Изоляция, дифференцировку и Количественная человеческого антитела секретирующие В-клетки из крови: Elispot в качестве функционального считывания показаний гуморального иммунитета

В-клетки играют центральную роль в развитии гуморального иммунитета. Они изначально развиваются в костном мозге и попадает в кровь в виде наивных В-клеток, которые могут мигрировать в лимфоидные ткани, такие как селезенка, лимфатические узлы, а также миндалин, для дальнейшего развития. При столкновении Ag, некоторые наивные В-клетки мигрируют в лимфоидные фолликулы, где зародышевых центр В-клетки могут дифференцироваться в В-клетки памяти и plasmablasts (УБ) / плазмоцитов (ПК). В то время как большинство ФБФР / ПК EGRESS в поток крови, несколько в конечном счете находятся в костном мозге , чтобы пройти терминальной дифференцировки в долгоживущих ПК ^1. В - клетки , находящиеся в обращении являются гетерогенными, и в стационарном состоянии, ФБФР / ПК редки в периферической крови ^2. В результате наличия поверхностных маркеров линии дифференцировки специфических, проточной цитометрии стало популярным методом для идентификации и характеристики подмножеств В-клеток в периферической крови. Расширенное применение cytometr потокаY является добавление функции сортировки клеток, что позволяет разделение и выделение отдельных подмножеств В-клеток с высокой степенью чистоты. На основе экспрессии специфических рецепторов на поверхности на разных стадиях развития, человека , циркулирующие В - клетки , как правило , подразделяются на три основных субпопуляций: наивных В - клеток (CD19 ⁺ CD27 ^- CD38 ^-), В - клетки памяти (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), и ФБФР / ПК (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Рисунок 1). Наивные В-клетки по своей природе не сталкивались с АГС. Тем не менее, они могут быть дифференцированы в клетки IgM ⁺ CD27 ⁺ память B. Несмотря на то, наивные В - клетки являются однородными в выражении антиген В-клеточный рецептор (BCR) -associated молекулы (например, CD19, CD20 и CD22) , они неоднородны в своем репертуаре ⁵ иммуноглобулина. Большинство клеток CD27 ⁺ память B могут быть дифференцированы в CD27+ / CD38 ⁺ привет ФБФР / ПК ^6. Кроме того, В - клетки памяти и ФБФР / ПК поликлональные и демонстрируют с развитием и функциональной гетерогенности ^4-7. ФБФР / ПК в обращении, как правило, недолговечны и не выражают CD138, но сделанные осесть в костном мозге будет терминально дифференцируются и долговечны. Терминально дифференцированных ПК выражают CD138 и понижающей регуляции молекулы CD27 на их поверхности ^8. Так как УБ и ПК способны секретировать Abs, во многих случаях они все вместе обозначаются как ИСС. В противоположность этому , ни наивным , В - клетки , ни В - клетки памяти может произвести значительные количества Abs ^9-10. Тем не менее, при выделении, как наивные и В - клетки памяти могут быть дифференцированы в ИСС в течение 3 - 10 дней при помещении в соответствующих условиях культивирования ^{6, 11-15.} На самом деле, ИСС происходит от в пробирке дифференциации доля подобных поверхностных проявлений CD27 и CD38 с теми , непосредственно выделенных фром периферической крови ^6. Кроме того, ИСС дифференцировались в пробирке экспрессируют низкий уровень поверхности CD20, подобный что циркулирующих ФБФР / ПК ^6. Хотя культура происхождения ИСС все недолговечны, они могут секретируют Abs, указывая, что они функционально компетентной и способной внести свой вклад в гуморального иммунитета.

