по размеру полос.

5. САУ Переваривание

  1. Использование узкой огневой полировкой пипетка (рис 1Aiv), передают три полоски ткани синусового узла в первый из трех небольших, с круглым дном пробирку , содержащую 2,5 мл низкой Са 2+ / Mg 2+ Тироде в 35 ± 1 ° водяная баня C. Инкубировать в течение 5 мин.
  2. Передача тканевых полосок на второй маленький, с круглым дном пробирку , содержащую 2,5 мл низкой Са 2+ / Mg 2+ Тироде в C водяной бане в 35 ° ± 1, используя ту же узкую пипетку. Вымойте полоски ткани, осторожно вращая трубку или осторожно пипеткой с узким пипеткой. Не Инверт трубку.
  3. Передача ткани полосы к третьей маленькой, с круглым дном пробирку , содержащую 2,5 мл низкой Са 2+ / Mg 2+ Тирода, и повторите стадии промывки , описанную в пункте 5.2.
  4. Передача полосы в большом круглым дном пробирку , содержащую 2,5 мл низкой Са 2+ / Mg 2+ Тироде с ферментами (эластаза плюс коллагеназы-протеазы , смесь) в водяной бане от 35 & deg ; C. Убедитесь в том, что все три полоски ткани присутствуют. Выдержите в течение 10-15 мин при температуре 35 ± 1 ° С. Смешайте каждые 5 минут, осторожно взбалтывая трубку. Не инвертировать трубку.

6. САУ миоцитов диссоциация

  1. После ферментативного расщепления, использовать узкий огневой полировкой пипетки, чтобы аккуратно перенести полоски ткани на первой маленькой, с круглым дном пробирку, содержащую 2,5 мл раствора КБ при 35 ± 1 ° С. Вымойте ткань, осторожно вращая трубку.
    Примечание: Тканевые полоски будут выглядеть несколько полупрозрачным и могут слипаться в гоявляется точка. Ручка очень осторожно после ферментативного расщепления, чтобы избежать потери клеток.
  2. Передача ткани ко второму небольшим круглым дном пробирку, содержащую 2,5 мл кБ при 35 ± 1 ° С. Вихревой аккуратно мыть.
  3. Передача ткани к третьему небольшим круглым дном пробирку, содержащую 2,5 мл кБ при 35 ± 1 ° С. Вихревой аккуратно мыть.
  4. Передача ткани в большой, с круглым дном пробирку, содержащую 2,5 мл кБ при 35 ± 1 ° С.
  5. Используя больший огневой полировкой пипетка (рис 1Aiii и рис 1C), диссоциируют клетки в большом круглым дном трубы с постоянным растиранием приблизительно 0,5-1 Гц в течение 5-10 мин, следя за тем, чтобы держать диссоциации трубки , погруженной в 35 ± 1 ° с и водяную баню, чтобы избежать введения пузырьков в раствор.
    Примечание: растирание время изменяется в зависимости от диаметра диссоциации пипеткой и силы пипеткой. Время должно быть отрегулировано таким образом, чтобы кусочки ткани оставаясь при Тон конец диссоциации появляются тонкие, прозрачные и тонкие. Если ткань сохраняет любой цвет, диссоциация, вероятно, будет неполным. Частота (0,5-1 Гц) определяется вручную.
  6. Удалить с круглым дном трубки, содержащей диссоциирует Sams из водяной бани и уравновешивают при комнатной температуре в течение 5 мин.

7. САУ кальция реадаптации (Выполняется при комнатной температуре)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для ЗУР, предназначенных для экспериментов культуры, процедуры, описанные в следующем разделе должны быть выполнены в стерильной капот культуры ткани. Если МССП должны использоваться для острых опытах, нет необходимости выполнять действия в стерильной среде.

