Методическая статья

Применение pHluorin для количественного, Kinetic и высокой пропускной способностью анализа эндоцитоза у почкующихся дрожжей

DOI:

10.3791/54587

⸱

23 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точная количественная оценка событий везикулярного транспорта часто дает ключевое представление о роли конкретных белков и эффектах мутаций. В данной работе представлены методы использования сверхклиптического pHluorin, pH-чувствительного варианта GFP, в качестве инструмента количественной оценки эндоцитарных событий в живых клетках с помощью количественной флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его варианты широко используются инструменты для изучения локализации белка и динамики событий, таких как цитоскелета ремоделирования и везикулярного торговли в живых клетках. Количественные методики с использованием химерных GFP слитых были разработаны для многих приложений; однако, GFP несколько устойчив к протеолизу, таким образом, его флуоресценция сохраняется в лизосом / вакуоли, которые могут препятствовать квантификацию торговли грузов в эндоцитотического пути. Альтернативный метод количественной оценки событий торговли людьми эндоцитоза и пост-эндоцитических использует superecliptic pHluorin, рН-чувствительный вариант GFP, который гасится в кислой среде. Химерический слияние pHluorin к цитоплазматическим хвостом трансмембранный грузовых белков приводит в демпфирование флуоресценции при включении груза в мультивезикулярных тел (MVBs) и доставки в лизосомы / вакуоли просвет. Таким образом, тушение флуоресценции вакуолярной облегчает quantifiкатион эндоцитоза и ранних событий в эндоцитотического пути. В данной статье описаны методы, использующие pHluorin-маркированные грузы для количественной оценки эндоцитоза с помощью флуоресцентной микроскопии, а также анализы населения на основе с использованием проточной цитометрии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Везикулярный торговля играет важную роль в поддержании идентичности органелл и функцию в эукариотических клетках, и является ключевым механизмом для регулирования белков и мембран состава отдельных клеточных отсеков. На плазматической мембране, слияние exocytic везикул содержит новые белки и мембраны на поверхности клетки, в то время как пузырьки, генерируемые посредством эндоцитоза удалить мембрану и белки с поверхности для последующей переработки или нацеливание в лизосомы. Таким образом, эндоцитоз имеет важное значение для поглощения питательных веществ и для ответов на внеклеточную среду. Экзоцитоз и эндоцитоз сбалансированы регулировать площадь поверхности плазматической мембраны, и обеспечить оборот поврежденных белков.

Исследования, проведенные в дрожжах и клетках млекопитающих выявили большое количество белков, участвующих в эндоцитоза, а также несколько эндоцитических путей, которые способствуют интернализации конкретных грузов или этот акт в ответ на различные анжающей среды условия. Наиболее изученный путь является клатрин-опосредованный эндоцитоз (CME), в котором клатрина и цитозольная вспомогательные белки собираются в структуру покрытия, чтобы стабилизировать зарождающееся эндоцитических пузырек. Эксперименты в почкующихся дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE дали глубокие знания о динамике и порядок набора для многих белков эндоцитических 1-3. Следует отметить, что техника СМЕ высоко консервативен в ходе эволюции таким образом, что большинство СМЕ-родственных белков в дрожжах имеют человеческие ортологи; Таким образом, почкующихся дрожжей стала важным инструментом для понимания механизмов эндоцитоза, которые являются консервативными в высших эукариот. Например, исследования с использованием многообещающий дрожжей определяют, что формирование и созревание CME структур (называемых корковых пластырей актина у дрожжей) включает в себя последовательный набор многих белков, начиная с клатрина и грузовыми-связывающим адаптерных белков, а затем набор дополнительного эндоцитотического принадлежности белки,активация Arp2 / 3-опосредованной полимеризации актина, и набор белков , участвующих в пузырек 1,2 разрыва. Набор машинных белков CME кортикальных актиновых заплатки является весьма упорядоченные и стереотипное процесс, и точный порядок набора для многих белков было установлено по отношению к другим компонентам оборудования CME. Важно отметить, что недавние исследования подтвердили , аналогичный порядок набора для CME белков на клатриновых ямах в клетках млекопитающих 4.

