Методическая статья

Drosophila Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

DOI:

10.3791/54585

⸱

6 октября 2016 г.

 , 
1Institute for Genetics, Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол показывает , как генерировать флуоресцентно помечены, генетически определенные клоновых опухоли в Drosophila глаз / усиков имагинальных дисков (EAD). Он описывает, как препарировать EAD и мозг от личинок третьей возрастной стадии и как обрабатывать их для визуализации и количественной оценки изменений экспрессии генов и опухоли инвазивность.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster возникла как мощная экспериментальная система для функциональных и механистических исследований развития и прогрессирования опухоли в контексте всего организма. Сложные методы создания генетической мозаики облегчают индукцию визуально маркированных, генетически определенных клонов, окруженных нормальными тканями. Клоны могут быть проанализированы с помощью различных молекулярных, клеточных и омиксных подходов. В этом исследовании описывается, как получить флуоресцентно меченные клональные опухоли различной злокачественности в имагинальных дисках глаза/антенны (EAD) личинок дрозофилы с использованием метода мозаичного анализа с помощью репрессируемого клеточного маркера (MARCM). В нем описываются процедуры, как восстановить мозаичный EAD и мозг у личинок и как их обработать для одновременной визуализации флуоресцентных трансгенных репортеров и окрашивания антителами. Чтобы облегчить молекулярную характеристику мозаичной ткани, мы описываем протокол выделения общей РНК из EAD. Процедура вскрытия подходит для восстановления EAD и мозга с любой личиночной стадии. Протокол фиксации и окрашивания имагинальных дисков работает с рядом трансгенных репортеров и антител, которые распознают белки дрозофилы. Протокол выделения РНК может быть применен к различным личиночным органам, целым личинкам и взрослым мухам. Общая РНК может быть использована для профилирования изменений экспрессии генов с использованием подходов-кандидатов или полногеномных подходов. Наконец, мы подробно описываем метод количественной оценки инвазивности клональных опухолей. Несмотря на то, что этот метод имеет ограниченное применение, его основная концепция широко применима к другим количественным исследованиям, в которых необходимо избегать когнитивных искажений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рак является одной из наиболее генетически гетерогенная группа заболеваний, чья заболеваемость и смертность резко возрастает, особенно среди пожилых людей во всем мире. Рак берет свое начало от клонированных опухолевой клетки, инициирующие, что ускользает от механизмов супрессии опухолей и присущая разделяющей из-под контроля. Постепенное накопление генетических повреждений, которые совместно способствуют росту, пролиферации и моторику, предотвращая смерть и дифференцировку преобразует исходную доброкачественное разрастание в высоко злокачественную, метастатической и смертельной опухоли. Стало очевидным , что в дополнение к генетических изменений, прогрессирование опухоли требует изменений в окружающей стромы и перекрестных помех между типами опухолей и множественной клеток (например, фибробласты, иммунных и эндотелиальных клеток) в своей микросреде. Понимание молекулярных принципов, лежащих в основе злокачественной трансформации, включая опухоли стромы взаимодействий имеет большое значение для развития предупреждеТион и раннего скрининга стратегии, а также новые и эффективные методы лечения для борьбы с метастазирования рака и лекарственной устойчивости.

Плодовой мушки дрозофилы стала привлекательной системой для исследования рака 1-4 в связи с его быстрым временем поколения, замечательное сохранение сигнальных узлов между мух и людей, ограниченной генетической избыточности и богатства передовых генетических инструментов , которые облегчают манипуляции практически любого гена в временно и пространственно ограниченным способом. Генетически определенные опухоли различной злокачественной опухоли могут быть воспроизводимо инженерии в дрозофилы путем введения амплитудно и с потерей функции мутации в субпопуляции клеток - предшественников в противном случае дикого типа ткани с использованием метода MARCM 5. Инструмент MARCM сочетает в себе ФЛП / FRT (ФЛП рекомбиназа / ФЛП распознавание цели) -опосредованной митотической рекомбинации 6 с FLP-аута 7 и Gal4 / UAS (Upstream активации последовательности) 8 гена - мишенисистемы экспрессии 9. С помощью этого метода экспрессии любого UAS на основе трансгенов, включая онкогена или флуоресцентный белок кДНК или инвертированные повторы ДНК для дцРНК-индуцированной молчанием генов, будет ограничено клон клеток, которые потеряли определенный генетический локус и репрессор Gal4 в результате рекомбинации (Рисунок 1А). Клональный пятна , отмеченные зеленым флуоресцентным (GFP) или красный флуоресцентные белки (например, RFP, DsRed, mCherry) может быть легко отслеживаться на протяжении развития, выделяли и анализировали. Важно отметить, что их поведение может быть непосредственно по сравнению с прилегающей типа ткани дикого. Таким образом, вопросы, имеющие отношение к клетке автономных и неавтономных эффекты генетических поражений могут быть легко изучены. Подобно млекопитающих, только клоны , в которых несколько онкогенных поражений комбинируются становятся злокачественными у дрозофилы и резюмировать основные признаки рака у млекопитающих. Они overproliferate, уйти от апоптоза, вызывают воспаление, становятся бессмертными и InvaSIVE, в конечном счете убивает хозяина 10-17.

Здесь мы опишем протокол для создания генетически определенные клоновых опухоли в глаз / усиков и мозговой ткани личинок дрозофилы с использованием метода MARCM. Метод основан на MARCM тестера запаса, выражающего дрожжи ФЛП рекомбиназу под контролем ушка энхансер (eyFLP) 18,19. Таким образом, GFP-меченные клоны генерируются в обоих peripodial и столбчатым эпителием EAD и нейроэпителии головного мозга на протяжении эмбриональной и личиночной стадии (Фигура 1А, В и ссылочных 20). Клоны можно легко проследить до взрослой жизни, как EAD развивается в взрослых глаз, антенны и головной капсулы в то время как нейроэпителия приводит к нейробластов, которые производят дифференцированные оптические нейроны лепестка.

Для облегчения обширной молекулярной, функциональной и фенотипическую характеристику мозаики ткани, мы деписец протокол для рассечения EAD и головного мозга от личинок третьей возрастной стадии и кратко описано, как обрабатывать их для трех различных применений: (I) обнаружения трансгенных флуоресцентных репортеры и иммунное окрашивание, (II) Количественное инвазивности опухолей и (III), анализ экспрессия гена изменяется с помощью количественного в реальном времени ПЦР (QRT-PCR) или высокой пропускной способностью мРНК последовательности (мРНК-Seq) (рис 1C).

Протокол иммунное может быть использован для визуализации любой белок, представляющий интерес со специфическим антителом. Трансгенные флуоресцентные репортеры транскрипции обеспечивают удобную и точную пространственно-временную информацию о деятельности конкретного сигнального пути. Клеточная линиеспецифический репортеры, с другой стороны, отражают количественные и качественные изменения в клеточных популяций в пределах мозаичного ткани и среди опухолей различных генотипов. Количественное инвазивного поведения облегчает сравнение опухоли злокачественного между генотипомs. И, наконец, протокол, описывающий процесс сбора и обработки мозаики EAD для выделения РНК подходит как для малых и больших масштабах вниз по течению приложений, таких как обратной транскрипции с последующей QRT-PCR и общегеномного мРНК-SEQ соответственно. Качественные и количественные данные, полученные из этих анализов являются новые проникновения в суть социального поведения клоновых опухолей. Кроме того, они создают прочную основу для функциональных исследований о роли отдельных генов, генетических сетей и микросреды опухоли на разных стадиях и аспекты онкогенеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Эта работа использует eyFLP1; Акт> у +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, ванна-Gal80 MARCM 82B Зеленый тестер линии 11. Пересечение тестер дев MARCM 82B зеленого до самцов штаммов , таких как вес; UAS-а; UAS-б RNAi, FRT82B с Мут генотип даст потомство , в котором будет происходить митотической рекомбинации между правыми руками 3 - го гомологичных хромосом. Таким образом, клоны , гомозиготные мутантные по гена с расположенной дистально по отношению к площадке FRT82B будет генерироваться внутри EAD и нейроэпителии мозга. Эти клоны будут выражать GFP, трансгенный а и дсРНК для гена Ь (рис 1А). Различные eyFLP-MARCM тестер линии для рекомбинации на X, 2L, 2R, 3L и 3R были созданы и доступны в лету сообщества.

1. Fly Обработка, Крестики и Балетмейстер

  1. Разверните соответствующую MARCM тестер запаса при комнатной температуре путем заполнения нескольких боttles в то же время. Флип взрослых в свежие бутылки каждые 2-3 дня, так что достаточно дев могут быть собраны для последующих скрещиваний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе дев, во избежание длительного воздействия CO 2 , так как это ставит под угрозу женскую фертильность.
  2. В зависимости от масштаба эксперимента, установить мух кресты во флаконах с использованием по меньшей мере 10 MARCM тестера дев и 4 мужчин (например, для визуализации флюоресцентных репортеров и иммуноокрашивания) или в бутылках с , по меньшей мере 30 дев и 10 мужчин (например, для Выделение РНК и количественное определение инвазивности).
  3. Повысить потомству при 25 ° С в течение долгого дня 16 ч / 8 ч свет-темнота цикла. Флип родителей в новые флаконы / бутылки каждые 24 ч для облегчения воспроизводимый постановки личинок и предотвращения перенаселенности.
    Примечание: Начиная с 6-й день после откладки яиц (AEL), поздний контроль возрастной стадии личинки перестают питаться в-третьих, начать блуждающих и введите pupariation. В противоположность этому, начало перехода личиночной-куколки может быть деили уложены несуществующими у личинок с EAD несущих гиперпластических или злокачественные опухоли клоновых.

2. Сбор третьей возрастной стадии личинок

  1. Для иммуноокрашиванием, собрать около 20 конце личинок третьей возрастной стадии (побродив по стене, и те, сопоставимого размера тела от пищи). Используйте пинцет, чтобы аккуратно подобрать личинки из флакона или бутылки и передавать их в эмбрион стеклянную посуду, заполненную фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
    1. Для выделения РНК и количественного определения инвазивности, собирают по меньшей мере 80 позднюю личинок третьей возрастной стадии (побродив по стене и те, сопоставимого размера тела от пищи). Используйте бутылку Брызги впрыснуть PBS в муху флакон, содержащий личинки, пока поверхность не покрыта.
    2. Смягчение верхние слои пищи с помощью шпателя и вылить пищевую затора, содержащую личинки в чашку Петри. Использование щипцов, осторожно выбрать личинок и передать их в эмбрион стеклянную посуду, наполненную PBS.
  2. Промыть личинок с PBS ЕНТиль все остаточные продукты питания удаляется. Осмотрите личинки под флуоресцентным стереомикроскопа с 8 до 16х увеличением , чтобы отбросить все "личинки барсов" , которые несут случайные GFP-позитивные пятна по всему телу личиночной (рис 2А, 2В и обсуждение см раздел).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения РНК включают предпоследнюю стадию промывания в 70% этанола в течение 1 мин.
  3. Поместите блюдо, не содержащий выбранные личинок в PBS на льду до вскрытия. Процесс личинки в течение 30 мин, чтобы избежать негативных последствий голода и холода.

3. Вскрытие Личинка

  1. Для того, чтобы рассекать EAD под стереомикроскопа, использовать одну пару щипцов, чтобы мягко нажать среднюю часть личинки против стеклянной посуды внизу. Со вторыми щипцов, возьмите личиночной крючки рот и вытащить их от тела (рис 2C).
    Примечание: Тяговое усилие часто бывает достаточно, чтобы сломать оптические стебли, соединяющие EAD Пайг до долей мозга. Если мозг или его части оставаться прикреплены к EAD и их присутствие не требуется для дальнейшего применения, перерезал оптические стебельков с помощью двух пар щипцов. Для инвазивных опухолей (например, ПБУ V12 Scrib 1) связь между EAD и долей мозга становится все более и более затененных со временем путем зарастания и миграции клоновых клетки.
    1. Для получения комплекса EAD / головного мозга с интактной вентральной нервной цепочки (VNC) (рис 2D), использование щипцов , чтобы вырезать личинку в середине тела. Откажитесь заднюю половину.
    2. Держите переднюю половину тела личинки между концами одного щипцов, переворачивать личинку наизнанку, нажав на крючки во рту с кончиком второго пинцетом и прокаткой кутикулу над ним с первой парой щипцов.
  2. Использование щипцов тщательно удалить все посторонние ткани (например, слюнные железы, жир тела, и кишечнике), оставляя пару EAD иликомплекс ЕАД / мозг подключен к крюкам рта. Распутать крючки рта от вышележащих кутикулы. Освободите VNC путем разделения аксонов выступы , простирающиеся на мышцы тела и эпидермиса (рис 1B, 2C, 2D).
    Примечание: Крюки рот для безопасного манипулирования ткани с щипцами и способствовать более эффективному тонуть и легкое распознавание ткани во время стирки. Рассеченные EAD морфологию изменения относительно быстро при хранении нефиксированной в PBS. Ограничить время рассечение до 20-30 мин.
  3. Для переноса ткани, покройте P20 кончик микропипетки пипеткой оставшегося тела каркасов несколько раз вверх и вниз. Для передачи больших комплексов EAD / мозга, разрезал P20 микропипетки кончик с помощью ножниц.
    Примечание: Процедура покрытия имеет решающее значение для предотвращения прилипания и потерю рассеченной ткани во время передачи данных. Использование P20 микропипетки минимизирует перенос PBS в Фиксирующий раствор, ограничивая нежелательное разбавление.
    1. Для иммуноокрашиванием, трансферрассеченные EAD в 0,5 мл пробирку, заполненную 400 мкл 4% параформальдегида (PFA) фиксаторе. Используйте 1,5 мл пробирку с 1 мл PFA для увеличения EAD / мозговые комплексы, предназначенные для озвучивания инвазивности.
      ВНИМАНИЕ: PFA является высокотоксичным. Надевайте защитные перчатки и одежду. Избегать контакта с кожей, глазами или слизистых оболочек.
    2. Для выделения РНК передать расчлененный EAD в новую стеклянную посуду, наполненную холодной PBS. Используйте пинцет, чтобы очистить EAD от кольца и лимфатических желез, чтобы свести к минимуму примеры загрязнения.
    3. Отсоединение EAD из крюков рта путем разъединять соединение между антенным дисками и крючками рот с помощью щипцов (рис 2E). Для того, чтобы избежать деградации РНК и экспрессии генов артефактов, ограничить время, рассечение до 30 мин. Перейдите к шагу 7.
      Примечание: опытный исследователь может рассекать около 60 личинок в течение 30 мин времени за исключением необходимого для сбора личинок и промывки. Всего урожайность РНК зависит от размера EAD, которые различаются между генотипами и девелопментал этапы. Вскрытие 80-100 управления EAD пар с конца личинок третьей возрастной стадии должны давать 5-8 мкг тотальной РНК.

