Методическая статья

Изоляция, дифференцировку и Количественная человеческого антитела секретирующие В-клетки из крови: Elispot в качестве функционального считывания показаний гуморального иммунитета

DOI:

10.3791/54582

⸱

14 декабря 2016 г.

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Периферическая кровь человека обычно используется для оценки гуморального иммунного ответа. Здесь описаны методы выделения В-клеток человека из периферической крови, дифференцировки В-клеток человека в антителосекретирующие (АТ) В-клетки (АСЦ) в культуре и подсчета общего количества IgM- и IgG-АСК с помощью анализа ELISpot.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отличительной чертой гуморального иммунитета является создание функциональных ИСС, которые синтезируют и секретируют Abs, специфичное к антигену (Ag), такие, как патогена, и используются для защиты хозяина. Для количественного определения функционального состояния гуморального иммунного ответа индивидуума, и сывороткой Абс и циркулирующие ИСС обычно измеряется в качестве функциональных считываниями. В организме человека в периферической крови является наиболее удобным и легко доступны образцы, которые могут быть использованы для определения гуморального иммунного ответа, вызываемого хозяином В-клеток. Четкие B-клеточные подмножества, в том числе ИСС, могут быть выделены непосредственно из периферической крови с помощью селекции с использованием линии дифференцировки специфических Ab-сопряженными микрошариков или через сортировки клеток с проточной цитометрии. Кроме того, очищенные наивные и В-клетки памяти могут быть активированы и дифференцированы в ИСС в культуре. Функциональной активности ИСС, чтобы способствовать секреции Ab может быть определена количественно с помощью ELISpot, который представляет собой анализ, который сходится фермент-связанной анализ immunoabsorbance (ИФА) и западные технологии блоттинга для того, чтобы перечисление отдельных ИСС на уровне одной клетки. На практике анализ ELISpot чаще используется для оценки эффективности вакцины из-за легкости в обращении большого количества образцов крови. Способы выделения клеток человека из периферической крови, дифференцировка В - клеток в ИСС в лабораторных условиях , а также применение ELISpot для количественного определения общего IgM- и IgG-ИСС будет описана здесь.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В-клетки играют центральную роль в развитии гуморального иммунитета. Они изначально развиваются в костном мозге и попадает в кровь в виде наивных В-клеток, которые могут мигрировать в лимфоидные ткани, такие как селезенка, лимфатические узлы, а также миндалин, для дальнейшего развития. При столкновении Ag, некоторые наивные В-клетки мигрируют в лимфоидные фолликулы, где зародышевых центр В-клетки могут дифференцироваться в В-клетки памяти и plasmablasts (УБ) / плазмоцитов (ПК). В то время как большинство ФБФР / ПК EGRESS в поток крови, несколько в конечном счете находятся в костном мозге , чтобы пройти терминальной дифференцировки в долгоживущих ПК 1. В - клетки , находящиеся в обращении являются гетерогенными, и в стационарном состоянии, ФБФР / ПК редки в периферической крови 2. В результате наличия поверхностных маркеров линии дифференцировки специфических, проточной цитометрии стало популярным методом для идентификации и характеристики подмножеств В-клеток в периферической крови. Расширенное применение cytometr потокаY является добавление функции сортировки клеток, что позволяет разделение и выделение отдельных подмножеств В-клеток с высокой степенью чистоты. На основе экспрессии специфических рецепторов на поверхности на разных стадиях развития, человека , циркулирующие В - клетки , как правило , подразделяются на три основных субпопуляций: наивных В - клеток (CD19 + CD27 - CD38 -), В - клетки памяти (CD19 + CD27 + CD38 -), и ФБФР / ПК (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Рисунок 1). Наивные В-клетки по своей природе не сталкивались с АГС. Тем не менее, они могут быть дифференцированы в клетки IgM + CD27 + память B. Несмотря на то, наивные В - клетки являются однородными в выражении антиген В-клеточный рецептор (BCR) -associated молекулы (например, CD19, CD20 и CD22) , они неоднородны в своем репертуаре 5 иммуноглобулина. Большинство клеток CD27 + память B могут быть дифференцированы в CD27+ / CD38 + привет ФБФР / ПК 6. Кроме того, В - клетки памяти и ФБФР / ПК поликлональные и демонстрируют с развитием и функциональной гетерогенности 4-7. ФБФР / ПК в обращении, как правило, недолговечны и не выражают CD138, но сделанные осесть в костном мозге будет терминально дифференцируются и долговечны. Терминально дифференцированных ПК выражают CD138 и понижающей регуляции молекулы CD27 на их поверхности 8. Так как УБ и ПК способны секретировать Abs, во многих случаях они все вместе обозначаются как ИСС. В противоположность этому , ни наивным , В - клетки , ни В - клетки памяти может произвести значительные количества Abs 9-10. Тем не менее, при выделении, как наивные и В - клетки памяти могут быть дифференцированы в ИСС в течение 3 - 10 дней при помещении в соответствующих условиях культивирования 6, 11-15. На самом деле, ИСС происходит от в пробирке дифференциации доля подобных поверхностных проявлений CD27 и CD38 с теми , непосредственно выделенных фром периферической крови 6. Кроме того, ИСС дифференцировались в пробирке экспрессируют низкий уровень поверхности CD20, подобный что циркулирующих ФБФР / ПК 6. Хотя культура происхождения ИСС все недолговечны, они могут секретируют Abs, указывая, что они функционально компетентной и способной внести свой вклад в гуморального иммунитета.