В дополнение к КВМ, многие типы клеток , обладающие одной или несколькими клатриновых-независимый эндоцитотический (CIE) пути , которые полагаются на альтернативные механизмы для содействия формированию везикул и интернализации из плазматической мембраны 5-7. У дрожжей, недавно мы определили CIE путь , который использует небольшой GTPase Rho1 и его активации гуанин фактор нуклеотид обмена (ГЭФ), Rom1 8,9. Rho1 активирует Formin Bni1 для содействия актина полимеризации 10,11, который необходим для этой формы клатрин-независимого эндоцитоза у дрожжей 12. Кроме того, α-arrestin семейство белков Набирать убиквитинлигаза Rsp5 для содействия убиквитинирование грузов и последующей интернализации через НМО 13-17, а также содействовать интернализации грузов через МКО пути, возможно , за счет прямого взаимодействия с белками , участвующими в CIE 18. Разнообразие путей CIE существуют также в клетках млекопитающих, в том числе клатриновых независимый и фагоцитирующих путей , которые полагаются на ортолога Rho1, RhoA 9,19. Роль RhoA в CIE млекопитающих изучена слабо; Таким образом, исследования в почкующихся дрожжей может обеспечить дополнительные механистические идеи, которые применимы к CIE млекопитающих.

Точная количественная оценка эндоцитических событий может предоставить важную информацию о роли специфических белков в регуляции эндоцитоза, и может выявить влияние мутаций на грузовом интернализации или Progressioп через эндоцитотического пути. Для этой цели, биохимические методы могут быть использованы для мониторинга поглощения лиганда или для измерения скорости деградации эндоцитических грузовых белков. В живых клетках, слияние зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его вариантов для грузов, представляющих интерес позволяет осуществлять прямую визуализацию грузового транспорта. Тем не менее, GFP-меченый грузов, имеют ограниченное применение для количественной оценки эндоцитоза, так как GFP, устойчив к деградации в лизосомах (или вакуоли в дрожжах). Кроме того, GFP флуоресценции только частично чувствительна к изменению рН, и остается обнаружить в течение вакуоли люмена 20,21. Следовательно, флуоресценция GFP тега сохраняется в вакуоль долго после того, как остальная часть груза деградирует, и вся клетка на основе количественной оценки интенсивности груза может быть неточным из-за долговременной GFP флуоресценции в вакуоль.

Для того, чтобы преодолеть недостатки вакуолярная флуоресценции GFP, ранее мы использовали superecliptic рНluorin, рН-чувствительный вариант GFP , который флуоресцирует ярко при нейтральном значении рН, но теряет флуоресценцию в кислой среде , такой как просвет вакуоли / лизосомы 20,22,23. Размещение тега pHluorin на цитоплазматической хвост эндоцитических грузов позволяет визуализировать грузов на плазматической мембране и на ранних эндосом, где метка pHluorin остается открытой в цитоплазму (рис 1А). В ранние эндосомы созревают, эндосомный сортировочный комплекс необходим для транспорта (ESCRT) машины пакеты поверхностно-локализованные грузов в пузырьки , которые BUD в просвет эндосом, генерируя мультивезикулярные тел (MVBs) 24. Для грузов, которые были включены во внутренние MVB везикул, тег pHluorin обращен к везикулы просвет. Внутренние MVB везикулы подкисляют; Таким образом, pHluorin-меченый грузов теряют флуоресценцию на ранних эндосом , поскольку они созревают в MVBs 20. Последующее слияние MVB с вакуоли обеспечивает содержание MVB просветадеградации и pHluorin метки остаются гас в кислой среде вакуоли просвет.