4. Закрепление, Иммунологическое и монтирование

  1. Закрепить образцы в PFA фиксаторе в течение 25 мин при нутационное при комнатной температуре. Время фиксации может быть продлен до 60 мин без изменения морфологии тканей и антигенность белков.
  2. Удалить закрепляющего и мыть образцы с PBST (PBS с 0,1% Тритон Х-100) три раза в течение 10 мин с использованием nutator. Используйте достаточный объем PBST для каждой стадии промывки (400 мкл / 0,5 мл трубки).
    Примечание: Фиксированный EAD / мозговые комплексы, предназначенные для озвучивания инвазивности не требуют иммуноокрашивания. Сигнал GFP остается хорошо виден после фиксации. Перейдите к шагу 4.4 для окончательного рассечение.
    1. Для иммунологического окрашивания, блок ткани в 200 мкл блокирующего раствора (PBST с 0,3% бычьего сывороточного альбумина) в течение 20 мин при осторожном перемешивании при комнатной температуре.
      1. Выдержите с чопорнымиичные антитела разводили в 100 мкл блокирующего раствора в течение ночи при температуре 4 ° С при осторожном встряхивании. Обратитесь к первичному технического описания антител или опубликованной литературе для разведения антител рекомендуемым.
        Примечание: Разбавление первичное антитело, возможно, должны быть оптимизированы.
      2. После пяти 10 мин промывок в PBST, Пятно ткани с флуоресцентными вторичными антителами, разводили в блокирующем растворе при осторожном встряхивании в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С в темноте.
      3. Вымойте образцы три раза 10 мин в PBST.
  3. Заменить PBST с 500 мкл DAPI-окрашивания раствора. Для обозначения F-актин, добавьте фаллоидина конъюгированный с флуоресцентной красителя DAPI-окрашивание раствора. После 15-минутного нутации в темноте, мыть ткани один раз в течение 10 мин с PBST.
    Примечание: F-актина маркировка может быть выполнена независимо от DAPI окрашивания.
  4. Для заключительного этапа рассечение, передать ткань обратно в PBS заполненный стеклянной посуде с использованием 1 мл пиPette. Используя две пары щипцов обрезать рот крючки.
    1. Отделить мозги, которые будут использоваться для количественной оценки инвазивности из EAD путем разрезания оптического стебелек как заросший EAD может затруднить анализ.
  5. Поместите каплю монтажной среды (15 мкл для х 22 мм покровным 22 мм) на объективный слайд. С помощью щипцов советов, распространять среду в тонкий слой. Передача EAD, мозги или комплексы EAD / мозга в монтажную среду с P20 микропипетки.
  6. Используйте пинцет советы или вольфрамовый стержень для распределения ткани и выпрямить VNC на слайде.
  7. Для того, чтобы избежать образования пузырей при монтаже, первое прикосновение один край покровным к монтажной среде, а затем медленно опустите на монтажную среду с помощью щипцов. Используйте небольшие кусочки фильтровальной бумаги или ткани протрите, чтобы поглотить избыток гистологическая среда вокруг покровное края.
    Примечание: ДАБЦО / поли (виниловый спирт), 4-88 гистологическая среда затвердеваетпри 4 ° С в течение часа. Слайды могут храниться в течение нескольких месяцев при температуре 4 ° С.