Оба ELISA и ELISpot являются на сегодняшний день наиболее часто применяются методы, с помощью которых получить функциональную информацию о гуморального иммунного ответа. ИФА 96-луночный планшет на основе анализа а, и он часто используется для измерения титры сывороточного АГ-специфических антител и других аналитов (например, цитокины). Это удобно и масштабируемым. ИФА предназначен для использования анализа твердофазного фермента , чтобы обнаружить присутствие антител или других веществ, таких как сыворотка, в жидком образце 16. Показаниями из сыворотки ELISAs широко используется для представления иммунный ответ организма. Инструмент, необходимый для приобретения повторногоadouts из ИФА является спектрофотометрический микропланшет-ридера. Читателю может определить оптическую плотность (ОП) конечных продуктов , как правило , в результате реакции с пероксидазой хрена (HRP) Абс обнаружения и их специфических субстратов 17. Что касается отчетности гуморальный иммунный ответ, сывороточные уровни Ab, определенные методом ELISA обозначают коллективный, а не индивидуальный, производительность ИСС в организме. Кроме того, ИФА не принимает во внимание участие В-клетками памяти, которые не секретируют Abs.

Как ELISA, ELISpot является широко используемым методом для обнаружения и мониторинга иммунного ответа в образцах периферической крови 17-18. ELISpot представляет собой метод, связанные с бутербродом ELISA. В нем, клетки помещают в поливинилиденфторида (ПВДФ) Мембранный спинками лунки 96-луночных микропланшетов для кратковременной культуры. Анализ ELISpot аналогично выполнения вестерн-блоттинга на микропланшет и developinг пятна на PVDF мембрану в каждую лунку. Автоматизированная система для чтения ELISpot или стереомикроскоп для ручного подсчета требуется. Основное преимущество ELISpot в обнаружении иммунного ответа является его превосходная чувствительность в квантификации ИСС и цитокин-секретирующие клетки. Он сообщает их функциональную активность в гуморального и клеточного иммунитета, соответственно. При измерении гуморальной иммунной функции, уровни сывороточного Ab , определенные методом ELISA , и количество ИСС , перечисляемые ELISpot часто коррелируют, но показания данные из этих двух анализов имеют некоторые различия в функциональных последствий 19-20. Основным преимуществом ELISpot является его чувствительность метода. Уровень сывороточного титра Ab как сообщает ELISA представлены полуколичественно, как OD считываний, обозначающее относительный уровень Ab, или более количественно, так как концентрация считываний, когда известное количество правильных изотипов Abs включена для справки. В отличие от этого, результаты ELISpot являются Presented в качестве абсолютного числа ИСС в пуле клеток , представляющих интерес (например, нефракционированные одноядерные клетки периферической крови (РВМС) и очищенные В - клетки из МНПК). ELISpot может обнаружить одну ASC, но ELISA требует количества Ab от ИСС достичь оптимизированной опробования зависящих от концентрации перед измерением. Следовательно, ELISpot явно превосходит ELISA в чувствительности количественного определения. Кроме того, ELISpot также подходит для количественного определения in vitro на дифференцированные ИСС из активированных В - клеток памяти. Память В-клетки не секретируют Abs, но могут дифференцироваться в ИСС при активации; поэтому они не имеют никакого вклада в сыворотке крови антител, обнаруженных ELISA. Таким образом, ELISpot является методом выбора при измерении иммунного ответа циркулирующих В-клеток памяти после активации в культуре. Это позволяет осуществлять мониторинг содержания долгосрочного гуморального иммунитета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческой периферической крови должно быть получено от здоровых доноров в рамках информированного согласия, а также использование образцов крови должны соответствовать утвержденным руководящим принципам, установленным отдельными этическими комитетами. В этом исследовании, протокол использовать человеческую кровь в демонстрации результатов проточной цитометрии (рисунок 1) и анализов ELISpot (рисунок 3) был утвержден Советом внутреннего обзора Национального университета Тайваня больницы (номер протокола 201307019RINB).

1. Выделение и очистка периферической крови человека В-клеток

  1. Draw ~ 10 мл крови из срединной локтевой вены (в локтевой ямки кпереди от локтевого сустава) в пробирку объемом 15 мл , содержащей K 2 ЭДТА ( от 1,5 до 2,0 мг / мл крови) и немедленно Переверните пробирку несколько раз , чтобы предотвратить тромба образование.
  2. Добавить 35 мл автоклавного (121 ° С, 15 мин) красных кровяных клеток (эритроцитов) буфера для лизиса (150 мМ NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3, и 1 мМ ЭДТА; рН 7,4) в пробирку, содержащую свежий образец крови (≥ 3: 1 об / об) и инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение не более 5 мин.
    Примечание: Появление пропускания света через трубку указывает на завершение RBC лизиса.
  3. Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Убедитесь, что гранулы белого цвета.
  4. Ресуспендируют осадок с 10 мл автоклавного фосфатно-солевом буфере (PBS, мМ NaCl 137, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na 2 HPO 4 и 1,47 мМ КН 2 РО 4, рН 7,4) и центрифугируют , как в пункте 1.3.
  5. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок с 10 мл среды RPMI 1640 (добавки: 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 0,25 мкг / мл амфотерицина В, и 2 мМ L-глутамина), а затем высевания клеток в культуральной чашке 10 см (10 мл крови на чашку). Поместите блюдо в 37 ° C инкубаторе с 5% СО 2 в течение 30 мин.
  6. Аккуратно водоворот культуры блюдо несколько раз и местокультуральной среды (суспензия клеток) в 15-мл пластиковых конических труб. Откажитесь прилипшие клетки (макрофаги), в основном на посуде культуры.
  7. Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант.
  8. Ресуспендируют осадок в 1 мл RPMI 1640 среды. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    Примечание: Жизнеспособность изолированных лейкоцитах, как правило, больше, чем 90% трипанового синего.
  9. Центрифуга , как на стадии 1.7 , и клетки вновь суспендируют в ~ 200 мкл холодного буфера PBS (0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА) при концентрации 5 - 10 х 10 6 клеток / мл.
  10. Добавьте 5 мкл биотинилированного анти-АВ человека коктейлем , специфичные для клеток крови (для отрицательного отбора В - клеток) на 10 6 клеток и инкубируют на льду в течение 30 мин 21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ab коктейль против человека должен включать по крайней мере Abs, специфичные для CD2 (или CD3), CD14 и CD16.
  11. Добавьте 10-кратный избыток объемастерильного PBS к клеткам, центрифуге при 600 мкг в течение 5 мин, и отбросить супернатант.
  12. Добавьте равное количество стрептавидин-конъюгированные микрогранул (5 мкл на 10 6 клеток) в гранулах и тщательно перемешать.
  13. Инкубируют на льду в течение 30 мин в 15-мл пластиковой конической трубки.
  14. Добавляют 2 мл буфера PBS в трубку.
  15. Поместите пробирку в магнитный штатив и инкубировать при комнатной температуре в течение 8 мин. Коричневые микрогранулы будут постепенно присоединять к стенке трубы рядом с магнитом 22.
  16. С помощью трубки , остающейся в магнитный штатив, тщательно передачи супернатант в новую стерильную 15-мл трубки 22.
  17. Повторите шаги 1.14 до 1.16, и объединить два супернатанта, которые содержат нетронутые В-клетки. Откажитесь от микрогранулы.
  18. Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант.
  19. Ресуспендируют осадок в среде RPMI 1640 для последующих экспериментов.
    Примечание: Как правило, 1 - 5 × 10 5 В - клетки остроумиега с чистотой выше 95% от 10 мл периферической крови может быть выделено 23.