В настоящем документе приводится подробное описание количественных анализов с использованием эндоцитических с цитоплазматическими грузов pHluorin тегов в дрожжах. Штаммы, экспрессирующие pHluorin-маркированные грузы могут быть использованы в кинетических и / или конечных точек анализов, в зависимости от свойств и торговли поведения конкретного груза. Кроме того, некоторые pHluorin-меченый грузов поддаются методам анализа с высокой пропускной способностью, в том числе проточной цитометрии. Важно отметить, что тег pHluorin является универсальным инструментом для изучения эндоцитических событий в живых клетках, что позволяет количественно оценить эндоцитоза и сравнения функции эндоцитотического в дикого типа и мутантных штаммов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Решения и средства массовой информации

  1. Подготовьте следующие запасы, медиа и планшеты:
    1. Для приготовления 10x YNB, растворите 67 г азотистого основания дрожжей не хватает аминокислот в 1 л воды. Стерилизуют путем фильтрации через 0,22 мкм нитроцеллюлозный фильтр.
    2. Подготовка среды YNB с использованием 1x YNB (с 10-кратным акций) с 2% раствором декстрозы (из стерильного 50% вес / объем запаса) и смеси 1x аминокислота / питательных веществ (от 100х запаса см шаг 1.1.4). Для отбора плазмиды, опустить отдельные аминокислоты или питательные вещества, по мере необходимости. Для индукции экспрессии Mup1, дополнительно опустить метионин из аминокислоты / питательной смеси.
    3. Подготовка YNB пластины, используя 1x YNB (с 10-кратным наличии), 2% раствор декстрозы (из стерильного 50% вес / объем запаса), 0,7 г / л аминокислоты / питательной смеси (этап 1.1.5) и 2,5% агара. Подготовьте пластины среду автоклавированием 25 г агара и 0,7 г аминокислот / питательной смеси на 860 мл воды. Дайте смеси остыть до 55 ° С, затем добавляют 100 мл 10х YNB и 40 мл OF 50% глюкозы. Налейте пластин (приблизительно 30 мл среды на 10 см чашку), позволяют среда затвердевать при комнатной температуре, и хранить пластины при температуре 4 ° С.
    4. Готовят 100x аминокислоты / питательное вещество маточного раствора (для жидкой среды) путем растворения следующих в 100 мл деионизированной воды: 0,1 г L-метионин, 0,3 г каждого из L-лейцина и L-лизин, и 0,2 г каждого из L-гистидина , L-триптофана, аденина и урацила (другие аминокислоты и питательные вещества, могут быть включены по мере необходимости для конкретных штаммов). Используйте мягкое тепло, если это необходимо для растворения, и стерилизуют через 0,45 мкм нитроцеллюлозный фильтр. Хранить при комнатной температуре с защитой от света. Для отбора плазмиды, готовят растворы специфические компоненты, лишенные по мере необходимости.
    5. Готовят аминокислоты / смесь питательных веществ (для пластин) путем объединения следующих: 0,5 г аденина, 4 г L-лейцина и 2 г каждого из L-гистидин, L-лизин, L-метионин, L-триптофан, L- тирозин и урацил. Измельчите с помощью ступки и пестика, и магазин с проСРЕДЫ от света. Для отбора плазмиды, готовят смеси компонентов, в которых отсутствует специальное по мере необходимости, и используют 0,7 г смеси аминокислот на литр пластинчатой ​​среды (этап 1.1.3).
  2. Подготовка 8-луночных слайды камера для микроскопии путем нанесения на поверхность предметного стекла с конканавалина А (ConA). В каждую лунку камеры горкой, добавить 25 мкл 2 мг / мл ConA, растворенную в воде. С помощью пипетки, распространять ConA всей нижней поверхности скважины, а затем позволить слайд высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение по крайней мере 4-8 часов. В идеале, использование камеры слайды в течение 24 ч с ConA покрытия.
  3. Сформировать штаммов дрожжей с в рамке слитых GFP или pHluorin к эндоцитотического груза интереса с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) метод интегрирования основанное описано в Longtine и др. Гольдштейн и Маккаскер 25,26.
    Примечание: Плазмиды , содержащие pHluorin мечения кассеты с генами устойчивости к канамицину (KANMX6) и nourseothricin ( NATMX4) были описаны ранее 20.
    1. Amplify GFP или pHluorin кассеты , содержащие селективные маркеры , с использованием праймеров , содержащих дополнительные последовательности , специфичные для сайта геномной интеграции 20,25.
    2. Преобразование полученного продукта ПЦР в желаемый штамм дрожжей с помощью метода 27 ацетата лития.
    3. Выберите для интеграции кассеты путем выращивания клеток на пластинах, содержащих YPD соответствующий препарат. Для приготовления пластины, автоклав 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 0,1 г триптофана и 25 г агара в 960 мл воды. Перед заливкой плиты, дайте смеси остыть до 55 ° С, затем добавляют 40 мл 50% глюкозы и либо G418 , до конечной концентрации 200 мкг / мл для отбора KANMX6 или nourseothricin до конечной концентрации 100 мкг / мл для выбор NATMX4.
    4. Подтвердить интеграцию GFP или pHluorin тега в отдельных колоний с помощью ПЦР и / или Вестерн-блоттинга с использованием анти-GFP антител,а также путем обнаружения меченого белка с помощью флуоресцентной микроскопии 20.
      Примечание: Конкретные дрожжевые штаммы и плазмиды , используемые в этом исследовании, приведены в таблицах 1 и 2, соответственно.

2. Анализ конечных точек для установившегося состояния флуоресценцию конститутивно Интернализованная эндоцитических Cargo

  1. Привить клетки (~ 3 небольших колоний) в 5 мл YNB среду, лишенную аминокислоты или питательные вещества, как это требуется для поддержания плазмиды (если применимо). Рост клеток в течение 16-24 ч, в орбитальное инкубаторе при температуре 30 ° C, при 250 оборотов в минуту встряхивая. В качестве альтернативы, полоса а ~ 1-2 мм колонии клеток на пластину YNB хватает аминокислот или питательных веществ для отбора плазмиды и клетки растут в течение ночи при 30 ° С.
  2. Измерения плотности (OD 600) для каждой ночной культуры с использованием спектрофотометра. Подготовьте 5 мл раствор при 0.35-0.4 OD 600 / мл в YNB среду , лишенную аминокислоты или питательные вещества для PLAсодержание Шмид, и расти в течение приблизительно 3 ч при 30 ° C при встряхивании. Если используются клетки штрихом на тарелку, пропустите этот шаг и перейдите к шагу 2.4 (смотри ниже).
  3. Измерьте плотность (OD 600) клеток, которые в настоящее время должен находиться в пределах 0,6-1,0 OD 600 / мл. Передача 1,5 мл культуры в микроцентрифуге трубки и гранул клеток при 8000 оборотов в минуту (6,800 XG) в течение 2 мин. Удалить 1475 мкл супернатанта.
  4. Доведите клетки к флуоресцентным микроскопом. Перед тем, визуализации каждого образца, подготовить слайд путем ресуспендирования клеток в оставшейся среде, и смонтировать 3 мкл клеточной суспензии под покровным стеклом. В качестве альтернативы, подготовить 8-луночных слайды в камере, как это описано ниже, в протоколе 3, используя YNB среду по мере необходимости для отбора плазмиды. В идеале, изображения клетки с 100х, 1.4 или выше числовой апертуры (NA) иммерсионным объективом, 12- или 16-разрядной камерой, а также фильтров возбуждения / эмиссии оптимизированы для GFP флуоресценции.
    Примечание: При использовании клетки, выращенные штриховой разводкой Oна пластину, подготовить слайд путем размещения 3 мкл свежей среды YNB на покровным. С помощью кончика пипетки, собрать небольшую колонию клеток от пластины, разгонять клетки в среду YNB, и смонтировать полученную суспензию на предметном стекле непосредственно перед изображениями.
  5. Изображение 4-6 случайных полей ячеек для каждого условия, используя те же параметры сбора данных (то есть, наборы фильтров и времени экспозиции) для всех изображений в рамках эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собирая или DIC светлого изображения для каждого поля может быть полезно для клеток, где сигнал pHluorin гасится в MVB и вакуолярных отсеков.
  6. Количественно интенсивность флуоресценции по меньшей мере 30-50 клеток для каждого условия (см протокол 5).

