Методическая статья

Субклеточные патч-зажим Recordings от Somatodendritic домена нигральных дофамина нейронами

DOI:

10.3791/54601

⸱

2 ноября 2016 г.

1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Субклеточные записи патч-клэмпа дают возможность исследовать функциональные свойства дендритов. Однако эти тонкие структуры труднодоступны из-за их небольшого диаметра. Описанный здесь протокол направлен на облегчение сбора стабильных и надежных записей из дендритов дофаминовых нейронов в срезах in vitro.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендриты дофаминергических нейронов получают и передают синаптическую вход, поддержка потенциала действия обратного распространения и высвобождения нейромедиаторов. Понимание этих основных функций будет пролить свет на передачу информации в этих нейронов. Дендритные записи патч-зажим обеспечивают возможность непосредственного изучения электрических свойств дендритов и лежащих в основе напряжения закрытого ионных каналов. Тем не менее, эти тонкие структуры не являются легко доступными для патч-пипеток из-за их малого диаметра. В настоящем докладе описывается процедура шаг за шагом собрать стабильные и надежные записи из дендритов дофаминергических нейронов в острых срезов. Электрофизиологические измерения объединены с постфактум восстановлением морфологии клеток. Успешные эксперименты опираются на повышении качества подготовки срезов, растворов и пипеток, адекватной регулировки оптики и стабильности пипетке в контакте с записанной структурой. Стандартные принципы сомаА.Т.И.Ц. записи патч-зажим применяются к дендритов, но с более мягким подходом пипетку. Эти универсальные методы могут быть реализованы для решения различных вопросов, касающихся возбудимых свойств дендритов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейроны получают синаптическую информацию преимущественно на их дендритов. Возбуждающие и тормозные синаптические сигналы распространяются от их места производства к месту интеграции, где потенциалы действия (AP) вызываются в качестве выходного сигнала. На их пути, синаптические потенциалы влияют как структуры дендритов и взаимодействия между пассивными и активными свойствами мембраны. Сочетание этих параметров сильно изменяющимися расширяет вычислительные мощности нейронов 1,2. Тем не менее, малый диаметр дендритов мешает однако исследование их электрических свойств. Непрерывное развитие техники патч-зажим 3, оптика 4 и уточнение способов получения срезов 5 в течение последних десятилетий позволили записи с очень тонким (0,7 - 3 мкм Ø) дендриты 6,7. Эти методы были, и, по-прежнему в основном используются для изучения возбудимость дендритов в различных OF нейроны 8. Прямые дендритные записи имеют важное значение для определения распределения 9-19 и различия в функциональных свойствах 20-22 ионных каналов в различных нейрональных отсеков. Эти данные являются необходимым дополнением распределений каналов ионов , обнаруженных с помощью иммуногистохимии в сочетании с легкой и электронной микроскопии 23,24. Двойные somatodendritic записи были реализованы для изучения распространения потенциалов действия 9,13-15,21,22,25-27 и расширяющих синаптических потенциалов 13,16,18 вдоль somatodendritic области нейронов, получить детальные пассивные модели кабельных 28- 30 и исследовать временное разрешение нейрональной интеграции 31.

Черной субстанции (SN) является область, расположенная в среднем мозге, участвующих в нескольких функций, таких как контроль движения, кодирование вознаграждения и привычных форм поведения. Снижение дофамина в связи с особенностямипотеря дофаминергических (DA) нейронов в SN связано с двигательных нарушений , наблюдаемых у пациентов , страдающих болезнью Паркинсона 32. Черной субстанции схема состоит из двух основных типов клеток: дофаминергические и ГАМКергических нейронов. Интересно, что эти нейроны имеют ряд специфических особенностей, которые отличают их от других нейронов. Аксон большой долей DA нейронов и некоторых ГАМК нейронов происходит от дендритной сайта , указывая , что дендритов неоднородна (аксонов несущих и аксонов-дендриты отсутствуют) 25,26,33. Морфология этих нейронов контрастирует поэтому с типичной организации нейронов , в которых передача информации следует закон динамической поляризации испускаемого Кахалем: начиная от дендритов к соме и , наконец , к аксона 34. DA нейроны также известно, высвобождение дофамина из своих дендритов 35, генерируют разрывной активность 36 и NMDA-рецептор пластичностью 37. dissecние этих явлений неуловим без прямых записей с того места, где они зарождаются. Для того, чтобы получить представление о взаимосвязи между точным местоположением и функциональных свойств ионных каналов и их роли в дендритных возбудимости и передачи информации в нигральных нейронов, прямые дендритные записи являются методом выбора.

В этом докладе описывается подробная процедура , которая может быть использована для получения одно- и двойной записи патч-зажим с дендритах нейронов черной субстанции и соответствующего Постфактум biocytin маркировки. Основные принципы латание соматического и дендритных мембраны очень похожи. Практически, однако, записи с дендритных сайтов требуют специальной оптимизации по сравнению с соматическими записей. Успешные дендритные записи полагаться на качество срезов, оптимальная регулировка оптики, мягкий подход патч пипетку и стабильности записей.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, следуют институциональные и национальные директивы, директивы ЕС по защите животных и Руководства Федерации Европейской лабораторных животных научной ассоциации.