Оба ELISA и ELISpot являются на сегодняшний день наиболее часто применяются методы, с помощью которых получить функциональную информацию о гуморального иммунного ответа. ИФА 96-луночный планшет на основе анализа а, и он часто используется для измерения титры сывороточного АГ-специфических антител и других аналитов (например, цитокины). Это удобно и масштабируемым. ИФА предназначен для использования анализа твердофазного фермента , чтобы обнаружить присутствие антител или других веществ, таких как сыворотка, в жидком образце ^16. Показаниями из сыворотки ELISAs широко используется для представления иммунный ответ организма. Инструмент, необходимый для приобретения повторногоadouts из ИФА является спектрофотометрический микропланшет-ридера. Читателю может определить оптическую плотность (ОП) конечных продуктов , как правило , в результате реакции с пероксидазой хрена (HRP) Абс обнаружения и их специфических субстратов ^17. Что касается отчетности гуморальный иммунный ответ, сывороточные уровни Ab, определенные методом ELISA обозначают коллективный, а не индивидуальный, производительность ИСС в организме. Кроме того, ИФА не принимает во внимание участие В-клетками памяти, которые не секретируют Abs.

Как ELISA, ELISpot является широко используемым методом для обнаружения и мониторинга иммунного ответа в образцах периферической крови ^17-18. ELISpot представляет собой метод, связанные с бутербродом ELISA. В нем, клетки помещают в поливинилиденфторида (ПВДФ) Мембранный спинками лунки 96-луночных микропланшетов для кратковременной культуры. Анализ ELISpot аналогично выполнения вестерн-блоттинга на микропланшет и developinг пятна на PVDF мембрану в каждую лунку. Автоматизированная система для чтения ELISpot или стереомикроскоп для ручного подсчета требуется. Основное преимущество ELISpot в обнаружении иммунного ответа является его превосходная чувствительность в квантификации ИСС и цитокин-секретирующие клетки. Он сообщает их функциональную активность в гуморального и клеточного иммунитета, соответственно. При измерении гуморальной иммунной функции, уровни сывороточного Ab , определенные методом ELISA , и количество ИСС , перечисляемые ELISpot часто коррелируют, но показания данные из этих двух анализов имеют некоторые различия в функциональных последствий ^19-20. Основным преимуществом ELISpot является его чувствительность метода. Уровень сывороточного титра Ab как сообщает ELISA представлены полуколичественно, как OD считываний, обозначающее относительный уровень Ab, или более количественно, так как концентрация считываний, когда известное количество правильных изотипов Abs включена для справки. В отличие от этого, результаты ELISpot являются Presented в качестве абсолютного числа ИСС в пуле клеток , представляющих интерес (например, нефракционированные одноядерные клетки периферической крови (РВМС) и очищенные В - клетки из МНПК). ELISpot может обнаружить одну ASC, но ELISA требует количества Ab от ИСС достичь оптимизированной опробования зависящих от концентрации перед измерением. Следовательно, ELISpot явно превосходит ELISA в чувствительности количественного определения. Кроме того, ELISpot также подходит для количественного определения in vitro на дифференцированные ИСС из активированных В - клеток памяти. Память В-клетки не секретируют Abs, но могут дифференцироваться в ИСС при активации; поэтому они не имеют никакого вклада в сыворотке крови антител, обнаруженных ELISA. Таким образом, ELISpot является методом выбора при измерении иммунного ответа циркулирующих В-клеток памяти после активации в культуре. Это позволяет осуществлять мониторинг содержания долгосрочного гуморального иммунитета.

Человеческой периферической крови должно быть получено от здоровых доноров в рамках информированного согласия, а также использование образцов крови должны соответствовать утвержденным руководящим принципам, установленным отдельными этическими комитетами. В этом исследовании, протокол использовать человеческую кровь в демонстрации результатов проточной цитометрии (рисунок 1) и анализов ELISpot (рисунок 3) был утвержден Советом внутреннего обзора Национального университета Тайваня больницы (номер протокола 201307019RINB).

1. Выделение и очистка периферической крови человека В-клеток

1. Draw ~ 10 мл крови из срединной локтевой вены (в локтевой ямки кпереди от локтевого сустава) в пробирку объемом 15 мл , содержащей K ₂ ЭДТА ( от 1,5 до 2,0 мг / мл крови) и немедленно Переверните пробирку несколько раз , чтобы предотвратить тромба образование.
2. Добавить 35 мл автоклавного (121 ° С, 15 мин) красных кровяных клеток (эритроцитов) буфера для лизиса (150 мМ NH ₄ Cl, 10 мМ КНСО _3, и 1 мМ ЭДТА; рН 7,4) в пробирку, содержащую свежий образец крови (≥ 3: 1 об / об) и инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение не более 5 мин.
   Примечание: Появление пропускания света через трубку указывает на завершение RBC лизиса.
3. Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Убедитесь, что гранулы белого цвета.
4. Ресуспендируют осадок с 10 мл автоклавного фосфатно-солевом буфере (PBS, мМ NaCl 137, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na ₂ HPO ₄ и 1,47 мМ КН ₂ РО _4, рН 7,4) и центрифугируют , как в пункте 1.3.
5. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок с 10 мл среды RPMI 1640 (добавки: 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 0,25 мкг / мл амфотерицина В, и 2 мМ L-глутамина), а затем высевания клеток в культуральной чашке 10 см (10 мл крови на чашку). Поместите блюдо в 37 ° C инкубаторе с 5% СО ₂ в течение 30 мин.
6. Аккуратно водоворот культуры блюдо несколько раз и местокультуральной среды (суспензия клеток) в 15-мл пластиковых конических труб. Откажитесь прилипшие клетки (макрофаги), в основном на посуде культуры.
7. Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант.
8. Ресуспендируют осадок в 1 мл RPMI 1640 среды. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
   Примечание: Жизнеспособность изолированных лейкоцитах, как правило, больше, чем 90% трипанового синего.
9. Центрифуга , как на стадии 1.7 , и клетки вновь суспендируют в ~ 200 мкл холодного буфера PBS (0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА) при концентрации 5 - 10 х 10 ⁶ клеток / мл.
10. Добавьте 5 мкл биотинилированного анти-АВ человека коктейлем , специфичные для клеток крови (для отрицательного отбора В - клеток) на 10 ⁶ клеток и инкубируют на льду в течение 30 мин ^21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ab коктейль против человека должен включать по крайней мере Abs, специфичные для CD2 (или CD3), CD14 и CD16.
11. Добавьте 10-кратный избыток объемастерильного PBS к клеткам, центрифуге при 600 мкг в течение 5 мин, и отбросить супернатант.
12. Добавьте равное количество стрептавидин-конъюгированные микрогранул (5 мкл на 10 ⁶ клеток) в гранулах и тщательно перемешать.
13. Инкубируют на льду в течение 30 мин в 15-мл пластиковой конической трубки.
14. Добавляют 2 мл буфера PBS в трубку.
15. Поместите пробирку в магнитный штатив и инкубировать при комнатной температуре в течение 8 мин. Коричневые микрогранулы будут постепенно присоединять к стенке трубы рядом с магнитом ^22.
16. С помощью трубки , остающейся в магнитный штатив, тщательно передачи супернатант в новую стерильную 15-мл трубки ^22.
17. Повторите шаги 1.14 до 1.16, и объединить два супернатанта, которые содержат нетронутые В-клетки. Откажитесь от микрогранулы.
18. Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант.
19. Ресуспендируют осадок в среде RPMI 1640 для последующих экспериментов.
    Примечание: Как правило, 1 - 5 × 10 ⁵ В - клетки остроумиега с чистотой выше 95% от 10 мл периферической крови может быть выделено ^23.