3. Кинетическая Анализ для количественного определения эндоцитоза, которые претерпевают Грузы эндоцитоза Регулируемый

  1. Инокулируйте 2-3 колоний клеток дрожжей (около 2 мм в диаметре на колонии) в 5 мл YNB среде, не содержащей метионин и добавитьitional аминокислоты или питательные вещества для поддержания выбора плазмиды. Grow культур в течение 16-24 ч при 30 ° C при встряхивании.
    Примечание: В данной работе протоколы для изучения регулируемых эндоцитических грузовых белков будет использовать метионин пермеазы, Mup1. Другие грузы, которые претерпевают регулируемую эндоцитоз также пригодны для мечения с pHluorin (например, урацил пермеазы Fur4, которая накапливается в плазматической мембране в отсутствие урацила, и усваивает в ответ на прилагаемое извне урацил); для этих грузов, условия СМИ должны быть изменены, чтобы отразить конкретное выражение, индукция и интернализации условий для этого груза.
  2. Измерения плотности (OD 600) для каждой ночной культуры приблизительно 3 ч до того визуализации. Приготовьте 5 мл раствор при 0.35-0.4 OD 600 / мл в среде , не содержащей YNB метионин и дополнительные аминокислоты или питательные вещества для поддержания плазмид, и расти при температуре 30 ° C при встряхивании.
  3. Предварительно уравновешивания микролимитахКоуп климатическую камеру или подогретой стадию (если таковая имеется) до 30 ° С в течение 3 ч инкубации стадии 3.2.
  4. Передача 1 мл клеточной культуры в микроцентрифуге трубки и гранул клеток при 8000 оборотах в минуту (6,800 XG) в течение 2 мин. Удалить 975 мкл супернатанта.
  5. Приготовьте КонА обработанную, 8-хорошо со стеклянным дном камеры слайд для работы с изображениями (протокол 1.2).
  6. Добавить 200 мкл YNB среду, лишенную метионин и дополнительные аминокислоты или питательные вещества для селекции плазмиды в каждую лунку. Ресуспендируют осадок клеток, полученной на стадии 3.4, в оставшейся надосадочной жидкости, и падение 2,5 мкл клеточной суспензии в центр каждой лунки. Дисперсные клетки по всей поверхности лунки с помощью пипетки вверх и вниз, и позволяют клеткам урегулировать в течение 5-10 мин.
  7. Поместите камеру слайд на перевернутой флуоресцентного микроскопа, уравновешенной до 30 ° C (см шаг 3.3). Найдите поле ячеек с помощью светлого освещения.
  8. Добавляют 50 мкл YNB среды, содержащей 100 мкг / мл метионина(Предварительно нагретый до 30 ° С) до 200 мкл среды в скважине для получения конечной концентрации метионина 20 мкг / мл. Во избежание разрушения среды в скважине, чтобы предотвратить клетки от плавающей снизу.
  9. Дайте клеткам уравновешиваться в течение 2 мин до начала обработки изображений. Непосредственно перед съемкой первого изображения, настроить микроскоп к нужному фокальной плоскости (как правило, экваториальный фокальной плоскости лучше всего работает).
  10. Получение изображений GFP и (или светлого DIC) 5-минутными интервалами в течение 45-60 мин, при использовании одинаковых параметров приобретения для всех изображений в пределах временного ряда (например, 100X 1.4 NA цели масло погружения и 500 мс времени обнаружения с использованием фильтра GFP, 100 мс время обнаружения с использованием DIC фильтра).
    Примечание: Если этап микроскопа и программное обеспечение визуализации не позволяют автоматической коррекции дрейфа фокальной плоскости, это может быть необходимо, чтобы вручную настроить фокус перед каждым времени изображений точки. Кроме того, приобретение будет разварьируются от микроскопов из-за различий в освещении и фильтров, а также оптимальные условия должны быть определены вручную до начала эксперимента. Если эндоцитотический груз кроме Mup1 используется, может возникнуть необходимость изменить время сбора и обработки изображений интервалов, а также продолжительность эксперимента, чтобы отразить кинетики интернализации этого груза.
  11. Количественно интенсивность флуоресценции отдельных клеток в каждой временной точке (см протокол 5), и выражают значения в процентах от начальной интенсивности первого изображения.