1. Приготовление растворов

  1. Стандартный искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF; Таблица 1)
    1. Используйте соли высокой чистоты 38 и чистые стеклянные мензурки предварительно промыты дважды дистиллированной водой , чтобы приготовить свежий раствор. Используйте высококачественную бидистиллированной воды для приготовления всех внеклеточном и внутриклеточном решений.
    2. Взять 2 л лабораторный стакан для растворения NaHCO 3 в 500 мл воды , а другой , чтобы растворить другие соли, чтобы предотвратить осаждение двухвалентных ионов 39 в соответствии с таблицей 1. Очистки подноса систематически с дважды дистиллированной водой и высушить его , прежде чем принимать соль , С помощью магнитной мешалки гомогенизировать dissolutioп. Добавьте решения от обоих стаканах на соответствующую мерную колбу и доводят до нужного объема.
    3. Убедитесь в том, что окончательное внеклеточной решение полностью прозрачным и без каких-либо следов осадков.
    4. Нанесите газовую смесь , состоящую из 95% O 2 и 5% CO 2 (карбогена газа) со стеклянной микрофильтра свечи (Ø 13 мм) 20 - 30 мин до перфузируя ломтики 38,40. Тщательно контролировать осмолярность (2 - 3 последовательных измерений) от ACSF с осмометре (оптимальный диапазон: 314 - 325 мОсм / л). Хранить остатки раствора после приготовления при температуре 4 ° С и используют его в течение 3-х дней.
  2. Раствор для резки (сахароза-ACSF; Таблица 2) 5,13
    1. Приготовьте 3 л свежего раствора. Используйте 1 л для приготовления срезов мозга от одного животного. Хранить остатки раствора при 4 ° С и используют его в течение 3-х дней.
      Примечание: Высокий Mg 2+ и низкие концентрации Ca 2+ используются для гecrease синаптической передачи и замена некоторых NaCl с сахарозой , чтобы сохранить ткани 5,40.
  3. Внутриклеточные растворы
    1. Приготовьте заранее 100 мл раствора для двойной записи целых клеток (таблица 3).
    2. Включите метилсульфат 13,15,21 , чтобы получить хорошее восстановление клеточной морфологии. Добавить biocytin (0,1 - 0,4%) для изучения впоследствии морфологии нейроне. Включите флуоресцентный краситель (например, Alexa 594 или 101 сульфородамина 41) следить за расширением дендритов во время записи ( по желанию).
    3. Приготовьте заранее 100 мл раствора электрода для клеток подключаемых записей (таблица 4). В этом случае внутреннее решение является высокой К + решение , предназначенное для изоляции макроскопический гиперполяризации активированный катионом ток (I H) и содержит блокираторы для других напряжения закрытого ионных каналов.
    4. Хранить внутриклеточные растворы в 2 мл аликвотах при -20 ° C. Используйте новую аликвоту для каждой новой сессии записи. Проверьте осмолярность каждой талой аликвоты тщательно с осмометре. Возьмем новую аликвоты, если осмолярность не соответствует исходному значению.
    5. Переносят раствор из аликвоты в 3 мл шприц на верхней части которой фильтр 0,22 мкм стерильный шприц помещен. Держите шприц на льду во время сеанса записи, чтобы ограничить деградацию его соединений (АТФ, ГТФ или фосфокреатина).

2. Изготовление и заполнение Patch Пипетка

  1. тянущий
    1. С помощью горизонтального электрода съемник и толстостенных боросиликатного стекла трубки. Для всей-клетка и клетка-прикрепленный записи, используйте 2 мм наружный диаметр / 1 мм внутренний диаметр. Убедитесь в том, что стеклянная трубка является абсолютно чистым 38.
    2. Если это не так, погружают стеклянные капилляры , в органическом растворителе (например, этаноле), А затем в дважды дистиллированной воде. Кратко нагреть капиллярные окончаний с горелкой Бунзена. В качестве альтернативы, заказать стеклянные трубки промывают и нагревают непосредственно от производителя (см список материалов).
    3. Для двойных somatodendritic записей, убедитесь , что соматические сопротивление пипеток составляет от 6 до 10 МОм 6,11 и между 8 и 19 МОм дендритных пипеток при заполнении внутриклеточных раствором (таблица 3). Стандартизируйте сопротивление пипеток для клеточных подключенных к записи сопротивления 10 МОм для достижения сопоставимых результатов вдоль somatodendritic области нейроне 16,18,42,43.
    4. Подготовьте свежие пипетки перед каждой записью сессии (каждый день) или непосредственно перед выравниванием и использовать их 5 - 8 ч после их изготовления 39. Храните пипеток в закрытой стеклянной посуде, чтобы защитить их от пыли и закупорке наконечника.
  2. Полировка
    1. Осмотрите и АЭМт-польский каждый наконечник пипетки с microforge, чтобы получить лучшие уплотнения с мембраной. Перед использованием microforge, растопить небольшой кусочек стекла на платиновой нити нагрева. Заменить это стеклянное покрытие на платиновой нитью ежедневно на постоянстве (Peter Jonas, личное сообщение).
      Примечание: Пипетки, используемые для клеточных подключаемых записей могут быть покрыты до тепловой полировки шаг, чтобы уменьшить фоновый шум. Покрытие может быть достигнуто с изолирующим средством , таким как расплавленный воск зубной 22,44 или силиконового эластомера 39.

3. Подготовка мозга Ломтики

  1. Используйте здоровые крысы Wistar в возрасте от 16 - 19 дней. Не следует использовать вредные для здоровья животных или животных, страдающих от гипотермии или обезвоживания. Перед тем как начать подготовку срезов держать животное в безопасном и тихом месте. Избегайте любое другое животное в комнате во время подготовки животного. Манипулирование животных мягко.
  2. Налейте сахароза-ACSF на две части 400мл полипропилен (PP) мензурки и поместите их в -80 ° C морозильнике в течение 45 мин. Приготовьте раствор, чтобы получить однородную жидкость / замороженного раствора лед холодной и поместите мензурки на льду. Поставка раствора сахарозы ACSF с карбогена газа с использованием микрофильтра свечу (Ø 13 мм) в каждом стакане ПП.
  3. Подготовьте слайсер и резервную камеру
    1. Используйте слайсер ткани высокого качества с очень низким вертикальных колебаний 5,38 , чтобы свести к минимуму повреждение поверхностных слоев срезов в максимально возможной степени . Fix свежий и весь лезвие бритвы на резателя.
    2. Используйте новый лезвие бритвы для каждой режущей сессии. Избегайте изгиба лезвия бритвы. Не снимайте жировую пленку на поверхности лезвия бритвы (Josef Bischofberger, личное сообщение).
    3. Если есть возможность, проверьте вертикальную вибрацию с виброщуп, предоставленного производителем. В качестве альтернативы, использовать заказные виброщуп 5. Уменьшение вертикальных колебаний лопасти сO, чтобы быть как можно ближе к 0 мкм.
    4. Подготовьте 150 мл резервную камеру 45,46 а для срезов , как показано на стр. 201 в работе. 39. Налейте стандартный ACSF в резервную камеру и поместить его на водяной бане. Поставка решение резервной камеры с карбогена использованием микрофильтра свечу (Ø 6 мм). Убедитесь в том, что карбогена пузырьки, как крошечные, как это возможно.
      Примечание: Создайте новую резервную камеру каждые 2 - 3 месяца, чтобы сохранить постоянное качество среза.
  4. Вырезать ломтики
    1. В тихой комнате, в которой экспериментатор не нарушается или напряженном, обезглавить животное с хирургией ножницами (длина 150 мм) на уровне шейного отдела продолговатого мозга.
    2. Разрежьте кожу в верхней части головы животного в носовой к каудальном направлении с скальпелем и снимите ее с боков. Отрежьте верхнюю часть черепа от хвостового к носовой части головы с мелкими ножницами и удалить обе части черепа в боковом направлении. Удалите бдождь с тонким шпателем и поместите его осторожно в стакан , содержащий PP ледяная (0 - 4 ° С) , сахароза-ACSF , уравновешенную карбогена 38.
      Примечание: Эта последовательность шагов должно быть сделано как можно быстрее, но и придирчиво (<< 1 мин, примерно 40 лет).
    3. Держите мозг в растворе стакана ПП для ~ 2 до 5 мин. Отрегулировать давление карбогена, чтобы избежать движений мозга. Заменить свечу микрофильтра, если карбогена пузырьки слишком велики с новым.
    4. Поместите мозг на 9 см чашки Петри , в котором внутренняя дно покрыто ~ 0,5 см толщиной Sylgard слоя 38. Готовят эту чашку Петри заранее.
    5. Окружите мозг с ледяной сахароза-ACSF. Убедитесь, что некоторое количество жидкой фазы из ACSF-раствор сахарозы погружает мозг. Для корональных срезов, отрезали лобную часть мозга во фронтальной плоскости с помощью скальпеля или лезвия бритвы. Удалить мозжечок с корональной разреза.
    6. Применить цианоакрилатный клей на образец лоток (площадь ~ 1 см 2). Вставьте блок мозга таким образом, что передняя часть обращена к стадии нарезки. Тщательно капать сахароза-ACSF поверх наклеенной головного мозга с использованием большого открытия стеклянной пипетки Пастера и затем медленно погружаются режущую камеру резателя. Маневр лоток образца таким образом , чтобы режущая поверхность (то есть, первая ткань ударить лезвие) является вентральной мозга 40.
    7. Применяют карбогена с гнутым стеклом микрофильтра свечи (Ø 6 мм) до режущей камеры (по желанию).
    8. Отрегулируйте лезвие под углом ~ 15 ° , со ссылкой на горизонтальную плоскость 5. Вырезать корональные срезы мозга от ~ 500 мкм в каудально направлении носа до достижения черной субстанции. Уменьшение толщины сократить 300 - 350 мкм срезы толщиной, содержащие интересующую область.
    9. Отдельные кусочки из блока ткани с очень тонкой иглой перфузионной прикрепленной кшприц параллельно кромке лезвия бритвы. Изгиб иглы так, чтобы иметь угол 90 ° между иглой и шприцем. Убедитесь, что давление не применяется к бритвенным лезвием, удаляя Срез от блока ткани.
  5. ломтики магазин
    1. Перенесите ломтики, используя наибольшее отверстие стеклянной пипетки Пастера (прилагается к лампочке) в резервной камере. После того, как все срезы переносят в резервную камеру (Кристофа Шмидт-Хибер, личное сообщение) довести температуру воды в ванне до 34 ° C в течение 0,5 - 1 ч.
    2. По истечении этого периода выключите ванну воды и держать ломтики при комнатной температуре. Отрегулировать давление карбогена, чтобы избежать перемещения ломтиков в резервной камере. Держите ломтики в течение еще 10 до 20 минут до начала записи.
    3. Очистите оборудование и микрофильтра свечи тщательно пока тщательно с дважды дистиллированной водой в конце SLICing процедуру.

4. Двойные соматические и Somatodendric Записи в нигральных Нейроны и Biocytin Filing

