Методическая статья

Полианилиновой на основе датчика нуклеиновых кислот

DOI:

10.3791/54590

⸱

1 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нуклеиновые кислоты являются распространенными аналитами для оценки биологических систем; однако смещение от ферментативных манипуляций может вызвать беспокойство. Здесь описан метод безмаркерного детектирования нуклеиновых кислот с использованием полианилина. Эта чувствительная и экономичная сенсорная технология позволяет различать однонуклеотидные различия между молекулами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обнаружение нуклеиновых кислот находится в центре диагностических технологий, используемых в исследованиях и клинике. Стандартные подходы, используемые в этих технологиях, основаны на ферментативной модификации, которая может привести к систематической ошибке и артефактам. Критически важным элементом платформ обнаружения следующего поколения будет прямое молекулярное зондирование, что позволит избежать необходимости в амплификации или метках. Усовершенствованные наноматериалы могут обеспечить подходящие химические модальности для реализации безметочных сенсоров. Сопряженные полимеры идеально подходят для биологического зондирования, обладают свойствами, совместимыми с биомолекулами, и проявляют высокую чувствительность к локальным изменениям окружающей среды. В данной статье представлен метод детектирования нуклеиновых кислот с помощью электропроводящего полимера полианилина. Олигонуклеотиды простого «зонда» ДНК, комплементарные нуклеиновым кислотам-мишеням, электростатически прикрепляются к полимеру, создавая сенсорную систему, которая может дифференцировать одиночные нуклеотидные различия в молекулах-мишенях. Помимо специфики и непредвзятости этой технологии, она очень экономична.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сопряженные полимеры предоставляют множество вариантов молекулярных сенсоров. Это включает флуоресцентные, электронные и колориметрические реакции1. Было предпринято много попыток включить конъюгированные полимеры в сенсоры нуклеиновых кислот. Тем не менее, большинство систем требуют вторичного обнаружения, что ограничивает возможности обнаружения2. Недавно мы сообщали о сопряженной сенсорной платформе на основе полимера, построенной на полианилине (PANI), которая использует свойства этого полимера, создавая систему без меток3. PANI представляет собой широко сопряженный электроактивный полимер со свойствами, такими как флуоресценция и сопротивление, которые подходят для измерения биологических систем4. Экситоны внутри структуры не локализованы, что приводит к подвижности положительного заряда между мономерными субъединицами. Это обеспечивает гибкий каркас положительных зарядов, который может взаимодействовать с отрицательно заряженным остовом ДНК5,6. Важно отметить, что электростатически присоединенная ДНК ориентирована таким образом, что азотистые основания могут участвовать в спаривании оснований. Связь с ДНК изменяет электронные свойства PANI, эффект, который может быть усилен ультрафиолетовым излучением (Рисунок 1). Используя эту систему, олигонуклеотиды, комплементарные нуклеиновым кислотам-мишеням, могут быть иммобилизованы на PANI. Многочисленные исследования показали, что при гибридизации электростатически адсорбированные олигонуклеотиды диссоциируют от PANI или других катионных матриц из-за конформационных изменений, вызванных переходом на двухцепочечную структуру ДНК3,5,7.

В сенсорной системе, где присоединение зонда модулирует свойства сопряженного полимера, события гибридизации могут передаваться без меток или ферментативной модификации зондов или целевых нуклеиновых кислот. Сопряженные полимеры обеспечивают большую гибкость в методах обнаружения, одним из которых является флуоресценция. С помощью мониторинга флуоресценции PANI можно обнаружить концентрации целевых нуклеиновых кислот на уровне 10-11 М (10 пМ)3. Обнаружение происходит быстро, в течение 15 минут после гибридизации, и специфично, когда можно дифференцироватьодно несоответствие в молекуле-мишени.

Изготовление PANI-датчиков не вызывает затруднений. Высокомолекулярный PANI может быть получен хорошо диспергированный в воде с использованием стандартных процедур синтеза с использованием анилинового мономера, поверхностно-активного вещества и контролируемого добавления окислителя. Выход может быть очень высоким, а непрореагировавший окислитель удаляется путем промывки водой, что исключает дальнейший рост PANI. Ассоциация PANI-зонда происходит спонтанно при смешивании, а образование комплекса усиливается при слабом воздействии ультрафиолета. Гибридизация может быть проведена немедленно, а изменения флуоресценции PANI могут быть проанализированы после короткой инкубации. Простота этой технологии делает ее очень доступной для многих лабораторий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обрабатываемая ПАНИ Синтез

  1. Растворите анилин (1 мл, 11 ммоль), полностью в 60 мл хлороформа в 250 мл круглодонную колбу,. Смесь перемешивают при 600 оборотах в минуту в течение 5 мин и охлаждают до температуры 0-5 ° С со льдом. Это обычно занимает 15-20 мин (рис 2A).
  2. Добавить додецил бензолсульфонат натрия (NaDBS) (7,44 г, 21 ммоль) к раствору анилина в круглодонную колбу при перемешивании при 600 оборотах в минуту.
  3. Растворите персульфата аммония (APS) (3,072 г, 13,5 ммоль) в 20 мл воды и добавить все это по каплям в течение 30 минут, чтобы избежать перегрева реакции.
  4. Проводят реакцию при температуре 0-5 ° С в течение 24 ч, и позволяют ему достичь комнатной температуры в течение еще 24 ч.
  5. Отметим , реакционную смесь сначала повернуть молокообразного через 15 мин, а затем темно - коричневого цвета после 2 часов, и , наконец , до темно - зеленого через 24 часа (рис 2B-F).
  6. Фильтр решение ПАНИ-NaDBS с воронке Бюхнера. Смешайте 80 мл хлороформа и 120 мл воды в качествеeparation воронка (рис 2G).
  7. Выдержите раствор в течение 24 ч при комнатной температуре и собирают темно-зеленую полианилина делительной воронке, в результате чего не вступившие в реакцию NaDBS и APS в водной супернатанта.