4. Анализ конечных точек для Количественное эндоцитических, претерпевающих Грузы Регулируемый эндоцитоза

  1. Подготовка клеток для визуализации, как описано в протоколе 3 (шаги 3.1 через 3.6).
  2. Изображение 4-5 случайных полей ячеек для каждого состояния непосредственно перед добавлением метионин, используя Светлое и GFP наборы фильтров.
  3. Добавляют 50 мкл YNB среды, содержащей 100 мкг / мл метионина (довоеннаяMed до 30 ° С) до 200 мкл среды в скважине для получения конечной концентрации метионина 20 мкг / мл. Во избежание разрушения среды в скважине, чтобы предотвратить клетки от плавающей снизу.
  4. Изображение 4-5 случайных полей клеток через 30 мин после добавления метионина, используя те же параметры, что и для приобретения в момент времени 0 мин (шаг 4.2).
  5. Количественно величина интенсивности флуоресценции по крайней мере, 30-50 клеток для каждой временной точки (см протокол 5). Экспресс значения как процент от Mup1-pHluorin интернализированной через 30 мин с использованием формулы: [Средняя интенсивность при 0 мин - средняя интенсивность на 30 мин] / [средняя интенсивность при 0 мин] х 100%.
    Примечание:. Можно одновременно выполнять до восьми конечных точек анализов ошеломляющим времени начала каждого теста В таблице 3 приведен пример рабочего процесса для восьми одновременных анализов.

5. после приобретения Анализ

  1. Экспорт изображений из программного обеспечения сбора в качестве 16-битный формат файла меченых изображения (.tif или .tiff формат).
    Примечание: Другие форматы файлов могут также быть пригодны, и в идеале должны использовать алгоритмы сжатия без потерь. 8-битные изображения, как правило, не пригодны для целей количественного определения.
  2. Открытие файлов с помощью программного обеспечения ImageJ (в свободном доступе в опции "Открыть" в меню "Файл". С помощью флуоресцентного изображения для количественной оценки, а светлое / DIC изображения в качестве эталона для определения местоположения клеток и исключить мертвые клетки (если они присутствуют ), которые выглядят более темными, чем живых клеток при просмотре DIC и autofluorescent при просмотре с помощью фильтров GFP возбуждения / излучения.
  3. Выполните вычитание фона на флуоресцентного изображения. Для получения изображений с нечетным фонового сигнала, используйте '' вычитание фона алгоритм, найденный в меню 'Process'. Используйте настройки по умолчанию (радиус качения шарика 50 пикселей), который, как правило, достаточно для целей количественной оценки.
    Примечание: альтернативный backgroунд метод вычитания для изображений с однородным фоном описан на этапе 5.3.1.-5.3.2; Тем не менее, описанный выше способ также работает для равномерного фона.
    1. Для получения изображений с равномерным фоном (т.е. интенсивность фона примерно постоянна на всех кромках и в центре изображения), вручную выполнить вычитание фона. Нажмите на кнопку "Freehand опциям пункта, найденного в главном окне ImageJ и выберите 3-5 случайных областей внутри изображения, которые не содержат клеток.
    2. Откройте функцию "Set измерений", расположенную в меню "Анализировать", выберите параметр 'Mean Gray Value', и измерения значений интенсивности с помощью функции "Измерение" (также находится в меню "Анализировать"). Вычислить среднее значение из измеренных 3-5 регионов, и вычесть из всех последующих измерений в этом изображении.
  4. Для количественного определения кинетических анализов (протокол 3), генерируют одну, многоярусные изображение для тимE-серии. Откройте флуоресцентные изображения от каждой точки времени в хронологическом порядке, а также генерировать стек с помощью "изображений в стек 'функцию (находится в меню" Изображение ", в соответствии с подменю Стеки).
  5. Наметит ячейку с помощью инструмента выделения областей произвольной формы, убедившись в том, чтобы включить всю клетку, но как мало площади вне клетки, как это возможно.
  6. Измерьте следующие параметры: 'Area, интегральная плотность "и" Среднее значение серого ". Выбор параметров с помощью функции "Set измерений", расположенный в меню "Analyze".
    Примечание: интегральная плотность соответствует сумме всех интенсивностей пикселей в выбранной области, а среднее значение серого соответствует [интегральной плотности / Area], которая корректирует значения интенсивности для размера ячейки.
  7. Откройте "ROI Менеджер", расположенный в меню "Анализ", в соответствии с подменю "Инструменты". В окне ROI Manager, нажмите кнопку "Добавить", чтобы ввести выделенную Regioп как новую область интереса (ROI).
  8. Повторите шаги 5.4 через 5.6 для остальных ячеек в изображении. Исключить любые мертвые клетки , как оцениваемые светлопольному / DIC и флуоресценции (мертвые клетки кажутся более темными в DIC изображений, и имеют autofluorescent цитоплазматический сигнал при наблюдении с GFP возбуждения / излучения, см рис 2F), а также любые клетки , которые касаются края изображения. Сохранение выбранных трансформирования в виде файла .zip, нажав на кнопку "More" в окне "ROI Менеджер", а также экспортировать все измерения в электронную таблицу или программного обеспечения статистического анализа.
  9. Для количественного определения кинетических анализов (протокол 3), обрисовать и измерить ячейку из начального момента времени, как описано в пунктах 5.4 и 5.5. Используйте один и тот же ROI для измерения всех последующих моментов времени в эксперименте.
  10. Для конечных точек анализа (протоколы 2 и 4), измеряют как минимум 30-50 клеток для каждого условия. Выполнение количественной оценки в течение по крайней мере 2-3 изображений, и включают в себя все клетки в каждойизображения, которые отвечают критериям, изложенным в пункте 5.8 в анализе.
  11. Оценка статистической значимости между образцами с использованием односторонней ANOVA с последующим тестом множественного сравнения Тьюки для постфактум анализа.

