Методическая статья

Фенотипическая Характеристика макрофаги почек крыс с помощью проточной цитометрии

DOI:

10.3791/54599

⸱

18 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает подробный протокол для фенотипической и количественного анализа резидентных макрофагов из почек крыс с помощью проточной цитометрии. Полученные клетки могут запятнанные быть также использованы для других приложений, в том числе клеток, сортировкой анализа экспрессии генов или функциональных исследований, тем самым увеличивая информацию, полученную в экспериментальной модели.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Появляется все больше доказательств, свидетельствующих о важной роли воспаления и, следовательно, макрофагов в развитии и прогрессировании почечной недостаточности. Макрофаги — это гетерогенные клетки, которые участвуют в повреждении почек. Макрофаги можно классифицировать на два различных фенотипа: классически активированные макрофаги (макрофаги М1), которые высвобождают провоспалительные цитокины и способствуют фиброзу; и альтернативно активированные макрофаги (макрофаги М2), которые связаны с иммунорегуляторными функциями и функциями ремоделирования тканей. Эти фенотипы макрофагов необходимо различать и анализировать, чтобы определить их вклад в повреждение почек. Тем не менее, существуют редкие исследования, сообщающие о последовательной фенотипической и функциональной информации о подтипах макрофагов в моделях воспалительных заболеваний почек, особенно у крыс. Этот факт может быть связан с ограниченным количеством маркеров макрофагов, используемых у крыс, в отличие от мышей. Таким образом, необходимы новые стратегии для количественной оценки и характеристики почечного содержимого этих инфильтрирующих клеток надежным способом. В данной рукописи подробно описан протокол переваривания почек и дальнейший фенотипический и количественный анализ макрофагов из почек крыс с помощью проточной цитометрии. Вкратце, почки инкубировали с коллагеназой и идентифицировали общие макрофаги в соответствии с двойным присутствием CD45 (общий антиген лейкоцитов) и CD68 (маркер макрофагов PAN) в живых клетках. Затем последовало поверхностное окрашивание CD86 (маркер M1) и CD163 (маркер M2). Перитонеальные макрофаги крыс использовали в качестве положительного контроля для обнаружения маркеров макрофагов методом проточной цитометрии. Наш протокол привел к низкой клеточной смертности и позволил охарактеризовать различные внутриклеточные и поверхностные белковые маркеры, тем самым ограничив потерю клеточной целостности, наблюдаемую в других протоколах. Кроме того, эта процедура позволяет использовать макрофаги для дальнейших методов, включая, в частности, сортировку клеток и исследования экспрессии мРНК или белков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почечная недостаточность является глобальной проблемой здравоохранения, с повышенной распространенностью и связанной с повышенной заболеваемостью и смертностью1. Одним из наиболее важных механизмов, участвующих в прогрессировании и развитии почечного повреждения, является воспаление, в основном вызванное макрофагами. Макрофаги играют ключевую роль во многих воспалительных заболеваниях, включая почечные расстройства2. Так, сообщалось о повышенном присутствии инфильтрирующих макрофагов при биопсии пациентов с острым повреждением почек (ОПП) или хронической болезнью почек (ХБП)3,4. Недавние исследования показывают, что долгосрочный исход почечной недостаточности может контролироваться макрофагами5,6. В ответ на местное микроокружение макрофаги могут дифференцироваться в различные фенотипы, выполняющие различные биологические функции7. Были установлены два хорошо дифференцированных фенотипа макрофагов: классически активированные макрофаги (макрофаги М1) и альтернативно активированные макрофаги (М2)8. Макрофаги М1 способствуют воспалению, в то время как макрофаги М2 играют противовоспалительную роль и участвуют в восстановлении тканей9. Таким образом, необходимы более глубокие знания о гетерогенности макрофагов для понимания их регуляции и вклада в почечную патологию, а также для разработки новых терапевтических подходов.

Обе модели мышей и крыс широко использовались для понимания молекулярного и клеточного механизма, участвующего в повреждении почек10. Тем не менее, существуют существенные различия в различных маркерах, используемых для идентификации фенотипов макрофагов между этими грызунами. Следовательно, некоторые мышиные маркеры, такие как F4/80 или Ly6C, не используются у крыс, что ограничивает экстраполяцию результатов между этими видами. Кроме того, существует ограниченное количество маркеров, описывающих фенотипы макрофагов у крыс, что объясняет скудность исследований, анализирующих гетерогенность макрофагов у этих животных по сравнению с мышами. Таким образом, необходимы новые стратегии для характеристики подмножества макрофагов для понимания роли макрофагов в моделях заболеваний почек у крыс.