2. ПАНИ-зонд Смешение и УФ-облучения

  1. Развести нилина раствор 10х смесью хлороформ-вода (1: 3 об / об) и перемешивают 200 мкл разведенной полиани- 6,4 мкмоль олигонуклеотиды ДНК-зонд, путем осторожного качания в течение 15 мин в микроцентрифуге трубки.
  2. Облучать раствор ПАНИ-ДНК с 1200 мкДж / см 2 УФ в сшивателя в течение 2 мин. Очень важно, что УФ-облучение ограничивается указанным количеством. Длительное воздействие УФ компрометирует изменения флуоресценции в PANI, вероятно из-за ковалентной сшивки полианилина и ДНК.
  3. Гранул комплексы центрифугированием при 17000 х г в течение 6 мин и промывают фосфатным буферным солевым раствором (PBS). Гранул снова, и повторно приостанавливать в PBS.

3. Hybridization ПАНИ-зонда

  1. Добавить 8 мкл 100 мкМ олигонуклеотидов, комплементарных ДНК или нуклеиновых кислот-мишеней к 200 мкл полианили--зондовых комплексов.
  2. Выполните гибридизацию покачиванием смесь раствора в течение 15 мин при температуре 40 ° С.
  3. Гранул ПАНИ комплексы путем центрифугирования при 17000 мкг в течение 6 мин. Мытье с PBS и повторно приостанавливать в воде.

4. Излучение Устойчивая Измерение флуоресцентного состояния

  1. Добавить Пани из разных процедур в микропланшет 96 скважины и измерения флуоресценции излучения в диапазоне 270-850 нм при возбуждении при 250 нм. Пик излучения для ПАНИ должны наблюдаться около 500 нм.

5. флуоресцентной микроскопией Измерение гибридизовали Duplex

  1. Капельный слой полианилина на боросиликатное стекло покровное и высушивают при 40 ° C в течение 48 часов.
  2. Добавить зонд (8 мкл 100 мкМ) в сухом PANI пленке и облучать его с УФ - светом (1200 мкДж / см 2 ) в течение 2 мин.
  3. Промыть ПАНИ-Probe пленку с PBS и сушат при 40 ° C в течение 48 часов.
  4. Выполните гибридизацию в течение 15 мин путем добавления нуклеиновых кислот-мишеней. Это может быть биологический образец или мишень управления олигонуклеотид (8 мкл 100 мкМ). Следуйте с промывкой PBS.
  5. Получить флуоресцентные изображения при 40-кратном увеличении, с фильтром длиной пропускания 500 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фигура 2А захватывает установку реакции в начале процесса полимеризации, то есть до того APS. Образование мицелл является первым шагом в реакции синтеза происходит процесс-ПАНИ в мицеллярной интерфейсе. Рисунок 2B показывает молочного цвета раствора после 5 мин. 30 мин после того, как АПС добавляется реакция превращается в слегка коричневого цвета. На рис 2С показывает изменение цвета , связанное с образованием олигомеров. На

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Датчик нуклеиновых кислот на основе полианилина требует солюбилизации полимера в воде, с тем, чтобы взаимодействовать с ДНК и РНК. Дисперсия полианилина в воде осуществляется с использованием поверхностно -активных веществ, образующих мицеллы , как сообщалось ранее 8. В дополнение к NaDBS , используемые здесь , другие поверхностно -активные вещества , такие как анионные додецилсульфата эфира 4-сульфофталевой кислоты, поверхностно -активные вещества , такие как неионогенные нонилфенолэтоксилата этоксилата, или...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была поддержана Колледжем науки и технологий Университета Южного Миссисипи и Колледжем науки и технологий Миссисипи, а также программой INBRE штата Миссисипи (награда No P204M103476 от Национального института общих медицинских наук).

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрыть.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анилин Fisher Scientific А7401-500 ACS, жидкостные, охлаждаемые
Пероксидисульфат аммонияFisher Scientific А682-500 САУ, кристаллическая
Додецилбензолсульфонат натрияPfaltz & Bauer D56340 95% твердого
ХлороформFisher Scientific MCX 10601 жидкость
ДНК-праймерыMWG оперонн/апользовательская последовательность ДНК ~20  bps
Microplate США Научный 1402-9800 96 Ну, полипропилен, так как он не реагирует с хлороформом
Микропластинчатая адгезивная пленкаСША Scientific 2920-0000 Снижает загрязнение скважины, разлив проб и испарение
Крышка для микроскопа FisherScientific 12-544-D Покрытие PANI на защитное стекло, облучаемое ультрафиолетовым излучением
УФ-сшиватель UVP HL-2000 Энергия: X100 μ J/cm2; Время: 2 мин
Гибридизационная печьVWR01014705T Температура: 400  ° C; с качанием на 15 мин
Стеклянный аппарат Fisher ScientificТрехгорлыечные круглодонные колбы для реакции; капающая воронка, пробки, конденсатор, разделительная воронка
МикроскопLeica Microsystems Leica IMC S80с увеличением 20X; Псевдоцвет 536 нм; Выдержка 86 мс; Усиление в 1,0 раза;
Молекулярные устройства для чтения микропланшетов 89429-536
. Gamma 1.6

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
  2. Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
  4. Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).
  5. Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
  6. Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
  7. Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).
  8. Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
  9. John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
  10. El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
  11. Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
  12. Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
  13. Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
  14. Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
  15. Kadashchuk, A., et al. Localized trions in conjugated polymers. Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).
  16. Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
  17. Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи