Этот протокол показывает , как генерировать флуоресцентно помечены, генетически определенные клоновых опухоли в Drosophila глаз / усиков имагинальных дисков (EAD). Он описывает, как препарировать EAD и мозг от личинок третьей возрастной стадии и как обрабатывать их для визуализации и количественной оценки изменений экспрессии генов и опухоли инвазивность.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Drosophila melanogaster возникла как мощная экспериментальная система для функциональных и механистических исследований развития и прогрессирования опухоли в контексте всего организма. Сложные методы создания генетической мозаики облегчают индукцию визуально маркированных, генетически определенных клонов, окруженных нормальными тканями. Клоны могут быть проанализированы с помощью различных молекулярных, клеточных и омиксных подходов. В этом исследовании описывается, как получить флуоресцентно меченные клональные опухоли различной злокачественности в имагинальных дисках глаза/антенны (EAD) личинок дрозофилы с использованием метода мозаичного анализа с помощью репрессируемого клеточного маркера (MARCM). В нем описываются процедуры, как восстановить мозаичный EAD и мозг у личинок и как их обработать для одновременной визуализации флуоресцентных трансгенных репортеров и окрашивания антителами. Чтобы облегчить молекулярную характеристику мозаичной ткани, мы описываем протокол выделения общей РНК из EAD. Процедура вскрытия подходит для восстановления EAD и мозга с любой личиночной стадии. Протокол фиксации и окрашивания имагинальных дисков работает с рядом трансгенных репортеров и антител, которые распознают белки дрозофилы. Протокол выделения РНК может быть применен к различным личиночным органам, целым личинкам и взрослым мухам. Общая РНК может быть использована для профилирования изменений экспрессии генов с использованием подходов-кандидатов или полногеномных подходов. Наконец, мы подробно описываем метод количественной оценки инвазивности клональных опухолей. Несмотря на то, что этот метод имеет ограниченное применение, его основная концепция широко применима к другим количественным исследованиям, в которых необходимо избегать когнитивных искажений.
Введение
Рак является одной из наиболее генетически гетерогенная группа заболеваний, чья заболеваемость и смертность резко возрастает, особенно среди пожилых людей во всем мире. Рак берет свое начало от клонированных опухолевой клетки, инициирующие, что ускользает от механизмов супрессии опухолей и присущая разделяющей из-под контроля. Постепенное накопление генетических повреждений, которые совместно способствуют росту, пролиферации и моторику, предотвращая смерть и дифференцировку преобразует исходную доброкачественное разрастание в высоко злокачественную, метастатической и смертельной опухоли. Стало очевидным , что в дополнение к генетических изменений, прогрессирование оп....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Эта работа использует eyFLP1; Акт> у +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, ванна-Gal80 MARCM 82B Зеленый тестер линии 11. Пересечение тестер дев MARCM 82B зеленого до самцов штаммов , таких как вес; UAS-а; UAS-б RNAi, FRT82B с Мут генотип даст потомство , в котором будет происходить митотической рекомбинации между правыми руками 3 - го гомологичных хромосом. Таким образом, клоны , гомозиготные мутантные по гена с расположенной дистально по отношению к площадке FRT82B будет генерироваться внутри EAD и нейроэпителии мозга. Эти клоны будут выражать GFP, трансгенный а и дсРНК для гена Ь
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для того, чтобы продемонстрировать потенциал метода eyFLP-MARCM для генерации GFP-отмеченные участки определенных генотипов в Drosophila EAD, были вызваны три типа клонов: (1) контроль экспрессии GFP только, (2) злокачественные опухоли , экспрессирующие онкогенного форму небольшой G-белок Ras (Ras V12) на фоне гомозиготной потери генов супрессоров опухолей мазня (Scrib 1) и (3) зарастание но неинвазивным РАН V12 Scrib 1.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методы для создания генетических мозаик в дрозофилы являются одними из самых сложных инструментов для анализа и манипулирования функции гена 33. Система eyFLP-MARCM доказала мощные и надежные , поскольку она позволяет индукцию визуально отмеченных, генетически определенных клонов в пространственно ограниченным способом, т.е. в тканях , где безглазое энхансер активен 9,18. Это особенно важно, когда несколько генетических повреждений объединены в одних и тех же клетках. В т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим Bloomington Stock Center (Bloomington, США), Дирка Боманна, Катю Брюкнер и Иштвана Андо за запасы мух и антитела. Мы благодарим Марека Джиндру и Колина Донохью за комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана премией Софьи Ковалевской для M.U. от Фонда Александра фон Гумбольдта и проектом DFG UH243/1-1 для M.U. от Немецкого научно-исследовательского общества.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Агар | Гьюü рзм&уумл; hle Brecht, Eggenstein, Германия | 00262-0500 | Рецепт корма для мух: Приготовьте 20 л корма для мух из 160 г агара, 360 г дрожжей, 200 г соевой муки, 1,6 кг желтой кукурузной муки, 1,2 л солодового экстракта, 300 мл светлого кукурузного сиропа, 130 мл пропионовой кислоты и 200 мл 15% нипагина. Корм для мух следует готовить в течение 1 часа при 85 °C. |
| Кукурузный сироп | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Меккенхайм, Германия | 01939 | |
| Пропионовая кислота | Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Заррентин, Германия | 4010155063948 | |
| Солодовый экстракт | CSM Deutschland GmbH, Бремен, Германия | 728985 | |
| Соевая мука | Stockmeier Food GmbH, Херфорд, Германия | 1000246441010 | |
| Дрожжи | Werner Ramspeck GmbH, Швабах, Германия | 210099K | |
| Метил-4-бензоат/нипагин | Sigma-Aldrich, Дайзенхофен, Германия | H5501 | Приготовьте 15% исходный раствор с 70% этОН |
| Флаконы для мух дрозофилы | Kisker Biotech, Штайнфурт, Германия | 789008 | |
| пробки для флаконов | K-TK e.K., Ретцштадт, Германия | 1002 | |
| Бутылки с кормом для мухи дрозофилы | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Германия | 960177 | |
| Пробки для бутылок | K-TK e.K., Ретцштадт, Германия | 1002 S | |
| Poly(виниловый спирт) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Германия | 81381 | Рецепт монтажного материала: Растворить 6 г поливинилового спирта 4-88 в 39 мл миллипоры H2O, 6 мл 1 М Трис (pH 8,5) и 12,5 мл глицерина. Перемешать на ночь при 50 ° С и центрифуга 20 минимум при 5 000 об/мин. Добавьте в надосадочную жидкость DABCO, чтобы получить конечную концентрацию 2,5%. Хранить аликвоты при -20 °C. |
| 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан/DABCO | Sigma-Aldrich, Дайзенхофен, Германия | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Дайзенхофен, Германия | 9002-93-1 | |
| Фосфатно-солевой буфер/ PBS | 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4, pH 7,4 в Millipore H2O | ||
| PBST | 0,1% Triton X-100 в PBS | ||
| Paraformaldehyde/PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Германия | 158127 | 4% PFA фиксирующий рецепт: Растворить 4 g PFA в 80 мл Millipore H2O на магнитной пластине мешалки, нагретой до 55 °C. Добавьте 1 М NaOH по каплям, пока все частицы PFA не растворятся. Добавьте 10 мл 10x PBS и отрегулируйте pH до 7,4 с 1 M HCl. Смешайте в 100 и микро; l Triton X-100 и долейте Millipore H2O до 100 мл. Хранить аликвоты при температуре -20 °C. Избегайте повторного размораживания. (ВНИМАНИЕ: ПФА очень токсичен. Приготовьте фиксатор PFA в вытяжном шкафу. Наденьте автономный дыхательный аппарат, перчатки и одежду. Избегайте контакта с кожей, глазами или слизистыми оболочками.) |
| Бычья сыворотка Альбумин / BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Германия | A3059 | Рецепт блокирующего раствора: Растворите 0,3% BSA в PBST |
| флуоресцентно меченый фаллоидин | Invitrogen, Карлсруэ, Германия, Молекулярные зонды | A12379, A22283, A22284 | Фоновый раствор фаллоидина: Растворите порошок (300 ЕД) в 1,5 мл метанола. Хранить при температуре -20 °C. Для окрашивания используйте в разведении 1:250 (A12379, A22283) и 1:100 (A22284) в PBST. |
| 4',6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид/DAPI | Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия | 6335 | DAPI раствор для окрашивания: Приготовьте исходный раствор 5 мг/мл в миллипоре H<суб>2О и храните аликвоты при 4 °C. Используется в разведении 1:1,000 в PBST. |
| Мышиное антитело к H2 | Kurucz et al., 2003 | Используется в разведении 1:500 в блокирующем растворе | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Саффолк, Великобритания | 715-175-151 | Используется в разведении 1:500 в блокирующем растворе |
| Dumont #5 щипцы | Fine Science Tools, Гейдельберг, Германия | 11295-10 | |
| Стеклянная чашка для эмбрионов (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Германия | E90 | |
| Вольфрамовые иглы | Fine Science Tools, Гейдельберг, Германия | 10130-20 | |
| Никелированный держатель штифтов | Fine Science Tools, Гейдельберг, | Германия 26018-17 | |
| Предметные стекла для микроскопа | VWR, Дармштадт, Германия | 631-1553 | |
| Покровные стекла 22 x 22 мм (#1 Menzel-Glä ser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Покровные стекла 24 x 50 мм (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Шверте, Германия | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Шверте, Германия | 06-677-70 | |
| Препарирующий стереомикроскоп | Olympus, Гамбург, Германия | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Япония) | |
| Флуоресцентный стереомикроскоп | Olympus, Гамбург, Германия | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Япония) с ПЗС-камерой | DP72Оснащен узким синим полосовым фильтром для возбуждения GFP других синих возбудимых флуорохромов (фильтр возбуждения BP460-480 нм, барьерный фильтр BA495-540 нм) и узкозеленым возбуждающим и длиннопроходным барьерным фильтром для RFP и других зеленых возбудимых флуорохромов (фильтр возбуждения BP530-550, барьерный фильтр BA575IF). Программное обеспечение: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Конфокальный микроскоп | Olympus, Гамбург, Германия | FV1000 | Оснащен инвертированным микроскопом IX81. Задачи: 20&раз; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40&крат; UPlanFL (NA 1.30) и 60× UPlanApo (NA 1.35). Лазеры: УФ-лазерный диод LD405 (50 мВт), аргоновый лазер, многоканальный 457/(476)/ 488/515 (40 мВт), желтый/зеленый лазерный диод LD560 (15 мВт) и красный лазерный диод 635 (20 mW). Программное обеспечение: Fluoview 2.1c Software |
| Охлаждаемый инкубатор дрозофил | Ewald Innovationstechnik GmbH, Бад-Ненндорф, Германия | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Дармштадт, Германия | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Дармштадт, Германия | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Дармштадт, Германия | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Дармштадт, Германия | 2302700 | Протокол совместим с другими реагентами на основе TRIzol, e., TRIreagent от Sigma (кат. Nr.T9424), реагент TRIzol от Thermofisher (кат. Nr. 15596). |
| Диэтилпирокарбонат/DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Германия | D5758 | Развести DEPC 1:1,000 в миллипоре H2O, перемешать на ночь и автоклав. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Карлсруэ, Германия | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Дармштадт, Германия | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µ l) | Thermo Scientific, Schwerte, Германия | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Карлсруэ, Германия | 10-814-010 | |
| Тригидрат ацетата натрия | VWR, Дармштадт, Германия | 27652.232 | Приготовьте 3 М раствор ацетата натрия с DEPC-H2O и отрегулируйте pH до 5,2 |
| 2-Propanol | Merck, Дармштадт, Германия | ||
| Этанол | Merck, Дармштадт, Германия | 100983 | Приготовление 75% разведения этиона с использованием DEPC-H2O. |
| УФ/ВИ-спектрофотометр NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Шверте, Германия | ND-8000 | |
| Микроцентрифуга Eppendorf (охлаждаемая) | Thermo Scientific, Шверте, Германия | 5417R | |
| Набор для анализа РНК Experion StdSens | Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü Нхен, Германия | 7007103 | |
| Автоматизированная электрофорезная станция Experion | Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Германия | 7007010 | |
| SuperScript III Обратная транскриптаза | Thermo Scientific, Шверте, Германия | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Лёвен, Бельгия | Prepare 100 µ M складские растворы в DEPC-H2O и хранить при -20 °°; C | |
| dNTP Mix | Takara Bio Europe/Clonetech, Сен-Жермен-ан-Ле, Франция | 4030 | Магазинные аликвоты 25 & микро; l при -20°С; C |
| CFX96 Сенсорная система обнаружения ПЦР в реальном времени | Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Германия | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Германия | 170-8882 | |
| ПЦР-планшеты с жесткой оболочкой 96-луночные, тонкостенные | Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü Нхен, Германия | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Германия | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Лёвен, Бельгия | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Обратный праймер | Integrated DNA Technologies, Лёвен, Бельгия | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Левен, Бельгия | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Обратный праймер | Integrated DNA Technologies, Левен, Бельгия | 5' ACG TCT TGC CGT TCT AGG TGA 3' |
Ссылки
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 3....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