  1. Следуйте описания для сборки установки патч-зажим для срезов данных в аксона руководстве и в работах. 39,40,47. Информация о более основные аспекты внесения исправлений в работе. 48.
  2. Подготовка записи камеры
    1. 1-е место - 2 мл дважды дистиллированной воды в камере записи. Убедитесь в том, что это не дырявая. Поместите камеру записи на зыбкую ху таблицы.
    2. Поток стандартных ACSF через кислородонепроницаемой перфузионной системы насосно-компрессорных труб (политетрафторэтилена) в записи камеры. Стабилизировать поток перфузионной в камере со скоростью 4 - 5 мл мин - 1. Хранить длину трубки, соединяющей химический стакан, содержащий ACSF и запись камеры как можно более коротким (1 м).
    3. Выберите срез мозга из резервной камеры и передавать его во записи камеры, используя наибольшее отверстие стеклянной пипетки Пастера. Накройте срез с платиновым кольцом, чтобы закрепить ее в нижней части записи камеры, как показано на стр. 201 в работе. 39. Используйте плоскую платиновое кольцо (Ø 1,5 см) и клей параллельные нейлоновые резьбу (расстояние> 2 мм) на нем.
  3. Настройка и оптимизация оптики
    1. Визуализируйте срезы с помощью инфракрасного (ИК) видеомикроскопия 4,47,49,50. Отрегулируйте освещение Колер 51 и оптимизировать дифференциальный интерференционный контраст (DIC) 51 оптикой или косое освещение (Dodt градиент контрастности - DGC) 52,53. Более подробно об этой процедуре приведены в работах. 40,49.
    2. Проверьте качество среза. Только держать ломтики с гладкой и ровной поверхности, которые не слишком сильно контрастируют и имеют лишь небольшие, рассредоточенные кратеры.
    3. Заполните 2 свежие и неиспользованные пипетки патч с внутриклеточным раствором ( Таблица 3). С помощью 0,5 мл пробирку, содержащую раствор пипеткой, чтобы заполнить кончик пипетки капиллярного действия. Чтобы ускорить заполнение кончика пипетки без нити, применить отрицательное давление к концу пипетки с использованием трубки, присоединенные к шприцу.
  4. Расположите пипеток над поверхностью среза
    1. Проверьте наличие хлорида покрытия на серебряных проволок (ванна электрода сравнения и патч - электрода, для получения дополнительной информации смотрите в Руководстве и Refs Axon 39,54.).
    2. Вставьте пипетки последовательно в держатели пипетки и применять положительное давление (~ 70 мбар) с использованием схемы трубопровода , соединяющего держатель пипетки, трехходовой кран и манометр 40. Опустить пипетку в ванну записи камеры.
    3. Убедитесь, что значение давления на манометре постоянна в течение ~ 1 - 2 мин. Если давление падает, проверьте трубки или уплотнительные кольца круглого сечения внутри держателя пипетки.
    4. Поместите кончик пипетки в середине видео монитора и убедитесь, что он не мешает. Убедитесь в том, что кончик пипетки не двигается при подаче или снятии давления на пипетку.
    5. Проверьте дрейфа и колебаний кончика пипетки, нарисовав небольшой крест в центре монитора точно в положении наконечника пипетки и наблюдать за 5 мин возможных перемещений наконечника.
    6. Применить шаг напряжения (5 мВ), чтобы контролировать сопротивление пипетки на осциллографе. Установить удерживающий потенциал пэтч-кламп усилителя до 0 мВ. Отменить пипетку смещение потенциала таким образом, что пипетка ток считывает ноль на метр усилителя 39,51.
    7. Перемещение пипетки вниз к срезу и поддерживать их над поверхностью.
  5. Выберите и залатать нейрон с длинными дендритов
    1. В черной субстанции выбрать здоровый нейрон с длинными дендритов, которые могут быть затем на большом расстоянии примерно в той же плане (рис 1А и 1В) с использованием ИК-Dodt Градиент Контраст (ИК-DGC). Выберем гладкую и однородную тело клетки. Избегайте двух сильно контрастировали клеток на поверхности среза (рис 1C и 1D), так как трудно взломать и сохранить стабильные условия записи с течением времени (устойчивое сопротивление серии). Выберите нейроны, которые имеют свои сома 10 - 30 мкм под поверхностью среза.
    2. Переместить соматическую электрод близко к сомы (40 - 50 мкм) и расстояние дендритов электрода близко к дендритов на том же расстоянии. Используйте увеличение 2X (четырехкратное чейнджером), чтобы выбрать и патч часть дендритов. Получить на мониторе абсолютного увеличения 2,100X без увеличения (1X) и 5,500X с увеличением 2X.
    3. Слегка ослабить давление соматического пипеткой на 10 мбар. При необходимости, регулировать дендритов и соматический давление пипетки, чтобы избежать смещения CСтруктура ELL (сомы и дендритов) в срезе.
    4. Поместите дендритных пипетку близко к мембране, чтобы увидеть небольшую рябь. Ослабить давление на кончик пипетки и патч дендриты, контролируя сопротивление пипеток. В идеальных условиях, лишь очень небольшое отсасывания достаточно, чтобы получить хорошее уплотнение.
    5. Держите дендритных пипетку в режиме клеточного прилагается. Переместить соматическую пипетки близко к соматической мембране и залатать соматической мембраны. Убедитесь в том, что высокое сопротивление уплотнение получено до разрывания клеточной мембраны (> 1 ГОм) 39. Слегка втягивать обе пипеток от мембраны на несколько мкм, чтобы избежать деформации тела клетки и дендритов.
    6. Для обоих пипеток, уменьшить в максимально возможной амплитуды пипетку емкости переходными поверх текущего шага с использованием импульса напряжения с высоким коэффициентом усиления и мало фильтрации 51 и осциллографом. Войти в режим Wi цельноклеточнаяй дендритной пипеткой, а затем с соматическим пипеткой.
    7. Исключите емкости переходными цельноклеточная и компенсировать последовательное сопротивление. Мониторинг и документирование сопротивления доступа в начале, и регулярно во время эксперимента. Если последовательное сопротивление слишком велико (> 50 МОм), повторите с другой пипеткой.
    8. Сбор фотографий IR-DGC (рис 1А и 1В) с Видеографический принтер 25, видеозахвата или цифровой камеры при высоких и низких увеличениях.
      Примечание: Отек нейронов во время записи (рис 1E и 1F) спорадически наблюдается, но редко когда осмолярность и рН растворов отрегулирована правильно 39.
    9. Получить двойные соматические записи целой клетки (сомы - Сома) с той же процедурой (рис 2А).
  6. Применяют длинные (несколько сотен миллисекунд) увеличение тока деполяризующими шаги последовательнос соматической и дендритных пипеткой , чтобы вызвать точки доступа (фигуры 2B, 3C и 3D). Запишите полученный потенциал на дендритные и соматической пипеткой одновременно.
  7. Изучить распространение искусственных возбуждающих постсинаптических потенциалов (aEPSPs) в дофаминергических нейронов
    1. Создание возбуждающих постсинаптических ток (EPSC) Форма волны , чтобы впрыснуть в качестве текущей команды во время двойной записи ток-зажим (Фигуры 4A и 4B). Чтобы сделать это, построить двойную экспоненциальную функцию со значениями амплитуды и времени , конечно , соответствующих реальным значениям измеренных для EPSCs в нейроне интереса 55. Тщательно контролировать частоту дискретизации построенного EPSC и закачиваемой EPSC сигнала, чтобы сохранить оригинальный ход времени.
      Примечание: Перед использованием формы сигнала в реальном нейроне, протестировать его с помощью модели клетки.
    2. Последовательная впрыскивать сигнала с помощью дендритных исоматическая пипетку и записывать в результате чего потенциалы для обоих соматические и дендритные пипеток одновременно. Регулярно проверяйте на предмет возможного дрейфа пипеток.
  8. Расторжение запись с нейроном
    1. Возьмем картину ИК-DGC при малом увеличении (объектив: 5x или 10x) документировать положение нейрон в срезе и электродами.
    2. Медленно и осторожно вывести дендритной и соматические пипеток из нейрональные мембраны последовательно, чтобы сформировать снаружи из пластырей с обеих пипеток. Удалите пипетку с помощью последовательности бокового движения вверх 38. Они должны быть короткими сначала, а затем постепенно увеличивать в длину. Эта конфигурация записи способствует надлежащего закрытия клеточной мембраны.
    3. Монитор уменьшение емкостных токов (увеличение сопротивления доступа) в ответ на 5 мВ импульса напряжения в напряжение-зажим при выводе пипетки.
    4. После того, как мембрана морепривело вокруг кончика пипетки, возьмите его полностью из записи камеры. Удалить задачу из ванны. Держите ломтик в записи камеры в течение 15 - 20 мин в стандартном ACSF, чтобы позволить уравновешивание biocytin (из внутриклеточного раствора) в записанном нейроне.
    5. Аккуратно перенести срез используя большое отверстие пипетки Пастера в 25 мл широкий рот желтый (коричневый) бутыль из стекла, содержащего стандартный ACSF. Закройте бутылку с крышкой. См пункт 6 для фиксации шага.

5. Клеточные прилагается Recordings

  1. Выберите нейрон с дендрит простираясь на большие расстояния в одной плоскости. Убедитесь в том, что дендрит интерес может следовать к хорошо определенной сомы.
  2. Заполните патч пипетки с электрода раствором (таблица 4). Дизайн решение для записи текущего интереса к конфигурации соты прикреплены путем включения конкретных фармакологических средств для блокирования других ионных тяnnels.
  3. Патч дендритов в режиме клеточного прилагается
    1. Визуализируйте часть дендритов и подход перекодирование пипетку с помощью манипулятора. Адаптировать давление на кончике пипетки, проверяя манометр (70 - 80 мбар), чтобы избежать смещения дендритов. Патч дендриты, как описано в 4.5.4.
    2. Запишите несколько снимков ИК-DGC (рис 5А). Постарайтесь , чтобы получить сопротивление уплотнения , как большой , насколько это возможно (> 1 ГОм 39), в лучшем случае от 3 - 10 ГОм для мобильных подключенных записей 18 (рис 5б). Отвести пипетку от мембраны на несколько мкм, чтобы избежать деформации дендритов.
    3. Соблюдайте биотоки в режиме клеточного прилагается отражающий спонтанные потенциалы действия нигральных нейронов. Дополнение к ACSF с Са 2+ и блокаторов Na + каналов (CdCl 2 и ТТХ, соответственно) для подавления биотоки.
    4. Нанесите 2 SVoltage шаг -90 мВ от удерживающей потенциала 0 мВ до патча , чтобы вызвать у меня ч (5С). Имейте в виду , что потенциал пипетки и мембранный потенциал покоя в серии в конфигурации 56-клеточной прилагается. Более подробную информацию можно найти в руководстве Axon и Ref. 39.
    5. Регулярно проверяйте на предмет возможного дрейфа пипеткой.
    6. В конце записи, разорвать патч, чтобы идти в режиме целых клеток и сразу же взять отсчет мембранного потенциала. Отвести пипеткой, как описано в разделах 4.8.2 и 4.8.3, чтобы получить вне-аут патч.
  4. Запись с соответствующей сомы в режиме цельноклеточная
    1. Посмотрите вдоль дендритов и найдите соответствующий сому. С помощью высокоомного пипетку (5 - 10 МОм) 6,14,57 , наполненную K + основанное внутриклеточных решение (таблица 3). Применить краткое всасывание (отрицательное давление) кнаконечник пипетки для разрыва мембраны, чтобы войти в режим целых клеток.
    2. Проверьте идентичность нейрон в текущем зажимом путем применения длинный гипер- и деполяризующими ступенек тока (рис 5D) и позволяют biocytin диффундировать вдоль дендритов. Применить короткие текущие шаги деполяризующими визуализировать время курс AP.
    3. После ≤10 мин, снять пипетку, чтобы получить внешний выход патч, как описано в разделах 4.8.2 - 4.8.3. Аккуратно перенести срез используя большое отверстие пипетки Пастера в 25 мл из янтарного стекла бутылки, содержащей стандартный ACSF. Закройте бутылку с крышкой.
    4. В качестве альтернативы, сначала получить соматический поклеточного с пипеткой раствором, содержащим дополнительно флуоресцентного красителя. Разрешить диффузию красителя и выбрать часть дендритов 26. Со вторым пипеткой, залатать дендриты в режиме клеточного прилагается. С помощью конфокальной микроскопии, если доступны, чтобы улучшить визуализацию флуоресцентно этикеткеред дендритов 14,22.
    5. Выполните дендритные записи в конфигурации вне-вне, в качестве альтернативы или дополнительно к сотовым подключением записи 10,22. См пример напряжения закрытого токов , зарегистрированных от внешнего выход патча на рисунке 5E и 5F.

6. Biocytin Этикетировочное нигральных Нейроны

  1. Фиксирование ткани
    1. Если это возможно, использовать отдельные комнаты для записи ломтик / гистохимического обработки 38.
    2. Закрепить ломтиков путем замены ACSF 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS, рН 7,4) с помощью пипетки Пастера. Всегда используйте свежеприготовленный Фиксирующий раствор (<< 1 неделю назад).
      ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующие перчатки руки и химический капюшон помещен в гистологии лабораторию, чтобы манипулировать параформальдегида из-за его токсичности. Прочитайте паспорт безопасности этого опасного продукта перед использованием и сХек правила, касающиеся химической безопасности (Директива об опасных веществах (67/548 / EEC) от Комиссии ЕС), как этот порошок, как полагают, чтобы вызвать рак. Другие детали находятся в работе. 58.
    3. Поместите срезы при 4 ° С в течение ночи. Избегайте загрязнения установки патч-зажима или любого оборудования, используемого для электрофизиологии параформальдегидом.
    4. После фиксации заменить Фиксирующий раствор с PBS. Используйте различные пипетки Пастера для удаления закрепляющего раствора и применяя PBS. Храните ломтики в PBS при 4 ° С перед дальнейшей обработкой (1 - 2 недели). В этом случае, замените PBS дважды в неделю. Используйте всегда свежеприготовленные PBS (<< 1 неделю назад).
  2. Окрашивание ткани
    1. Приготовьте 24 луночный культуральный планшет для этапов окрашивания. Используйте чистое оборудование для передачи ломтиками. Ополосните ломтики 3 х 5 мин с использованием свежей PBS.
    2. Применить Флюоресцеиновая авидин DCS (авидин D, клеточный сортер класс; 1 мкл fluorescein / мл Тритона Х-100) и 0,3% Тритон Х-100 в PBS при 4 ° С в течение ночи. Защитите ломтики от света в течение окрашивания. В качестве альтернативы флуоресценции, нейроны меток с помощью 3,3'-диаминобензидино для света или электронно - микроскопического анализа 21,58.
      ВНИМАНИЕ: Triton Х-100 является опасным. Прочитайте паспорт безопасности и директивы Комиссии ЕС перед использованием этого вещества.
    3. Промыть 3 х 30 мин с PBS, а затем с PB (фосфатным буфером, чтобы избежать образования кристаллов на поверхности среза).
  3. Установите ломтики на стандартных стеклянных пластинках. тщательно Накройте ломтики с вложением среды. Избегайте пузырьков воздуха в вложению среде. Поместите покровное осторожно, чтобы полностью покрыть срез. Высушите слайды в течение ночи перед визуализируя их с помощью микроскопа.
  4. Храните меченные срезы при 4 ° С после визуализации. Полезные приемы по гистохимических процедур в работах. 58,59.
  5. Очистите оборудование, используемое для гистологии и электрофизиологии отдельно. Не следует смешивать гистологию и электрофизиологии оборудование вместе.

7. постфактум Визуализация Biocytin заполненных Нейроны

  1. С помощью конфокальной микроскопии для визуализации морфологии восстанавливаемых нейронов.
    1. Грубо найти флуоресцентно меченого нейрон в срезе с эпифлуоресцентной. Изучить дендритов нейронов и определить местонахождение аксонов и аксонов волдырь (2 - мкм O 4) с использованием объектива 10x или 20x. Документ ход аксона.
    2. Переключиться на конфокальной микроскопии и выбрать лазерный диод 488 нм для возбуждения флуоресцеина, содержащийся в меченого нейроне. Следуйте расширение аксона и дендритов в оси.
    3. Запись последовательные изображения, для того, чтобы получить Z-стек для всей клетки. Отрегулируйте разрешение оси (расстояние между последовательными изображениями) до 0,5 - 1 мкм. Собирают конфокальной образы клеток USINг низкая (цель 10X) и высокой (цель 60X, масло погружения) увеличение.
    4. Откройте файл образа нейроне , полученного с помощью конфокальной микроскопии с программным обеспечением для обработки изображений (ImageJ) 60. Сравните Z-проецируемое изображение с ИК-DGC изображением на глаз , чтобы найти точное положение патч - пипеток в течение электрофизиологические записи (фиг.1, 2А, 3А, 4А, 5А и 5д).
    5. Определение morphometries меченых нейронов: измерение Аксон - сомы расстояния, расстояния между записью пипеток вдоль somatodendritic домена и между дендритной пипеткой и аксона с помощью функции "Измерение" в ImageJ.
    6. Реконструировать некоторые нейроны с NeuronJ (ImageJ), Imaris 29 или Neuromantic 61.

8. Анализ электрофизиологических данных

  1. С помощью пакета программного обеспечения , связанного с усилителем грубо анализировать данные (например, Clampfit) или непосредственнодругое программное обеспечение для анализа данных , таких как Stimfit, программное обеспечение с открытым исходным кодом 62,63 , как и в нашей недавней публикации 13 или, например , WinWCP.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный выше протокол намерен облегчить сбор данных с использованием дендритных записи патч-зажим. Этот метод, в сочетании с постфактум гистохимия, помогает получить представление о механизмах многих электрических сигналов , исходящих или распространяющихся в дендритов. Прямой доступ к дендритов с накладными пипеток трудно, но особое внимание нескольким методологическим аспектам повысит уровень успеха записей. Экспериментатор достаточно опытный в стабильной соматической записи можно ожидать, чтобы получить высокое сопротивление (ГОм) уплотнения и полные эксперименты на большинстве попыток. Один из двух высококачественных дендритных записей могут быть собраны за рассечения.

Наличие высококачественных срезах мозга , содержащих здоровый somata и дендриты является необходимым условием для получения доступа к этим тонкие структуры (рисунок 1). criteriа , для выбора этих нейронов являются гладкими и однородными по всей поверхности клетки и сомы и дендритов с низким контрастом при наблюдении с оптимальными регулировать оптикой (фиг.1А и 1В). Выбор нейроны слишком сильно контрастируют как правило , приводит к нестабильным записей (рис 1С и 1С). Поэтому такие нейроны следует избегать.

По сравнению с другими нейронами, нигральных нейроны DA отображать специфические морфологические и электрофизиологические характеристики. Эти особенности , как правило , оцениваются с помощью одного соматического пипеткой может также наблюдаться в двойном соматической (рисунок 2) и somatodendritic записей (рисунок 3). Длинные инъекции гиперполяризационные тока индукции мембранного потенциала ректификации под названием 'провисания' (рис 2B и 5D). Аксон берет свое начало, в большинстве случаев, на дендритных сайте, как это определенос использованием дополнительных критериев 13,25,26, указывая , что дендритные отсек в этих нейронах гетерогенна (Фигура 3А - 3В). Как следствие, отсек , где наблюдается АР первый соответствует той камере, где аксон выходит (фиг.3С - 3D) 13,25,26. Аксон обычно завершается по аксонов пузырьке , вызванного вырезанию аксона во время нарезка 64, но эта структура не систематически обнаруживается.

Выраженный провеса наблюдается в нигральных нейронов DA последовательных к активации I ч предполагает высокую экспрессию HCN субъединиц. Для того, чтобы определить влияние I ч на интеграции синаптических сигналов, синаптические типа тока (EPSC) сигналы были получены и введены с помощью дендритных записи электрода во время somatodendritic двойной записи 55 (<сильный> Рисунок 4). Кинетика этих моделируемых EPSCs были основаны на времени нарастания и затухания постоянных реальных спонтанных EPSCs. Полученный aEPSP был записан с соматической электродом. Ванна применение блокатора I H ZD 7288 увеличена продолжительность aEPSP, что указывает на вклад I ч до временного хода синаптических сигналов (рис 4б). ZD 7288 упразднены также мембранный потенциал ректификации , подтверждающие , что результаты провисает активации I ч (рис 4в). Результаты , полученные с имитацией ВПСП могут быть коррелированы с экспериментами с использованием электрически навеянные ВПСП 65. Для того, чтобы отобразить точное распределение канала в somatodendritic области DA нейронов, клеточные прикреплены записи были реализованы (рисунок 5). Уплотнение с высоким сопротивлением (>> 1 ГОм) является абсолютной необходимостью для сотовых подключаемых записей (рис 5В сильный>). В дендритов DA нейронов, I ч активизирует медленно с длинными гиперполяризационных ступеней напряжения и тока стационарного состояния достигается после того, как сотни мс (рис 5в), так как ранее было показано 66. Это наблюдение указывает на то, что HCN каналы , выраженные в дендритах нейронов да имеют разные субъединиц по сравнению с теми , в пирамидальных нейронов или других типов клеток 10,16,66. По мере того как распределение канала может быть неоднородным в дендритных отсеке и, как дендритные отсек сам по себе неоднородны, личность дендритов (аксонов фертильного или nonaxon несущих дендритов) выявляется путем сравнения изображения ИК-DGC с конфокальной изображения после того, как biocytin окрашивания (рис 3А и В). Восстановление морфологии клеток, поэтому необходимо для обеих двойных somatodendritic записей и для мобильных подключенных записей через последующие соматическими записи целых клеток.