6. Анализ Население Mup1-pHluorin эндоцитоза с помощью проточной цитометрии

  1. Инокулируйте 2-3 колоний клеток дрожжей (около 2 мм в диаметре на колонии) в 0,5 мл YNB среду, лишенную метионин и дополнительные аминокислоты или питательные вещества для поддержания выбора плазмиды. Рост клеток в 5 мл круглодонную пробирки в течение 16-24 ч при 30 ° С на роликовом барабане.
  2. Добавить 1,5 мл YNB среду, лишенную метионин и дополнительные аминокислоты или питательные вещества для поддержания плазмид, и расти при температуре 30 ° С в течение еще 3 ч на роликовом барабане.
  3. Передача 1 мл клеток, в каждую из двух 5 мл с круглым дном пробирки. Добавить 0,25 мл YNB -Met среды к первой трубе (-Met состояние), и 0,25 мл YNB среды, содержащей 100 мкг/ Мл метионин ко второй трубе, чтобы получить конечную концентрацию метионин 20 мкг / мл (+ Met состояние). Инкубируйте клетки при 30 ° С в течение 45 мин на роликовом барабане.
  4. Анализ клеток с помощью проточной цитометрии, выбирая рассеяния вперед (FS) в качестве меры размера ячейки и интенсивности флуоресценции Mup1-pHluorin из фильтра флуоресцеинизотиоцианата (FITC) в качестве меры груза интернализации.
  5. С помощью кнопок ползунок для регулировки напряжения ФС и каналов FITC для оптимизации обнаружения для диапазона размеров и интенсивности флуоресценции дрожжевых клеток используется (для этих экспериментов, настройки были использованы 50 V для FS и 400 V для FITC).
    Примечание: Напряжение для обоих каналов будет изменяться в зависимости от потока цитометрии используется. Этот шаг должен быть сделан до или в течение 45 мин обработки с метионином (шаг 6.3).
  6. Мера FS и интенсивность флуоресценции для 10000 клеток из каждого состояния, используя параметр высокой скоростью потока. Сформировать график рассеяния ФС против флуоценция интенсивности: нажмите на ссылку "добавить график ', выберите FITC (ось х) и FS (ось у), и график 1000 пунктов (программное обеспечение будет отображать значения на 1000 ячеек, хотя 10000 клеток были измерены).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения максимальной согласованности, анализа ячеек 45-50 мин после добавления метионина; для экспериментов с участием большого количества проб, шатаются добавление метионин, чтобы приспособить время, необходимое для анализа потока цитометрии.
  7. Включить -Met и + Met условия для дикого типа (WT) клеток в качестве контроля. С помощью функции затвора, назначить вертикальную ворота, используя условие WT + Met, таким образом, что примерно 5% из самых ярких клеток попадают справа от ворот. Используйте эту селекцию для всех других условий эксперимента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стационарное локализация и количественное конститутивно интернализованной эндоцитотического груза белка STE3