2. Очистка и разделение памяти и наивные B Клетки из изолированных В-клеток

  1. Использование клеток, очищенные от стадии 1, и определяют количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика.
  2. Ресуспендируют клеток в 100 мкл холодного буфера PBS после центрифугирования при 600 мкг и комнатной температуре в течение 5 мин.
  3. Добавить 1 - 2 мкг биотинилированного CD27 мАт на 10 6 клеток и инкубируют на льду в течение 30 мин.
  4. Добавляют 10 мл буфера PBS в пробирку и центрифугируют при 600 х г в течение 5 мин.
  5. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 50 мкл буфера PBS.
  6. Добавьте равное количество стрептавидином магнитных микросфер (1 - 2 мкг / 10 6 клеток) к клеткам в пластиковую коническую пробирку 15 мл.
  7. Аккуратно хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 30 мин.
  8. Добавляют 2 - 3 мл буфера PBS к трубе.
  9. ПоместитеТрубка в магнитный штатив и инкубировать при комнатной температуре в течение 8 мин, чтобы позволить коричневый микрогранулы прикрепить к стороне, ближайшей к магниту.
  10. С помощью трубки в магнитный штатив, осторожно переносить фракцию супернатанта в новую стерильную пробирку. Эта фракция содержит обогащенную CD27 - наивных В - клеток.
  11. Добавьте 5 мл в пробирку , содержащую микрогранулы и осторожно ресуспендируют микрошарики (то есть, обогащенную фракцию клеток CD27 + память B) 24-25.
  12. Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Ресуспендируют гранулы с RPMI 1640 средой для нисходящих экспериментов.
    Примечание: Как правило, ~ 30 - 60% В - клеток , могут быть очищены в виде ячеек памяти CD27 + из МКПК здорового донора 7, 25-26.

3. сортировка клеток для коллекции наивных В-клеток, В-клеток памяти, и ФБФР / ПК

  1. Использование клеток, очищенные от шага 1, определяют количество клеток с помощью hemocytomeтер или автоматический счетчик клеток.
  2. Ресуспендируют клеток в холодном буфере PBS при концентрации 10 7 на мл в полистирольной трубки 5 мл.
  3. Добавить 1 - 2 мкг человеческого IgG на 10 6 клеток и инкубировать на льду в течение 10 мин для блока Fc.
  4. Добавьте 1 мкг каждого из анти-CD19-APC (клон: HIB19), анти-CD27-eFluor450 (клон: O323) и анти-CD38-PE (клон: HIT2) на 10 6 клеток; хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 30 мин 4, 27.
  5. В последние 5 мин на стадии 3.4, добавляют 5 мкл коммерческого 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
  6. Добавляют 2 мл PBS с трубкой, вихря и центрифуге при 600 мкг в течение 5 мин.
  7. Ресуспендируют клеток в буфер сортировки (стерильный PBS с 2% BSA и 2 мМ ЭДТА) при концентрации 1 - 5 × 10 7 клеток на мл в пробирку объемом 15 мл.
  8. Фильтр клеток через нейлоновое сито ячейки фильтра (размер пор 40 мкм), чтобы исключить скопления клеток.
  9. Отдельные клетки с цитометрии рода потокаэр оснащен тремя лазерами: фиолетовый (405 нм), синий (488 нм) и красный (640 нм).
    Примечание: Голубой лазер одного достаточно для 3-цветной проточной цитометрии 27-28.
  10. Сортировка клеток в три 15 мл пробирки (содержащие 5 мл RPMI среды) для одновременного сбора наивных В - клеток (CD19 + CD27 -), В - клетки памяти (CD19 + CD27 +), и ФБФР / ПК (CD19 + CD27 + / CD38 + привет) 3-4, 28.
    Примечание: Сортировано наивные и В-клетки памяти могут культивироваться, как описано в шаге 4.

4. Экстракорпоральное Дифференциация изолированных человеческого CD19 + В - клеток, CD19 + CD27 + В - клетки памяти, и CD19 + CD27 - Наивные В - клетки

  1. Используя клетки, очищенные с шагом 1,19, 2,10, 2,11 и 3,10, определяют количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика.
  2. Ресуспендируют клетки с RPMI 1640,в концентрации 1 - 10 × 10 5 на мл и аликвоту их в лунки 12-луночного планшета.
  3. Добавить CpG (ODN 2006) на 5 мкг / 10 6 клеток / мл 18, 29.
  4. Культуры клеток в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 5 дней.
  5. Сбора клеток из каждой лунки, размещают их по отдельности в 15 мл пробирки, добавляют 5 мл PBS в каждую пробирку, и отцентрифугированы при 600 мкг и комнатной температуре в течение 5 мин.
  6. Граф клеток с использованием гемоцитометра или автоматического счетчика. Ресуспендируют клеток в концентрации 1 - 10 × 10 5 на мл с RPMI 1640 среды.