Рисунок 1. Визуальное сомы и проксимальным дендритов нигральных дофаминергических нейронов с использованием инфракрасного видеомикроскопии. (A) IR-DGC изображение нигральных DA нейроне , показывающий сому и проксимальных дендритов и соматических , так и дендритные пипеток. Двойная somatodendritic запись была успешно выполнена на этом здоровом нейроне. Обратите внимание на низкий контраст и гладкую поверхность по всему somatodendritic области клетки. (В) Другой пример здорового DA нейроне. (С) DA нейрон с шероховатой и неровной поверхностью и более сильного контраста. В то время как двойная запись была получена, стабильность была неоптимальным, а продолжительность записи была короткой (~ 15 мин) в связи с постепенным увеличением сопротивления доступа на обоих пипеток. (D) , второй пример Д. нейроне , показывающий сильно контрастировали сомы и дендритов проксимальный, В этом случае наблюдается сильное увеличение сопротивления доступа вскоре после перерыва в режиме целых клеток. Попытка уменьшить сопротивление доступа отрицательным давлением был неудачным. Нейроны в панели С и D , возможно, были повреждены во время процедуры нарезки и его следует избегать для экспериментов. (E) Одновременный двойной соматическая записи в здоровом DA нейрон в начале записи. (F) То же нейрон , как и в панели Е с опухшие тело клетки после ~ 17 мин. Обратите внимание на полное отсутствие контраста, мяч, как внешний вид сомы и наличие большого ядра , которое не проявляется в здоровых нейронов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-1
Фигура 2. Одновременная Double Соматические Запись с DA Neuron. (A) IR-DGC изображения во время двойного соматической записи с DA нейроне. (B) гиперполяризационные и деполяризующими 1 S длинные инъекции тока (-160 до 80 мкА, прирост 80 Па) и соответствующие изменения напряжения регистрируются одновременно с обоими коммутационными пипеток. Обратите внимание на наличие провисания в трассировке напряжения с длинной гиперполяризационной ступеньки тока и большой после гиперполяризации после AP во время деполяризующей импульса тока. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 3. Dual S omatodendritic Запись в DA Neuron. (A) IR-DGC изображение нейрона DA. Расстояние между дендритов и сомыкрестики пипетка составляет 29 мкм. (B) конфокальной Z-проекции изображение нейрона в панели меченым авидином , конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Нейрон был заполнен biocytin во время записи. Аксон возникла из проксимального дендрита близко к сомы , как указано стрелкой. (С) Одновременный двойной записи somatodendritic напряжения поклеточного от нейрон в панели А. П. , записанной в сомы (следы черного напряжения) и дендритов (красный напряжение следы) в ответ на 1 с длинной текущей операции впрыска через соматические (левый, черный след тока) , а также в качестве альтернативы дендритных пипеткой (справа; красный след тока) (D) соматические и дендритные А.П. , показанные в расширенном масштабе времени.. При любом соматическим или дендритов тока инжекции, соматическая AP (черный) предшествовало дендритных AP (красный). Задержка между точками доступа в этом нейроне составляет 120 мкс и 210 мкс с соматическими и дендритных инъекции тока, соответственно. Задержкибыли измерены при AP половинной максимальной амплитуды во время восходящей фазы AP. AP наблюдается сначала в отсеке рядом с которым Аксон возникает, подтверждая предыдущие наблюдения 25,26. В этом случае дендритные запись производится из аксон-дендрит отсутствуют. Пример записи с аксона фертильного дендритов находится в работе. 13 (в их рис. 1). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 4. Распространение искусственных ВПСП Вдоль оси Somatodendritic Д.А. нейронами. (A) IR-DGC изображение нейрона DA. Расстояние между дендритов и соматической пипеткой составляет 45 мкм. Оба патч - пипеток в режиме цельноклеточная записи ток-зажим. (В) Токзаписанный с дендритной пипеткой в ​​текущем зажимом и используется для создания искусственного ВПСП (сверху). Ток получается путем инжекции EPSC-подобной формы волны (т нарастания = 0,6 мс; т распада = 3 мс; амплитуду = 100 Pa) с помощью дендритных пипетки записи 55. В нижней части , размножают aEPSPs , записанных сомы в условиях управления (черный) и после применения ванны в I ч блокатора ZD7288 (30 мкМ, красный след). Каждая кривая напряжения представляет собой среднее значение 40 отдельных разверток. Обратите внимание на значительное увеличение продолжительности ВПСП в присутствии ZD7288 с указанием вклада I ч к времени хода ВПСП. (C) Напряжение следы , записанные от сомы в контрольных условиях (черный) и после нанесения 30 мкМ ZD 7288 ( красный) в ответ на длинный (30 мкА; 1 с) гиперпол шаг тока. Обратите внимание на отсутствие мембранного потенциала ректификации (SAG) после закупорки I <к югу> ч. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 5. Наличие I ч в дендриты DA Neuron. (A) IR-DGC изображение нейроне DA и пипеткой на проксимальных дендритов. (B) и емкостные токи утечки при 5 мВ команды напряжения в ячейке-прилагается конфигурации. Сопротивление уплотнение было 5 ГОм в этом примере на стадии (в) гиперполяризационные напряжения. (90 мВ; сверху) от мембранного потенциала от 0 мВ вызывало медленно активирующий I H. Тока след переворачивали и оснащен одной показательной функцией , давая постоянную времени Т = 632 мс. (D) Напряжениеответы цельноклеточной записанной сомы (панель A) до 1 с гипер- и деполяризующие импульсы тока (-160 до 120 мкА, 40 приращения Pa). Соматическая записи цельноклеточная была выполнена после записи клеточного прилагается. Обратите внимание на отсутствие точек доступа за счет внеклеточного применения ТТХ и Cd 2+ для подавления спонтанной стрельбы во время клеточного прилагается записи. Эти потенциалзависимыми Na + , Са 2+ и тока блокаторами были добавлены для подавления биотоки. Панели A - D из того же нейроне (E) IR-DIC изображение другого нейрона DA и дендритных пипеткой (F) зависимые от напряжения тока активируется с помощью тестового импульса до 0 мВ от предымпульса 50 мс при -120 мВ.. во внешнем выход патча, вырезанных из проксимального дендрита нейрона в панели E. Холдинг потенциал -80 мВ. Обратите внимание , зависящий от времени инактивация тока. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличеннуюверсия этой фигуры.

вещество г / моль концентрация за 1 л
NaCl 58,443 125 мМ 7,305 г
NaHCO 3 84,007 25 мМ 2,100 г
KCl 74,551 2,5 мМ 0,186 г
NaH 2 PO 4 137.99 1,25 мМ 0,172 г
глюкоза 198,17 25 мМ 4,95 г
MgCl 2 1 М (раствор) 1 мМ 1 мл
CaCl 2 1 М (раствор) 2 мМ 2 мл
Осмолярность: ~ 310 мОсм / л (оптимальный диапазон: 314 - 325 мОсм / л), рН = 7,4

Таблица 1: Искусственная спинномозговую жидкость (ACSF).