5. конфокальной микроскопии

  1. Приобретать одиночные секции конфокальной и стеки с помощью конфокальной микроскопии, оснащенный 20x, целями нефти 40X и 60X.
  2. Предотвратить насыщенность пикселей. Используйте те же параметры получения изображений , включая разрешение изображения, входной мощности лазера, коэффициент усиления, смещение, кадров усреднения, размер шага в серии Z и сохранить эти настройки для всех генотипов , чтобы для сравнения интенсивностей пикселей между различными генотипами 21,22.
    Примечание: Для визуализации комплекса / мозга EAD, создавать максимальные проекции и сшить соответствующие, соседние изображения. Для окончательной подготовки изображения используйте программное обеспечение для обработки изображений пост для сборки панели и для регулировки яркости и контрастности.

6. Количественное опухолевой инвазии

  1. Определить систему подсчета очков, которая будет характеризовать различные уровни опухолевых invasivenesS с учетом пространственной структуры вторжения и количество GFP-позитивных клеток, распространяющихся в мозг и VNC. Подготовить оценочные листы для документации (Рисунок 3А).
  2. Гора, по крайней мере 80 фиксированных неповрежденные мозги для каждого генотипа на одном слайде с использованием 40 мкл монтажной среды на 24 мм х 50 мм покровное.
    1. Чтобы разрешить объективную скоринг, задать нейтральную сторону для анонимизации слайды, так что процедура подсчета очков является несмещенной. Оценка анонимными слайды двух лабораторных членов независимо друг от друга. Раскрывать генотипы только после того, как подсчет закончен.
  3. Оценить степень злокачественности слепой озвучивания смонтированных мозги под флуоресцентным стереомикроскопа, снабженного набором фильтров GFP. Используйте маркер для обозначения мозги , которые уже были просмотрены , чтобы избежать двойного учета (рис 3B).
  4. Рассчитывают процент мозга, попадающих в каждую из определенных категорий инвазивных на генотип. Определить статистические Significance с помощью теста хи-квадрат (рис 3C).

7. Выделение РНК, ДНКазы лечение и качество проверки

Примечание: Все реагенты (растворы, из пластмассы), используемые в следующих шагах должны быть свободны от активности РНКазы. Всегда носите перчатки и использовать химический капюшон для работы с органическими растворителями.