Для того, чтобы продемонстрировать, что pHluorin-меченый грузы могут быть использованы для количественного определения эндоцитоза в живых клетках, локализации химерного GFP и pHluorin слитых с цитоплазматическим С-концевого хвоста STE3, А-фактора феромонов рецептора у дрожжей, сравнивались. STE3 являетс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Применение pHluorin количественно оценить эндоцитических событий в клетках дрожжей использует трансмембранных грузов , в котором флуоресцентная метка слита с цитоплазматическим хвостом белка (Рис . 1А) Для анализов, описанных здесь, ярко грузы флуоресцентные, когда тег pHluorin подвергается нейтральной среде, но становятся гас, когда тег pHluorin встречает кислотные условия. Таким образом, pHluorin-меченый эндоцитотический груз легко обнаруживается на цитоплазматической стороне мембраны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Геро Мизенбёка и Тима Райана за то, что они поделились кДНК pHluorin, используемой для создания реагентов в этом исследовании, Натана Райта, Джоанну Поправски и Лидию Ньясае за отличную техническую помощь, членов лаборатории Вендланда за полезные обсуждения, а также Майкла МакКаффри и Эрин Прайс из Интегрированного центра визуализации (Джонс Хопкинс) за советы и помощь в микроскопии и проточной цитометрии. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (B.W., GM60979) и Национального научного фонда (B.W., MCB 1024818). К.В. была частично поддержана грантом на обучение от Национальных институтов здравоохранения (T32-GM007231). A.F.O. была поддержана фондами развития от факультета биологических наук Университета Дюкейна и гранта Национального научного фонда CAREER 553143.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АденинSigmaA8626-25GПрименение для приготовления смеси аминокислот и исходного раствора
Бакто-агарFisherBP1423-2Применение для приготовления пластинчатых сред
BD Difco Дрожжевое азотное основание (без аминокислот)BD291920Применение для приготовления жидких и пластинчатых сред
Concanavalin ASigmaC5275-5MGПрименение для покрытия камер слайды
DextroseFisherBP350-1Использование для приготовления жидких и пластинчатых сред
L-гистидинFisherBP382-100Использование для приготовления аминокислотной смеси и исходного раствора
L-лейцинаAcros125121000Использование для приготовления аминокислотной смеси и исходного раствора
L-лизинFisherBP386-100Использование для приготовления аминокислотной смеси и исходного раствора
L-метионинаFisherBP388-100Использование для приготовления аминокислотной смеси и стокового раствора
L-триптофанаFisherBP395-100Использование для приготовления аминокислотной смеси и исходного раствора
L-тирозинаAcros140641000Использование для приготовления аминокислотной смеси
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8-скважина)Thermo Scientific155411Использование для кинетических и конечных анализов интернализации Mup1-pHluorin
UracilSigmaU0750-100GИспользование для приготовления аминокислотной смеси и стокового раствора
Axiovert 200 инвертированный микроскопCarl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat масляный иммерсионный объектив ОбъективCarl Zeissдолжен быть 100X, 1.4NA или выше
SensicamCooke CorporationКамера должна иметь динамический диапазон 12 бит или выше
X-Cite 120PC Q Источник освещенияExcelitas Technologies
Slidebook 5 программное обеспечениеIntelligent Imaging Innovations
Программное обеспечение ImageJНациональные институты здравоохраненияhttp://imagej.nih.gov/ij/

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
  3. Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
  4. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).
  5. Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
  6. Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
  7. Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
  8. Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
  9. Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
  10. Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
  11. Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
  12. Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
  13. Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
  14. Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
  15. Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
  16. O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
  17. O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
  18. Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
  19. Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
  20. Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
  21. Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  24. Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
  25. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  26. Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
  27. Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
  28. Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
  29. Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
  30. Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
  31. Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
  32. Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
  33. Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
  34. Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
  35. Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
  36. Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
  37. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
  38. Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
  39. Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
  40. Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
  41. Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
  42. Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
  43. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
  44. Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Fluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

Похожие статьи