  1. Добавить 75 мкл NaCl / CaCl 2 раствора адаптации (таблица 2). Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 5 мин.
  2. Добавьте 160 мкл NaCl / CaCl раствора 2 адаптации. Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 5 мин.
  3. Добавить 390 мкл BSA зольсоциологическое загрязнение (таблица 2). Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 4 мин.
  4. Добавить 1,25 мл раствора БСА. Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 4 мин.
  5. Добавить 4,37 мл раствора БСА. Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 4 мин.
    Примечание: Конечная концентрация кальция будет 1,8 мМ.
  6. После кальция реадаптации, собирать Sams, позволяя осесть под действием силы тяжести в течение ~ 10 мин или центрифугированием при ~ 2000 мкг в течение 3 мин.
    1. Для остро выделенные клетки, осторожно удалить и выбросить примерно 5 мл надосадочной жидкости с помощью стеклянной пипетки Пастера, в результате чего клетки в объеме ~ 2 мл. Храните эти клетки при комнатной температуре в течение до ~ 8 часов для патч зажим записи.
    2. Для культивируемых клеток, удалить как можно больше супернатанта, как это возможно с помощью стерильной стеклянной пипетки Пастера. Осадок Ресуспендируют клеток в 1 мл подогретого (37 ° С) Покрытие Средний (Таблица 2).

8. Покрытие и культура синоатриальном Миоcytes (Пропустить для Остротоксичные изолированных клеток)

  1. Удалить ламинин решение от покровных из шага 3.3 с помощью пипетки Пастера. Сразу семян 500 мкл (~ 50-100 клеток) на каждом покровном ламининовым покрытием (со стадии 3).
    Примечание: Ингибитор сократительной 2,3-бутандион моноксима (БДМ) входит в осажденных и питательные среды , чтобы предотвратить сжатие, что приводит к убыли клеток 9.
  2. Возвращение 24-луночный планшет , содержащий вновь высевают Sams в инкубатор и выдерживают при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха / 5% CO 2. Разрешить клетки придерживаться покровные в течение 4-6 ч в осажденном средах (таблица 2).
  3. Осторожно удалите Покрытие среды с использованием стерильной пипетки Пастера. Заменить на 500 мкл на лунку предварительно нагретом (37 ° С) , культуральная среда (таблица 2).

9. аденовируса трансдукция взрослых Синусовый миоцитов культур (Пропустить для Остротоксичные изолированных клеток)

  1. Расчетный показатель числа керамзитобLLS на покровное непосредственно перед нанесением аденовируса путем подсчета клеток в поле зрения под микроскопом, регулируя для увеличения. Подсчет всех клеток, а не только Sams.
  2. Развести аденовирус в среде 199 и регулировать разбавление для титра вируса, так что применение 1-10 мкл требуется для достижения конечной кратности инфекции (MOI) 100 вирусных единиц на клетку. Добавить аденовирусной раствор по каплям моды непосредственно на гальванопокрытием ЗУР.
  3. Инкубируйте клетки с вирусом среде, содержащей в течение ночи (~ 12-14 ч). Затем обмен свежей культуральной средой. Поддерживать клетки в инкубаторе, изменение культуральной среды каждые 48 ч, до тех пор, пока не будет получено желаемое экспрессии белка.

10. Функциональная оценка высокотоксичных изолированной или культивированный SAMs

Примечание: Следующий протокол является примером функциональных оценок изолированной ЗУР с использованием амфотерицина техники просечно-патч для записи как спонтанные точки доступа и I F из той же ячейки (см ссылку 9).

  1. Подготовка записи решения , как описано в таблице 3.
  2. Подготовка исходного раствора 20 мг / мл амфотерицина-В в ДМСО свежий в день записи. Хранить запас при комнатной температуре и защищать от света. Развести амфотерицина-В запас внутриклеточной растворе до конечной концентрации 200 мкг / мл непосредственно перед использованием. Поддерживать окончательное решение пипетки на льду и защищенном от света месте.
    Примечание: амфотерицин раствор, содержащий пипетка для экспериментов следует приготовить свежую ежечасно путем разбавления аликвоту исходного раствора во внутриклеточное раствора и встряхиванием в течение не менее 1 мин.
  3. Перелить Аликвоту остро диссоциированы клеточной суспензии SAM или фрагмент покровного стекла, несущего культивируемой Sams к записи камеру, содержащую раствор Тироде при 35 ± 1 ° С. Заливать клеток с раствором Тироде в течение по крайней мере 2 мин до электрофизиологического recordinГ.С., чтобы удалить остатки BDM оставшейся от культуральной среды.
    Примечание: спонтанных сокращений должно быть очевидно, сразу же после передачи в растворе в Тирода. SAMs для записи могут быть идентифицированы с помощью комбинации функций , включая спонтанную сократительную активность, характерную морфологию (например, рис . 2), отсутствие страт, экспрессия белка HCN4, наличие I F тока, мембранная емкость <50 пФ, и спонтанные ApS с формами волны, которые включают в диастолическую фазу деполяризации и медленный ход вверх.
  4. Использование боросиликатного стекла пипетки с сопротивлениями 1,5-3,0 МОм, заполнить наконечник с внутриклеточным раствором амфотерицина ИМЕЮЩИМ путем погружения в течение 10-30 сек. Затем обратно заполнить пипетку с амфотерицином раствором, содержащим. Клеточноподобное прилагается уплотнение ГОм должно быть получено как можно быстрее. Если формирование уплотнения трудно, увеличьте время кончик заполнения.
    Примечание: Сопротивление доступа должно быть непрерывномониторинг после образования клеточного прилагается уплотнение, и все записи должны быть начаты только после получения стабильного сопротивления доступа <10 МОм.
  5. Для записи спонтанные точек доступа, переключить усилитель в ускоренном режиме ток-зажим, без инжекции тока.
    Примечание: 1 нМ изопротеренол входит в растворе Внеклеточный Тироде при записи точек доступа для стабилизации скорости стрельбы, как сообщалось ранее 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы , описанные здесь , были ранее использованы для выделения спонтанно активных МССП от взрослых мышей, которые подходят для множества различных накладными исследований зажим 5-8. Кроме того, протоколы позволяют изолированных SAMs, которые можно поддерживать в культуре в течение одной недели. Перенос генов в культивируемые клетки может быть осуществлено с помощью аденовирусной инфекции 9. Результаты, представленные в этом разделе, вытекают из нашей предыдущей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем документе представлены подробные протоколы для изоляции и культуры полностью дифференцированных САУ миоцитов от взрослых мышей. Протокол изоляции надежно производит спонтанно активные Sams мыши, подходящие для любого немедленного электрофизиологического анализа или последующей культуры. Подобные протоколы были зарегистрированы многими другими группами (например, см ссылки 11,12,10,13-17). Тем не менее, наш протокол для поддержания взрослой мыши Sams в пробирке сохраняет характерную морфол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Кристиана Рикерта за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантом Национального института сердца, легких и крови (R01-HL088427) для CP. EJS была поддержана 5T32-AG000279 от Национального института по проблемам старения. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Набор для приготовления 501264 Стрептомицин Гиклон SV30010

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
эластомеров Sylgruard/ElastomerDow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5 КГ
Боросиликатные 9-дюймовые пипеткиFisher Scientific13-678-20C
Маленькие пробирки с круглым дном FisherScientific352059
Большие пробирки с круглым дном Corning14-959-11B
ElastaseWorthington БиохимическийLS002279
Либераза ТМRoche5401119001Раствор для диссоциации тканей
HeparinSAGENT Pharmaceuticals NDC 25021-400-10
Мышиный ламининCorningCB-354232
12 мм круглые стеклянные покровные стеклаFisher 12-545-80
24-луночная культуральная пластинаFisher08-772-1
Ad-mCherryVector Biolabs1767
Ad-eGFPVector Biolabs1060
Пластик, одноразовая переводная пипеткаFisher Scientific
микроножницыFisher Scientific17-467-496
Dumont #4 ЩипцыRoboz InstrumentsRS-4904
Тканевые щипцыRoboz InstrumentsRS-8164
Ножницы для рассечения радужной оболочкиглаза WPI, Inc.
Препарирующие штифтыFine Science Tools26002-20
NaClSigma71376
KClSigma60128
KH2PO4Sigma60353
HEPESSigma54457
глюкозаSigmaG0350500
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
тауринSigmaT0625
BSASigmaA2153
K-глутаматSigmaG1501
K-аспартатSigmaA6558
MgSO< sub>4SigmaM7506
креатинSigmaC0780
EGTASigmaE3889
Mg-ATPSigmaA9187
Амфотерицин-BFisher Scientific1397-89-3
ИзопротеренолCalbiochem420355
Media199SigmaM4530
2,3-бутандион моноксим (BDM)SigmaB0753
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaSH30071
Бычья сыворотка альбумин (BSA)SigmaA5611
Инсулин   SigmaI3146
ТрансферринSigmaI3146
СеленSigmaI3146
ПенициллинGE HealthcareSV30010

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
  2. DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
  3. Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
  4. Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
  5. Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
  6. Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
  7. Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
  8. St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
  9. St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
  10. Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
  11. Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
  12. Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
  13. Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
  14. Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
  15. Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652(2012).
  16. Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633(2013).
  17. Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  18. Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
  19. Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
  20. Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

patch clamp

Похожие статьи