2. Очистка и разделение памяти и наивные B Клетки из изолированных В-клеток

1. Использование клеток, очищенные от стадии 1, и определяют количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика.
2. Ресуспендируют клеток в 100 мкл холодного буфера PBS после центрифугирования при 600 мкг и комнатной температуре в течение 5 мин.
3. Добавить 1 - 2 мкг биотинилированного CD27 мАт на 10 ⁶ клеток и инкубируют на льду в течение 30 мин.
4. Добавляют 10 мл буфера PBS в пробирку и центрифугируют при 600 х г в течение 5 мин.
5. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 50 мкл буфера PBS.
6. Добавьте равное количество стрептавидином магнитных микросфер (1 - 2 мкг / 10 ⁶ клеток) к клеткам в пластиковую коническую пробирку 15 мл.
7. Аккуратно хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 30 мин.
8. Добавляют 2 - 3 мл буфера PBS к трубе.
9. ПоместитеТрубка в магнитный штатив и инкубировать при комнатной температуре в течение 8 мин, чтобы позволить коричневый микрогранулы прикрепить к стороне, ближайшей к магниту.
10. С помощью трубки в магнитный штатив, осторожно переносить фракцию супернатанта в новую стерильную пробирку. Эта фракция содержит обогащенную CD27 ^- наивных В - клеток.
11. Добавьте 5 мл в пробирку , содержащую микрогранулы и осторожно ресуспендируют микрошарики (то есть, обогащенную фракцию клеток CD27 ⁺ память B) ^24-25.
12. Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Ресуспендируют гранулы с RPMI 1640 средой для нисходящих экспериментов.
    Примечание: Как правило, ~ 30 - 60% В - клеток , могут быть очищены в виде ячеек памяти CD27 ⁺ из МКПК здорового донора ^{7, 25-26.}

3. сортировка клеток для коллекции наивных В-клеток, В-клеток памяти, и ФБФР / ПК

1. Использование клеток, очищенные от шага 1, определяют количество клеток с помощью hemocytomeтер или автоматический счетчик клеток.
2. Ресуспендируют клеток в холодном буфере PBS при концентрации 10 ⁷ на мл в полистирольной трубки 5 мл.
3. Добавить 1 - 2 мкг человеческого IgG на 10 ⁶ клеток и инкубировать на льду в течение 10 мин для блока Fc.
4. Добавьте 1 мкг каждого из анти-CD19-APC (клон: HIB19), анти-CD27-eFluor450 (клон: O323) и анти-CD38-PE (клон: HIT2) на 10 ⁶ клеток; хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 30 мин ^{4, 27.}
5. В последние 5 мин на стадии 3.4, добавляют 5 мкл коммерческого 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
6. Добавляют 2 мл PBS с трубкой, вихря и центрифуге при 600 мкг в течение 5 мин.
7. Ресуспендируют клеток в буфер сортировки (стерильный PBS с 2% BSA и 2 мМ ЭДТА) при концентрации 1 - 5 × 10 ⁷ клеток на мл в пробирку объемом 15 мл.
8. Фильтр клеток через нейлоновое сито ячейки фильтра (размер пор 40 мкм), чтобы исключить скопления клеток.
9. Отдельные клетки с цитометрии рода потокаэр оснащен тремя лазерами: фиолетовый (405 нм), синий (488 нм) и красный (640 нм).
   Примечание: Голубой лазер одного достаточно для 3-цветной проточной цитометрии ^27-28.
10. Сортировка клеток в три 15 мл пробирки (содержащие 5 мл RPMI среды) для одновременного сбора наивных В - клеток (CD19 ⁺ CD27 ^-), В - клетки памяти (CD19 ⁺ CD27 ^+), и ФБФР / ПК (CD19 ⁺ CD27 ^{+ /} CD38 ^{+ привет) 3-4, 28.}
    Примечание: Сортировано наивные и В-клетки памяти могут культивироваться, как описано в шаге 4.

4. Экстракорпоральное Дифференциация изолированных человеческого CD19 ⁺ В - клеток, CD19 ⁺ CD27 ⁺ В - клетки памяти, и CD19 ⁺ CD27 ^- Наивные В - клетки

1. Используя клетки, очищенные с шагом 1,19, 2,10, 2,11 и 3,10, определяют количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика.
2. Ресуспендируют клетки с RPMI 1640,в концентрации 1 - 10 × 10 ⁵ на мл и аликвоту их в лунки 12-луночного планшета.
3. Добавить CpG (ODN 2006) на 5 мкг / 10 ⁶ клеток / мл ^{18, 29.}
4. Культуры клеток в 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ в течение 5 дней.
5. Сбора клеток из каждой лунки, размещают их по отдельности в 15 мл пробирки, добавляют 5 мл PBS в каждую пробирку, и отцентрифугированы при 600 мкг и комнатной температуре в течение 5 мин.
6. Граф клеток с использованием гемоцитометра или автоматического счетчика. Ресуспендируют клеток в концентрации 1 - 10 × 10 ⁵ на мл с RPMI 1640 среды.