  1. Перенесите чистую EAD с покрытием наконечника P20 микропипетки в 1,5 мл трубки.
  2. Пусть слив ткани в нижней части трубки, осторожно удалите PBS и заменить его на 100 мкл РНК лизирующего реагента (достаточное количество до 140 EAD).
  3. Lyse ткани встряхиванием. На этом этапе образцы могут быть глубоко замораживают в жидком азоте и хранили при -80 ° С или непосредственно обработаны с помощью стандартного протокола для выделения РНК.
    Примечание: Образцы подобных генотипов из нескольких раундов рассечение могут быть объединены в один раз лизирующего реагента РНК.
  4. Наполните объем образца до 0,9 мл с помощью реагента РНК для лизиса. Добавить 0,2 мл хлороформа и смешивают образцы vigorously в течение 15-20 сек.
  5. После 2 до 3 мин инкубации при комнатной температуре, Центрифуга образцов при 10000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  6. Передача бесцветную верхнюю водную фазу, содержащую РНК в новую пробирку, не нарушая интерфазу. Держитесь подальше от интерфазы, поскольку она содержит белки и геномную ДНК.
    Примечание: Восстановленные объем должен составлять около 60% от объема реагента РНК лизиса используют для гомогенизации.
  7. Осадить РНК путем добавления 0,5 мл изопропилового спирта. Vortex и инкубировать образцов при комнатной температуре в течение 10 мин.
  8. Центрифуга образцов при 10000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  9. Удалите супернатант и промыть осадок РНК один раз с 600 мкл 75% этанола. После короткого вихря и центрифугирования (10000 х г в течение 7 мин при 4 ° С) отбрасывать весь этанол и пусть осадок РНК сушат на воздухе в течение 5-10 мин размещения открытую трубу на чистую ткань салфеткой.
    Примечание: осадок РНК может быть видна как крошечное непрозрачной / белый стсозревший в нижней части трубки или невидимым. Оставшиеся капли этанола могут быть тщательно удалены с P10 микропипетки наконечник.
  10. Растворите РНК в 50 мкл DEPC-обработанной воды, путем встряхивания или проходя раствор несколько раз через кончика пипетки.
  11. Для того, чтобы свести к минимуму загрязнение с геномной ДНК, лечить тотальной РНК с ДНКазы путем добавления 50 мкл смеси, содержащей 1 мкл ДНКазы (2 ед / мкл) и 10 мкл 10-кратного буфера ДНКазы в ДЭФЦ-обработанной воде. Vortex и спином вниз.
  12. Инкубируйте образцы при 37 ° С в водяной бане или нагревательный блок 30 до 40 мин. После инкубации добавляют 100 мкл DEPC обработанной воды в каждом образце.
  13. Для того, чтобы инактивировать ферментативную активность и очистить РНК из ДНКазы, добавляют 200 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1) раствор, вортексе в течение 1 мин и Центрифуга образцов при 10000 х г в течение 7 мин при 4 ° С.
  14. Аккуратно перенести верхнюю водную фазу, содержащую РНК в свежую пробирку. Добавить равный объем (200 мкл)хлороформа, перемешивают и повторяют центрифугирование сверху.
  15. Осторожно собрать верхнюю фазу и осадить РНК путем добавления 1/10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,2 готовили в DEPC H 2 O и 2,5 объемов 100% этанола. Тщательно перемешать встряхиванием.
    Примечание: при добавлении 0,5 мкл гликогена (20 мкг / мкл) в осадительной смеси позволяет визуализировать осадок РНК. Для того, чтобы свести к минимуму потери РНК, использовать силиконизированные, низкие связывания 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  16. Осаждени РНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч.
    Примечание: инкубация может проводиться в течение ночи. Образцы могут быть помещены при -80 ° С, а также.
  17. Осадок РНК центрифугированием при 10000 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Мытье и сухой осадок после описания в 7.9.
  18. Растворите РНК в 10-15 мкл DEPC-обработанной воды. Магазин РНК при -80 ° С.
  19. Определить количество и чистоту РНК путем измерения оптической плотности при 230 нм, 260 нм и 280 нм с использованием спектрофотометра. Рассчитать РНК сотрудничествоncentration путем применения конвенции, что 1 OD при 260 нм составляет 40 мкг / мл РНК.
    Примечание: отношение А 260/280 "чистой" РНК составляет 2,0 в то время как отношение А 260/230 должно находиться в диапазоне 2,0-2,2. Образцы РНК с 260/280 отношением А между 1,7 и 2,0 подходят для последующих применений , таких как синтез кДНК. Для получения мРНК-ПОСЛ библиотек, качество и количество РНК должна быть проверена с помощью автоматизированной системы электрофореза. Отношение 28S / 18S должно быть выше 1,8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы продемонстрировать потенциал метода eyFLP-MARCM для генерации GFP-отмеченные участки определенных генотипов в Drosophila EAD, были вызваны три типа клонов: (1) контроль экспрессии GFP только, (2) злокачественные опухоли , экспрессирующие онкогенного форму небольшой G-белок Ras (Ras V12) на фоне гомозиготной потери генов супрессоров опухолей мазня (Scrib 1) и (3) зарастание но неинвазивным РАН V12 Scrib 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы для создания генетических мозаик в дрозофилы являются одними из самых сложных инструментов для анализа и манипулирования функции гена 33. Система eyFLP-MARCM доказала мощные и надежные , поскольку она позволяет индукцию визуально отмеченных, генетически определенных клонов в пространственно ограниченным способом, т.