5. Анализ ELISpot

  1. Добавить 30 мкл 35% этанола в дистиллированной воде, в каждую лунку планшетов ELISpot в течение 30 сек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При пипеткой, не касаясь мембраны в лунки во все времена.
  2. Инверсия пластины ELISPOT для удаления этанола.
  3. Поместите 150 мкл автоклавного DDH 2 O в каждую лунку и инкубироватьих при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы смыть от остаточного этанола; следовать с промывкой стерильной PBS при комнатной температуре в течение 3 мин.
    Примечание: Шаги 5.1 до 5.3, могут быть по желанию, в зависимости от производства пластин.
  4. Поместите 50 мкл 5 мкг / мл поликлональное F (аb ') 2 - фрагмента антитела против человеческого Ig (IgG + IgM + IgA) (в PBS) в каждую лунку планшетов ELISpot и инкубировать их при 4 ° С в течение ночи (предпочтительно) или 37 ° С в течение 2 ч 11.
    Примечание: запечатать края пластин парафильмом до использования.
  5. Инверсия пластины для удаления несвязанного Abs, добавьте 200 мкл PBS, в каждую лунку, и инкубировать их в два раза при комнатной температуре в течение 3 мин каждый раз.
  6. Добавить 200 мкл PBS с 5% БСА (или RPMI 1640), в каждую лунку для блокирования, и инкубировать их при комнатной температуре в течение 2 ч.
  7. Обратить пластины, чтобы удалить блокирующий буфер. Промыть каждую лунку два раза 200 мкл PBS, а на этапе 5.5.
  8. Добавить 100 мкл RPMI 1640, в каждую лунку и инкубировать их при 37 ° С.
  9. Когда все будет готово к семени клетки, инвертировать пластины, чтобы удалить RPMI 1640.
  10. Семенной 100 мкл (5 × 10 4), 50 мкл (2,5 × 10 4) и 25 мкл (1,25 × 10 4) клеток (от шагов , 1,19, 2,10, 2,11, 3,10 и 4,6) в ямах ELISpot пластины. С помощью RPMI 1640, довести объем до 150 мкл / лунку.
    Примечание: Минимум одного или двух 2-кратных серийных разведений для посева клеток рекомендуется.
  11. Инкубируйте пластин в инкубаторе C 37 ° с 5% CO 2 в течение 8 - 14 ч 18. Избегайте перемещения пластин во время инкубации.
  12. Инверсия пластины для удаления клеток и RPMI 1640.
  13. Добавить 200 мкл / лунку PBS-T (PBS с 0,05% Tween 20) и инкубируют их в 5 раз при комнатной температуре, каждый раз в течение 3 мин. Переверните планшет, чтобы удалить промывочный буфер между каждым из 5 промывок.
  14. Добавить либо козьего антитела против человеческого IgG, щелочной фосфатазы (AP), Fcγ специфические Абс (для обнаружения IgG, 1: 5000 в PBS-T) Или козьего антитела против человеческого IgМ-АР, Fcμ фрагмент конкретного Абс (для обнаружения IgM, 1: 5000 в PBS-T) в зону, лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч в темноте.
  15. Промыть каждую лунку два раза 200 мкл PBS, а на этапе 5.5.
  16. Добавьте 50 bromochloroindolyl раствора мкл / лунку фосфатного-нитро тетразолия (BCIP / NBT) подложки. Фиолетовый-цветные пятна обычно появляются в 5 - 15 мин.
  17. Добавьте 100 мкл / лунку DDH 2 O , чтобы не допустить чрезмерного развития пятен.
  18. Промыть пластины с проточной водопроводной водой после полного развития всех пятен.
  19. Удалите underdrain пластин и дать им высохнуть на воздухе в темноте.
  20. Подсчитывают пятна с помощью автоматического планшет - ридера с блоком изображения сбора / анализа (например, автоматический сканер или вручную через рассекает микроскопом).
    Примечание: Пластины можно хранить при комнатной температуре в темноте и проанализированы позже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РВМС обеднен эритроцитах и ​​прилипшие клетки (шаги 1,2 до 1,7). Порцию (2 × 10 6) клеток подвергали анализу проточной цитометрии для иллюстрации популяции наивных В - клеток, В - клеток памяти, и ФБФР / ПК в периферической крови (рисунок 1). В МНПК этого донора, около 10% лимфоцитов были CD19 + В - клетки. В B-клеточного отсека, процент CD19 + CD27 - наивных В - клеток составляет около 50%. С другой стороны, около 50% клеток C...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение и очистка периферической крови человека В-клеток

Обычно Эритроциты могут быть эффективно разорваны и очищается буфера для лизиса (шаг 1.2). Важно, чтобы не инкубировать МНПК с буфером для лизиса эритроцитов дольше, чем 5 мин, а жизнеспособность клеток может зависеть от хлорида аммония. В качестве альтернативы, Эритроциты и тромбоциты могут быть одновременно удалены следующим протоколом.