5. Анализ ELISpot

1. Добавить 30 мкл 35% этанола в дистиллированной воде, в каждую лунку планшетов ELISpot в течение 30 сек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При пипеткой, не касаясь мембраны в лунки во все времена.
2. Инверсия пластины ELISPOT для удаления этанола.
3. Поместите 150 мкл автоклавного DDH ₂ O в каждую лунку и инкубироватьих при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы смыть от остаточного этанола; следовать с промывкой стерильной PBS при комнатной температуре в течение 3 мин.
   Примечание: Шаги 5.1 до 5.3, могут быть по желанию, в зависимости от производства пластин.
4. Поместите 50 мкл 5 мкг / мл поликлональное F (аb ') ₂ - фрагмента антитела против человеческого Ig (IgG + IgM + IgA) (в PBS) в каждую лунку планшетов ELISpot и инкубировать их при 4 ° С в течение ночи (предпочтительно) или 37 ° С в течение 2 ч ^11.
   Примечание: запечатать края пластин парафильмом до использования.
5. Инверсия пластины для удаления несвязанного Abs, добавьте 200 мкл PBS, в каждую лунку, и инкубировать их в два раза при комнатной температуре в течение 3 мин каждый раз.
6. Добавить 200 мкл PBS с 5% БСА (или RPMI 1640), в каждую лунку для блокирования, и инкубировать их при комнатной температуре в течение 2 ч.
7. Обратить пластины, чтобы удалить блокирующий буфер. Промыть каждую лунку два раза 200 мкл PBS, а на этапе 5.5.
8. Добавить 100 мкл RPMI 1640, в каждую лунку и инкубировать их при 37 ° С.
9. Когда все будет готово к семени клетки, инвертировать пластины, чтобы удалить RPMI 1640.
10. Семенной 100 мкл (5 × 10 ^4), 50 мкл (2,5 × 10 ⁴⁾ и 25 мкл (1,25 × 10 ⁴⁾ клеток (от шагов , 1,19, 2,10, 2,11, 3,10 и 4,6) в ямах ELISpot пластины. С помощью RPMI 1640, довести объем до 150 мкл / лунку.
    Примечание: Минимум одного или двух 2-кратных серийных разведений для посева клеток рекомендуется.
11. Инкубируйте пластин в инкубаторе C 37 ° с 5% CO ₂ в течение 8 - 14 ч ^18. Избегайте перемещения пластин во время инкубации.
12. Инверсия пластины для удаления клеток и RPMI 1640.
13. Добавить 200 мкл / лунку PBS-T (PBS с 0,05% Tween 20) и инкубируют их в 5 раз при комнатной температуре, каждый раз в течение 3 мин. Переверните планшет, чтобы удалить промывочный буфер между каждым из 5 промывок.
14. Добавить либо козьего антитела против человеческого IgG, щелочной фосфатазы (AP), Fcγ специфические Абс (для обнаружения IgG, 1: 5000 в PBS-T) Или козьего антитела против человеческого IgМ-АР, Fcμ фрагмент конкретного Абс (для обнаружения IgM, 1: 5000 в PBS-T) в зону, лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч в темноте.
15. Промыть каждую лунку два раза 200 мкл PBS, а на этапе 5.5.
16. Добавьте 50 bromochloroindolyl раствора мкл / лунку фосфатного-нитро тетразолия (BCIP / NBT) подложки. Фиолетовый-цветные пятна обычно появляются в 5 - 15 мин.
17. Добавьте 100 мкл / лунку DDH ₂ O , чтобы не допустить чрезмерного развития пятен.
18. Промыть пластины с проточной водопроводной водой после полного развития всех пятен.
19. Удалите underdrain пластин и дать им высохнуть на воздухе в темноте.
20. Подсчитывают пятна с помощью автоматического планшет - ридера с блоком изображения сбора / анализа (например, автоматический сканер или вручную через рассекает микроскопом).
    Примечание: Пластины можно хранить при комнатной температуре в темноте и проанализированы позже.