е. в тканях , где безглазое энхансер активен 9,18. Это особенно важно, когда несколько генетических повреждений объединены в одних и тех же клетках. В т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Bloomington Stock Center (Bloomington, США), Дирка Боманна, Катю Брюкнер и Иштвана Андо за запасы мух и антитела. Мы благодарим Марека Джиндру и Колина Донохью за комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана премией Софьи Ковалевской для M.U. от Фонда Александра фон Гумбольдта и проектом DFG UH243/1-1 для M.U. от Немецкого научно-исследовательского общества.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АгарГьюü рзм&уумл; hle Brecht, Eggenstein, Германия00262-0500Рецепт корма для мух: Приготовьте 20 л корма для мух из 160 г агара, 360 г дрожжей, 200 г соевой муки, 1,6 кг желтой кукурузной муки, 1,2 л солодового экстракта, 300 мл светлого кукурузного сиропа, 130 мл пропионовой кислоты и 200 мл 15% нипагина. Корм для мух следует готовить в течение 1 часа при 85  °C.
Кукурузный сиропGrafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Меккенхайм, Германия01939
Пропионовая кислотаCarl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия6026.1
CornmealReformKontor GmbH, Заррентин, Германия4010155063948
Солодовый экстрактCSM Deutschland GmbH, Бремен, Германия728985
Соевая мукаStockmeier Food GmbH, Херфорд, Германия1000246441010
ДрожжиWerner Ramspeck GmbH, Швабах, Германия210099K
Метил-4-бензоат/нипагинSigma-Aldrich, Дайзенхофен, ГерманияH5501Приготовьте 15% исходный раствор с 70% этОН
Флаконы для мух дрозофилыKisker Biotech, Штайнфурт, Германия789008
пробки для флаконовK-TK e.K., Ретцштадт, Германия1002
Бутылки с кормом для мухи дрозофилыGreiner Bio-One, Frickenhausen, Германия960177
Пробки для бутылокK-TK e.K., Ретцштадт, Германия1002 S
Poly(виниловый спирт) 4-88/[-CH2CHOH-]nSigma-Aldrich, Deisenhofen, Германия81381Рецепт монтажного материала: Растворить 6 г поливинилового спирта 4-88 в 39  мл миллипоры H2O, 6 мл 1 М Трис (pH 8,5) и 12,5 мл глицерина. Перемешать на ночь при 50  ° С и центрифуга 20  минимум при 5 000 об/мин. Добавьте в надосадочную жидкость DABCO, чтобы получить конечную концентрацию 2,5%. Хранить аликвоты при -20  °C.
1,4-диазабицикло[2.2.2]октан/DABCO Sigma-Aldrich, Дайзенхофен, ГерманияD2522
Triton X-100Sigma-Aldrich, Дайзенхофен, Германия9002-93-1
Фосфатно-солевой буфер/ PBS137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4, pH 7,4 в Millipore H2O
PBST0,1% Triton X-100 в PBS
Paraformaldehyde/PFASigma-Aldrich, Deisenhofen, Германия1581274% PFA фиксирующий рецепт: Растворить 4  g PFA в 80 мл Millipore H2O на магнитной пластине мешалки, нагретой до 55  °C. Добавьте 1 М NaOH по каплям, пока все частицы PFA не растворятся. Добавьте 10 мл 10x PBS и отрегулируйте pH до 7,4 с 1 M HCl. Смешайте в 100 и микро; l Triton X-100 и долейте Millipore H2O до 100 мл. Хранить аликвоты при температуре -20 °C. Избегайте повторного размораживания. (ВНИМАНИЕ: ПФА очень токсичен. Приготовьте фиксатор PFA в вытяжном шкафу. Наденьте автономный дыхательный аппарат, перчатки и одежду. Избегайте контакта с кожей, глазами или слизистыми оболочками.)
Бычья сыворотка Альбумин / BSASigma-Aldrich, Deisenhofen, ГерманияA3059Рецепт блокирующего раствора: Растворите 0,3% BSA в PBST
флуоресцентно меченый фаллоидинInvitrogen, Карлсруэ, Германия, Молекулярные зондыA12379, A22283, A22284Фоновый раствор фаллоидина: Растворите порошок (300 ЕД) в 1,5 мл метанола. Хранить при температуре -20 °C. Для окрашивания используйте в разведении 1:250 (A12379, A22283) и 1:100 (A22284) в PBST.
4',6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид/DAPICarl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия6335DAPI раствор для окрашивания: Приготовьте исходный раствор 5 мг/мл в миллипоре H<суб>2О и храните аликвоты при 4 °C. Используется в разведении 1:1,000 в PBST.
Мышиное антитело к H2Kurucz et al., 2003Используется в разведении 1:500 в блокирующем растворе
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch, Саффолк, Великобритания715-175-151Используется в разведении 1:500 в блокирующем растворе
Dumont #5 щипцыFine Science Tools, Гейдельберг, Германия11295-10
Стеклянная чашка для эмбрионов (30  mm)Thermo Scientific, Schwerte, ГерманияE90
Вольфрамовые иглыFine Science Tools, Гейдельберг, Германия10130-20
Никелированный держатель штифтовFine Science Tools, Гейдельберг,Германия 26018-17
Предметные стекла для микроскопаVWR, Дармштадт, Германия631-1553
Покровные стекла 22 x 22 мм (#1 Menzel-Glä ser)VWR, Darmstadt, Germany631-1336
Покровные стекла 24 x 50 мм (0.13-0.16  mm)Thermo Scientific, Шверте, Германия1076371
Kimtech Science Precision WipesThermo Scientific, Шверте, Германия06-677-70
Препарирующий стереомикроскопOlympus, Гамбург, ГерманияSZX7 (DF PLAPO 1X-4 Япония)
Флуоресцентный стереомикроскопOlympus, Гамбург, ГерманияSZX16 (SDF PLAPO 0.8X Япония) с ПЗС-камеройDP72Оснащен узким синим полосовым фильтром для возбуждения GFP других синих возбудимых флуорохромов (фильтр возбуждения BP460-480 нм, барьерный фильтр BA495-540 нм) и узкозеленым возбуждающим и длиннопроходным барьерным фильтром для RFP и других зеленых возбудимых флуорохромов (фильтр возбуждения BP530-550, барьерный фильтр BA575IF). Программное обеспечение: Olympus cellSens Standard 1.11.
Конфокальный микроскопOlympus, Гамбург, ГерманияFV1000Оснащен инвертированным микроскопом IX81. Задачи: 20&раз; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40&крат; UPlanFL (NA 1.30) и 60× UPlanApo (NA 1.35). Лазеры: УФ-лазерный диод LD405 (50  мВт), аргоновый лазер, многоканальный 457/(476)/ 488/515 (40  мВт), желтый/зеленый лазерный диод LD560 (15  мВт) и красный лазерный диод 635 (20  mW). Программное обеспечение: Fluoview 2.1c Software
Охлаждаемый инкубатор дрозофилEwald Innovationstechnik GmbH, Бад-Ненндорф, Германия  Sanyo MIR553
Squirt bottleVWR, Дармштадт, Германия215-8105
BD Clay Adams Nutator MixerVWR, Дармштадт, Германия15172-203
ELMI Digital Rocking ShakerVWR, Дармштадт, ГерманияDRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis ReagentVWR, Дармштадт, Германия2302700Протокол совместим с другими реагентами на основе TRIzol, e., TRIreagent от Sigma (кат. Nr.T9424), реагент TRIzol от Thermofisher (кат. Nr. 15596).
Диэтилпирокарбонат/DEPCSigma-Aldrich, Deisenhofen, ГерманияD5758Развести DEPC 1:1,000 в миллипоре H2O, перемешать на ночь и автоклав.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Карлсруэ, Германия15593-031
ChloroformMerck, Дармштадт, Германия102445
TURBO DNase (2 U/µ l)Thermo Scientific, Schwerte, ГерманияAM2238
Invitrogen UltraPure GlycogenThermoFischer Scientific, Invitrogen, Карлсруэ, Германия10-814-010
Тригидрат ацетата натрияVWR, Дармштадт, Германия27652.232Приготовьте 3 М раствор ацетата натрия с DEPC-H2O и отрегулируйте pH до 5,2
2-PropanolMerck, Дармштадт, Германия
ЭтанолMerck, Дармштадт, Германия100983Приготовление 75% разведения этиона с использованием DEPC-H2O.
УФ/ВИ-спектрофотометр NanoDrop ND-8000Thermo Scientific, Шверте, ГерманияND-8000
Микроцентрифуга Eppendorf (охлаждаемая)Thermo Scientific, Шверте, Германия5417R
Набор для анализа РНК Experion StdSensBio-Rad Laboratories GmbH, Mü Нхен, Германия7007103
Автоматизированная электрофорезная станция ExperionBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Германия7007010
SuperScript III Обратная транскриптазаThermo Scientific, Шверте, Германия18080044
Oligo d(T) PrimerIntegrated DNA Technologies, Лёвен, БельгияPrepare 100 µ M складские растворы в DEPC-H2O и хранить при -20 °°; C
dNTP MixTakara Bio Europe/Clonetech, Сен-Жермен-ан-Ле, Франция4030Магазинные аликвоты 25 & микро; l при -20°С; C
CFX96 Сенсорная система обнаружения ПЦР в реальном времениBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Германия1855195
iQ SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Германия170-8882
ПЦР-планшеты с жесткой оболочкой 96-луночные, тонкостенныеBio-Rad Laboratories GmbH, Mü Нхен, ГерманияHSP9601
Microseal 'B' FilmBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, ГерманияMSB1001
rp49 Forward primerIntegrated DNA Technologies, Лёвен, Бельгия5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Обратный праймерIntegrated DNA Technologies, Лёвен, Бельгия5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Forward primerIntegrated DNA Technologies, Левен, Бельгия5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Обратный праймерIntegrated DNA Technologies, Левен, Бельгия5' ACG TCT TGC CGT TCT AGG TGA 3'
109634

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
  2. Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
  3. Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
  4. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  6. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  7. Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
  8. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  9. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  10. Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
  11. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
  12. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
  13. Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).
  14. Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
  15. Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
  16. Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
  17. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  18. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
  19. Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
  20. Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
  21. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  22. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  23. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
  24. Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
  25. Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
  26. Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063(2012).
  27. Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  28. Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
  29. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  30. Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
  31. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
  32. Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
  33. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
  34. Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
  35. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  36. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  37. Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
  38. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
  41. Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
  42. Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).
  43. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  44. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Drosophila Imaginal DiscGenetic MosaicsMARCM TechniqueFluorescent MicroscopyConfocal ImagingRNA IsolationTumor InvasivenessJNK SignalingHemocyte InfiltrationMMP1 Expression

Похожие статьи