В этой рукописи описан протокол фенотипического и количественного анализа макрофагов из почек крыс с помощью проточной цитометрии. Кроме того, этот метод может быть использован с помощью нескольких анализов, включая сортировку клеток и исследования экспрессии мРНК или белков, чтобы обеспечить углубленную характеристику роли макрофагов при заболеваниях почек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был одобрен местными институциональными уходу и использованию животных комитетов после Директивы 2010/63 / ЕС Европейского парламента и Национального руководящего принципа 53/2013.

1. Приготовление реагентов и растворов

  1. Подготовьте все реагенты и растворы в стерильных условиях и использовать под колпаком с ламинарным потоком. Хранить растворы при 4 ° С.
  2. Готовят окрашивающего буфера (2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в PBS 1X Дульбекко).
  3. Подготовка раствора коллагеназы путем добавления 0,5 мг коллагеназы в каждый мл физиологического раствора.
  4. Подготовка анестезии раствор кетамина / ксилазина (2: 1 об / об).

2. Почечная перфузия и экстракция

  1. Обезболить крыс путем внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина (75 мг / 12 мг / кг массы тела). Тщательно зажать небольшой складки кожи, чтобы убедиться, что животное достаточно наркозом. Затем покрывают глаза ветеринара мазь для предотвращения сухости под наркозом. Примечание: 4-MONго-самцам крыс Wistar используются в данном анализе.
  2. После того, как крыса полностью под наркозом, поместите его на операционном столе в положении лежа на спине.
  3. Применяют 70% этанола в брюшной полости.
  4. Сделайте центральный разрез через кожу живота и брюшины, от лобка к грудной клетке, чтобы выставить плевральной и брюшной полости.
  5. Вводят физиологический раствор (0,9%) в брюшную аорту заливать почки с помощью перфузионной системы, пока вся кровь не будет удалена из почек. Вырезать аорты на уровне живота, чтобы помочь выпустить кровь.
  6. Удалить обе почки от крыс путем разрезания от почечной рубчика (почечной вены, артерии и мочеточника). Для decapsulate почки, прижимать край почки с помощью пальцев, тщательно отделяя капсулы 11.
  7. Поместите почку в сбалансированный солевой раствор Хэнкса.

3. Почки Пищеварение и клеточной суспензии

  1. Вырезать половина почки с ножницами на мелкие кусочки и положитьчастей в 1,5 мл пробирку.
    Примечание: Все следующие концентрации рассчитаны для 1 образца (почки 1/2 крысы).
  2. Добавляют 1 мл раствора коллагеназы и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Смешайте переворачиванием каждые 5 минут, чтобы убедиться, что раствор коллагеназы получает доступ к всей ткани.
  3. Собирают решение и передать его через сито (40 мкм) с помощью плунжера, и вновь суспендируют его в 10 мл окрашивающего буфера.
  4. Центрифуга при 400 х г в течение 15 мин.
  5. Повторное приостановить осадок в 1 мл ACK (аммоний-хлоридно-калий) Lysing буфера. Через 1 мин 30 с при комнатной температуре, добавляют 10 мл окрашивающего буфера для остановки реакции.
  6. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин.
  7. Повторно приостанавливать осадок в адекватном объеме окрашивающего буфера (1 мл) и фильтруют суспензию клеток с использованием сетчатого фильтра (30 мкм).
  8. Подсчитайте число клеток с использованием трипанового синего на гемоцитометра и добавить 2 миллиона клеток в 1,5 мл пробирку для STAоцен- ками.

