Получение CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток для анализа GD3 и GD2 Ганглиозид Мембранная Expression микроскопией

Краткое содержание

Описан стандартный протокол с использованием меченых антител для применения в микроскопии для определения экспрессии мембранного и локализации ганглиозидов в состоянии покоя , а также активированные человека наивных CD4 ⁺ Т - клеток. Также описаны в режиме реального времени эксперименты с использованием ПЦР <40000 клеток, которые не требуют дополнительных комплектов низкого входного РНК.

Аннотация

Описанные здесь способы для активации наивных CD4 ⁺ Т - клеток в суспензии и их соблюдение в покровные для конфокальной микроскопический анализ позволяют пространственную локализацию и визуализацию ганглиозидов , участвующих в активации CD4 ⁺ Т - клеток, что экспрессия комплемента профилирование эксперименты , такие как проточная цитометрия, вестерн блоттинга или ПЦР в реальном времени. Количественное выражение ганглиозидов через проточной цитометрии и их клеточной локализации с помощью микроскопии может быть получена при использовании анти-ганглиозидов антител с высоким сродством и специфичностью. Тем не менее, адекватная обработка клеток в суспензии включает обработку культуры пластин для содействия необходимой для соблюдения требуемой флуоресценции или конфокальной микроскопии приобретения. В этой работе мы опишем протокол для определения экспрессии ганглиозидов GD3 и GD2 и колокализацию с TCR во время активации наивных CD4 ⁺ Т - клеток. Кроме того, в режиме реального тЭксперименты IME ПЦР с использованием <40000 клеток описаны для определения GD3 и генов-синтазы GM2 / GD2, демонстрируя, что эксперименты генного анализа могут быть выполнены с низким числом клеток и без необходимости дополнительных комплектов низкого входного РНК.

Введение

CD4 ⁺ Т - клетки оркестровать иммунный ответ через свои эффекторные функции после активации антигенпрезентирующих клеток ^1. Изучение клеточных механизмов, которые модулируются при активации позволяет понимание основного процесса иммунной функции. Тем не менее, исследование наивных CD4 ⁺ Т - клеток может быть сложным , так как они представляют собой очень небольшую популяцию клеток в крови периферии ^2.

С помощью флуоресцентной микроскопии несколько сообщений изучали локализацию различных молекул , участвующих в активации CD4 ⁺ Т - клеток, в основном белки , связанные с плазматической м....

Протокол

Периферической крови у здоровых доноров-мужчин была получена с информированного согласия и одобрения комитета по биоэтике Centro де Investigación эн DINAMICA Celular- Автономного университета дель Estado-де-Морелос.

1. Выделение и активация человеческих Наивные CD4 ⁺ Т - клеток

1. Собирают 2 мл периферической крови, полученной от здоровых доноров путем информированного согласия и разбавляют 2 мл стерильной PBS-ЭДТА (1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), 2 мМ ЭДТА, рН 7,4). Добавляют разбавленную кровь медленно поверх 3 мл раствора сахарозы с плотностью 1,077 , как было описано ранее ^8.

Результаты

Протокол , описанный в этой рукописи оказывает хорошее качество культивируют и приклеенный отдыхавших и активированные человека наивных CD4 ⁺ Т - клеток (рис 1). Активированные CD4 ⁺ Т - клетки обнаруживают характерную пролиферативный профиль (Фигура 1В) , по сравнению с состоянием покоя (рис 1А). CD25 поздно маркер активации полезен для оценки эффективной активации при 72 ч наблюдаемых с помощью конфокальной микрос.......

Обсуждение

Описанный протокол может быть использован для локализации ганглиозидов или белков в суспензии клеток CD4 ⁺ Т - клеток или других клеток иммунной системы (например, PMBCs, рисунок 5) , начиная с небольшого числа клеток. Из-за небольшого размера Т-клеток и не-адгезивных свойств при, приобретение флуоресценции микроскопических изображений приводит к плохой информации или низкого качества, если клетки не правильно придерживалась.

Этот протокол в сочетании с х.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Усовершенствованный RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Дополненный 3% FBS
мышь против человека CD3 антитело	eBioscience	16-0037-81	OKT3 клон
мыши против человека CD28 антитело	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 клон
мыши против человека GD3  антитело	Abcam	ab11779	R24 клон
мыши против человека GD2 антитело	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	Клон 14G2a
FITC-конъюгированный антимышиный антитело IgG3	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 конъюгированное антимышиное	Thermo Fisher Scieni¡ тифик	A-21131
антитело IgG2a
Alexa Fluor 647 конъюгированное антимышиное	Thermo Fisher Scieni¡ антитело tific	A-21241
IgG2a
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Тризол Реагент	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ Т-Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Сортировка
Nunc Lab-tek камерная система предметных стекол	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Лазерный конфокальный микроскоп (Olympus)	Вертикальные стойки Olympus BX61WI и IX81
Праймер прямой последовательности GD3 синтаза	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ссылка 7
Праймер обратной последовательности GD3 синтаза	5´-CCTGTGGGAAGAAGAGAGTAAG-3´		Ссылка 7
Праймер прямой последовательности GM2/GD2 синтаза	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ссылка 7
Праймер обратной последовательности GM2/GD2 синтаза	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ссылка 7

антитело