РВМС обеднен эритроцитах и ​​прилипшие клетки (шаги 1,2 до 1,7). Порцию (2 × 10 6) клеток подвергали анализу проточной цитометрии для иллюстрации популяции наивных В - клеток, В - клеток памяти, и ФБФР / ПК в периферической крови (рисунок 1). В МНПК этого донора, около 10% лимфоцитов были CD19 + В - клетки. В B-клеточного отсека, процент CD19 + CD27 - наивных В - клеток составляет около 50%. С другой стороны, около 50% клеток CD19 + В были CD27 + В - клетки памяти 7, 25-26. Следует отметить, что CD27 + клеток памяти B могут быть дополнительно разделены с включением IgD 4. Фенотип циркулирующих PbS можно лучше определить с низким или без выражения поверхности CD20 (CD19 + CD27 + / CD38 + привет CD20 Lo / -) 2, 30-31. Чтобы исключить мертвые клетки, 7-AADмогут быть включены в клетки окрашивания (этап 3.5), а также участок для FSC по сравнению с 7-AAD позволяет стробирования популяцию живых клеток (7-AAD -).

Основные этапы анализа ELISpot изображены на рисунке 2. Оба очищенные В - клетки человека и В - клетки памяти CD19 + CD27 + культивировали в присутствии CpG с RPMI 1640 , в течение 5 дней. Клетки собирали для анализа ELISpot для количественной оценки вновь возникшим ИСС. Если присутствует, то ранее существовавшие УБ выделены из периферической крови вымрут через 48 ч 11. Анализ ELISpot проводили, и пятно изображения , полученные с помощью автоматического сканера пластины, показаны на рисунке 3. Результаты ELISpot обычно будет показывать 50 - 200 IgM-ИСС из 10 4 B клеток , обработанных CpG в течение 5 дней, в то время как количество IgG-ИСС составляет 10 - 50 в 10 4 клеток 11.

Рисунок 2. Иллюстрации из ключевых шагов в ELISpot анализе. (А) Поместите 50 мкл / лунку (5 мкг / мл) F (аb ') 2 - фрагмента антитела против человеческого Ig (IgG + IgM + IgA) в пластине ELISpot в течение 2 ч при температуре 37 ° С или в течение ночи при 4 & deg ; C (предпочтительно) (шаг 5.4). Семенной клеток в лунки планшета ELISpot. Разрешить ИСС прикрепить к PVDF мембрану и секретируют Abs в течение 8 - 14 ч (шаг 5.11). (B) Смыть клеток с PBS (с 0,05% Tween 20). (C) Добавить ЩФ или HRP-CONJugated обнаружение Abs конкретных либо IgG или IgM. (D) Смыть Abs обнаружения, несвязанными. (Е) развивать пятна с раствором субстрата AP или HRP , чтобы соответствовать Abs обнаружения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Результаты ELISPOT от представителя плиты. (A) Очищенная CD19 + В - клетки были помещены в трех соседних скважин (50000 клеток в лунку # 1, 25000 клеток в лунку # 2 и 12500 клеток в лунку # 3, соответственно) пластины ELISpot. Затем клетки культивировали в среде RPMI 1640, в течение ночи (~ 14 ч). Анализ ELISpot проводили после завершения культуры (шаги 5,12 до 5,18). Для Analyzе результаты, планшет ELISpot сканировали для получения изображений с помощью автоматического анализатора, оборудованного сканером и программным обеспечением. Ячейки памяти (B) Очищенная CD19 + CD27 + (10 6 / мл) культивировали в присутствии 5 мкг / мл CpG в течение 5 дней. Клетки обрабатывали , как и в (А) для анализа ELISpot. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Автор заявляет об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.