4. Сотовый анализ Окрашивание и проточной цитометрии

  1. Центрифуга клетки при 100 мкг в течение 5 мин.
  2. Повторное приостановить осадок в 100 мкл крысиной сыворотки (разведенным 1: 100) в течение 10 мин при 4 ° C, чтобы блокировать Fc-рецепторы.
  3. Промыть путем добавления 1 мл окрашивающего буфера и центрифуге 100 мкг в течение 5 мин.
  4. Смешать антител к клеточной поверхности окрашивания в 100 мкл окрашивающего буфера для каждого условия: CD45, АРС-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) и раствор для обнаружения живых клеток (3: 1000).
  5. Повторное приостановить осадок клеток в смеси антител в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
  6. Промыть путем добавления 1 мл окрашивающего буфера и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин. Повторите этот шаг.
  7. Добавьте 600 мкл раствора / пермеабилизирующего Fixation в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
  8. Промыть 2 раза с 1 мл пермеабилизирующего / промывочного буфера и центрифугируют при 170 х г в течение 5 мин.
  9. Добавить антитела CD68 FITC (35: 1000) для intracellular окрашивание в 100 мкл буфера пермеабилизирующего / промывочного раствора для каждого условия.
  10. Повторное приостановить осадок в CD68-антитело раствора и инкубировать 50 мин при 4 ° С в темноте.
  11. Промыть 1 мл пермеабилизирующего / промывочного буфера и центрифуге при 170 мкг в течение 5 мин.
  12. Повторное приостановить осадок в 100 мкл буфера пермеабилизирующего / Wash, добавьте CD86PE антитела (35: 1000) и инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
  13. Вымойте добавлением 1 мл пермеабилизирующего / Wash буфера и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин.
  14. Повторное приостановить осадок в 100 мкл буфера пермеабилизирующего / Wash и передать его в проточной цитометрии трубки.
  15. Анализ проб с помощью проточной цитометрии. Определение CD45 окрашивание в живых клетках закрытого типа в боковой рассеянный свет / вперед рассеянного света (/ FSC SSC) окна. На втором этапе, анализировать CD86 и CD163 выражение в CD68 + клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы проанализировали макрофагами гетерогенность в воспалительной экспериментальной модели повреждения почек, связанных с повышенным присутствием инфильтрации макрофагами в почках. В этой модели, повреждение почек индуцировали введением альдостерона (1 мг -1 кг -1 день) плюс соль (NaCl 1%) в питьевой воде в течение 3 -х недель у крыс линии Вистар, как сообщалось ранее 12.

График наших эксперимент...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги являются гетерогенными клетки, которые играют важную роль в различных воспалительных заболеваний, в том числе почечных расстройств. Существует растущий интерес к характеристике макрофаги подмножеств при заболеваниях почек , так как каждый макрофаг субпопуляции способствует различным способом к развитию почечной травмы, как сообщается в гломерулонефрита, диабетической нефропатии и рака почки 14-16. На ранних стадиях острого повреждения почек, наблюдается преобладание M1 макрофагов, способствуя тубуля...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 и PI14/00883), Испанского общества атеросклероза, Испанского общества нефрологии и Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) Хуану Антонио Морено. Фонды FIS/FEDER PI14/00386 и Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica to Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rabago to Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) to Alfonso Rubio Navarro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ламинарный проточный колпакFasterИли аналогичное оборудование
ЦентрифугаHettichИли аналогичное оборудование
Проточный цитометр (FACSAria)BD Biosciences
Фетальная бычья сывороткаBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
КоллагеназаSigma-Aldrich12/1/9001
ACK Лизирующий буферThermo Fisher ScientificA10492-01
Проточные цитометрические фильтрыBD Biosciences340626
Falcon Cell СитерыThermo Fisher Scientific352340
Проточные цитометрические пробиркиFalcon3520525 мл Полистирольная трубка с круглым дном
Центрифужные пробиркиCorning centristar430791
Водяная баняMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 °
C Раствор для фиксации/пермеабилизации или буфер для пермеабилизации/промывкиBD Biosciences554714
Ромпум (ксилазин)Байерили эквивалент
кеталара (кетамина)PfizerИли эквивалент
сбалансированного солевого раствора ХэнксаSigma-AldrichH8264-500ML
Физиологический растворBraun
Anti-CD45 (клон: OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Разбавленный 1:100
Анти-CD68 (клон: ED1) FITCBio-RADMCA341FРазбавленный 35:1,000
анти-CD86 (клон: 24F) PEBiolegend200307Разбавленный 35:1,000
анти-CD163 (клон: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RРазбавленный 4:100
Живой/мертвый морилка Молекулярные зондыL34955разбавленные 3:1,000
622415

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946(2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD45 CD68CD86 CD163M1 M2

Похожие статьи