Смешайте свежую цельную кровь, с кислотно-цитрат-декстроза (ACD) буфер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор заявляет об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано исследовательским грантом от Министерства науки и технологий Исполнительного Юаня Тайваня (NSC99-2320-B-002-011). Я хотел бы отметить отличные услуги, предоставленные Ядром проточного цитометрического анализа и сортировки Первой основной лаборатории в Медицинском колледже Национального университета Тайваня.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BD Vacutainer K2EBD Biosciences36752510 мл пробирка
Ficoll-Paque Plus GEHealthcare17-1440-02безэндотоксинный
трипановый синий 0,5% растворBiological Industries03-102-1B
IMag Набор для обогащения B-лимфоцитовчеловека BD Biosciences558007
Biotinylated CD27 mAbBiolegend302804клон
стрептавидина магнитные микрошарикиO323 BD Biosciences9000810
15 мл пробирки FalconBD Falcon352196
Синее нейлоновое сетчатое сетчатое сетчатое ситечко, 40 мкм; mBD Falcon352340
Античеловеческий CD19-APCBiolegend302212клон HIB19
Античеловеческий CD27-eFluor 450eBioscience48-0279-42клон O323
Античеловеческий CD38-PE-Cy7Biolegend303516клон HIT2 
Античеловеческий CD38-PE-Cy7BD Biosciences560677клон HIT2 
Клон HI30 Античеловеческий CD45-FITCBiolegend304006HI30
Античеловеческий CD45-FITCBD Biosciences555482клон HI30
Антимышиный/крысовый/человеческий CD27-PerCP Cy5.5Biolegend124213клон LG.3A10
Античеловеческий CD27-PerCP Cy5.5BD Biosciences65429клон L128
Античеловеческий CD19-FITCMiltenyi Biotec130-098-064клон LT19
античеловеческий CD19-FITCGeneTexGTX75599клон LT19
античеловеческий CD20-FITCBD Biosciences555622клон 2H7
биотинилированный античеловеческий CD27Biolegend302804клон O323
биотинилированный античеловеческий CD27eBioscience13-0279-80клон O323
7-аминоактиномицин D (7-AAD)BD Biosciences559925
CpG (ODN 2006) InvivoGentlrl-2006тип B CpG
Рекомбинантный человеческий IL-2PeproTech200-02
Рекомбинантный человеческий IL-10PeproTech200-10
Рекомбинантный человеческий IL-21PeproTech200-21
Рекомбинантный человеческий sCD40LPeproTech310-02
Белок А S. aureus Cowan (SAC)Sigma-Aldrich82526
Pokeweed mitogen (PWM)Sigma-AldrichL9379
MultiScreen фильтрующие пластины, 0.45 &; m размер порMerck MilliporeMSIPS4510стерильная, прозрачная 96-луночная фильтрующая пластина с гидрофобной мембраной PVDF
раствор BCIP/NBTSigma-AldrichB6404
BCIP/NBT одиночный реагент, субстрат щелочной фосфатазыMerck MilliporeES006
IgG человекаJackson ImmunoResearch009-000-003
IgG человека, фрагмент FcJackson ImmunoResearch009-000-008
F(ab')2 фрагмент козьего античеловеческого Ig (IgG + IgM + IgA)Jackson ImmunoResearch109-006-127
козья античеловеческая IgG-щелочная фосфатаза, специфичная для Fc&гамма-фрагментовJackson ImmunoResearch109-055-008
козья античеловеческая IgM-щелочная фосфатаза, специфичная для Fc&микрофрагментовJackson ImmunoResearch109-055-043
Козья античеловеческая IgG-пероксидаза, специфичная для Fc&гамма-фрагментовJackson ImmunoResearch109-035-008
Козья античеловеческая IgM-пероксидаза, специфичная для Fc&микрофрагментовJackson ImmunoResearch109-035-095
BD ELISPOT AEC набор субстратовBD Biosciences551951
C.T.L. ImmunoSpot анализаторК.Т.Л.
клон

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
  2. Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
  3. Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
  4. Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
  5. Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
  6. Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
  7. Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81(2011).
  8. Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108(2014).
  9. Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
  10. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
  11. Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
  12. Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
  13. Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806(2012).
  14. Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
  15. Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
  16. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
  17. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
  18. Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
  19. Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403(2016).
  20. Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
  21. Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  22. Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
  23. Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
  24. Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  25. Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
  26. Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
  27. Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  28. Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
  29. Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
  30. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  31. Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
  32. Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
  33. Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
  34. Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
  35. Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
  36. Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
  37. Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
  38. Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
  39. Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
  40. Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
  41. Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972(2009).
  42. Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
  43. Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ELISpotBB

Похожие статьи