вещество г / моль концентрация за 1 л
NaCl 58,443 87 мМ 5,084 г
NaHCO 3 84,007 25 мМ 2,1001 г
KCl 7,551 2,5 мМ 0,18637 г
NaH 2 PO 4 137.99 1,25 мМ 0,17248 г
MgCl 2 1 М (раствор) 7 мМ 7 мл
глюкоза 198,17 10 мМ 1,9817 г
сахарозы 342,29 75 мМ 25,672 г
CaCl 2 1 М (раствор) 0,5 мМ 0,5 мл
Осмолярность: ~ 326 мОсм / л, рН = 7,4

Таблица 2: Сахароза-ACSF подготовить кусочки.

вещество г / моль концентрация для 100 мл
KMeSO 4 150,2 120 мМ 1,8024 г
KCl 74.56 20 мМ 0,14912 г
MgCl 2 1 М (раствор) 2 мМ 200 мкл
Na 2 АТФ 551,1 2 мМ 0,1102 г
Na 2 GTP 523,2 0,5 мМ 0,02661 г
Na 2 -Phosphocreatine 255,1 5 мМ 0,1275 г
EGTA 380,4 0,1 мМ 3.803 мг
Hepes 238,31 10 мМ 0,23831 г
Biocytin 1 мг / мл 0,1 г
Осмолярность: ~ 302 мОсм / л, рН = 7,2 доводили с помощью КОН

Таблица 3: Внутриклеточное решение для двойной записи.

вещество г / моль концентрация для 100мл
KCl 74.56 120 мМ 0,8947 г
CaCl 2 1 М (раствор) 2 мМ 200 мкл
MgCl 2 1 М (раствор) 1 мМ 100 мкл
Hepes 238,31 10 мМ 0,23831
TEA-Cl 165,7 20 мМ 0,3314 г
4-AP 94.11 5 мМ 0,04705 г
BaCl 2 244.26 1 мМ 0,02443 г
CdCl 2 183,32 0,02 мМ 0.3666 мг
ТТХ 1 мМ 200 нМ 20 мкл
Осмолярность: ~ 290 мОсм / л, скорректированный с D-глюкозы (Ref. 16); рН = 7,4

Таблица 4: Электродный раствор для клеточных подключаемых записей.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот отчет описывает протокол шаг за шагом реализовать двойной somatodendritic записи целых клеток и местных дендритных записи. Это полезно для определения влияния ионных каналов (то есть, я з) о времени хода постсинаптических потенциалов и отображение распределения ионного канала (I ч) вдоль somatodendritic области нигральных нейронов DA соответственно. Полученные в результате электрофизиологические измерения объединены , чтобы постфактум гистохимии для восстановления морфологии клеток. Процедура была использована для исследования да нейронов, расположенных в черном веществе, но могут быть обобщены для соседних нигральных нейронов ГАМК, вентральный тегментальной DA нейронов или других нейронов среднего мозга. Все шаги также можно проследить , чтобы исследовать другие ионные каналы , выраженные в дендритах нейронов нигральных без важных изменений. Постфактум визуализация особенно актуально для нейронов с аксона подшипникедендриты, такие как нигральных нейронов гиппокампа, 25,26 Оринс-ALVEUS интернейронов 21 или некоторых СА1 пирамидальных нейронов 67. Интересно отметить , что нейроны , разделяющие эту функцию , как представляется, более распространены , чем обычно считается 67. Морфологический анализ показывает также точное положение электродов и аксона. Обнаружение последнего может быть оптимизировано с помощью мечения белков , экспрессированных в начальном сегменте аксона (напряжения закрытого Na + каналов или анкириновых г) с использованием иммуногистохимии 68,69.

Достоверность данных, собранных с помощью дендритных записей и последующего нейронного маркировки неизменно зависит от качества среза. Максимальное усилие требует поэтому должны применяться для сохранения жизнеспособности клеток в ткани. Это достигается при осторожном обращении здоровых животных, высококачественных инструментов и реагентов, достаточной оксигенации тканей и ледяной температуры на протяжении подготовки срезов, Стабильные условия съемки зависят от выбора здоровых нейронов. В режиме цельноклеточной, последовательное сопротивление должно сначала быть настолько низким, насколько это возможно, и поддерживается постоянной в течение всего эксперимента. Стабильность записи дополнительно зависит от высококачественных манипуляторов, лишенных дрейфа и колебаний. Эти возмущения могут быть уменьшены за счет оптимизации стабильности пипеток: проверка подключения к держателю пипетки и headstage, что контрольный пакет Микроманипулятор кабели слабину, избегая резких изменений температуры или сценического движения и проверки механизма манипулятора. Для двойной записи, метилсульфат 13,15,21 был включен в внутриклеточном растворе, но в качестве альтернативы глюконат 9,14,25 могут быть использованы. Тем не менее, основной анион может привести к изменению мембранного потенциала 70,71 и некоторые зависящие от напряжения тока 72. Внутриклеточных решение может быть дополнена АТФ, ГТФ и фосфокреатина сохранения physioloмиологических функции нейронов. Кроме того, добавление флуоресцентного красителя в растворе пипеткой (например, Alexa 594 или сульфородамин 101 41) для визуализации дендритов во время соматического записи может быть полезно, например , для размещения приложения давления (рисунок 7 в работе. 41) или электрический стимулирующий пипетка. Раствор пипетка для клеточных подключаемых записей содержит высокую концентрацию К + и Na + не запись больших I H. Обращает на себя внимание отношение концентраций Na + / K + влияет на амплитуда тока 10, обратный потенциал тока 11 и стробирование I ч 73. В качестве альтернативы, I ч также могут быть записаны с помощью снаружи аутов 10. В этой конфигурации записи однако, внутриклеточная среда, в непосредственной близости от каналов может быть возмущенных. Следовательно, различия в напряжении-зависимой активации I <к югу> ч наблюдаемый при сравнении токов , полученных с использованием клеточных подключенных заплаты и снаружи аутов 10. Отек нейронов иногда встречается во время записи патч-зажим, и часто возникает из различных причин , таких как низкое качество воды, сильного дисбаланса в осмолярности или рН между внутри- и внеклеточной решения 39 или ошибки в составе решений. Качество Электрофизиологические записи имеет прямое падение на качество морфологии восстановленных нейронов. Высокое сопротивление соматические пипетки используются для двойных записей (6 - 10 МОм, как и в работах 6,11.) , А также для отдельных соматическими записей после клеточных подключаемых записей , чтобы минимизировать разбавление внутриклеточной среды 14. Цельноклеточная соматическая записи следующие записи клеточного прилагается поэтому хранится короткий (<10 мин). Вне-патчи от как соматические и дендритные пипеток имеют важное значение для надлежащего закрытия CELL мембрана и последующее восстановление морфологии клеток. В дополнение к структуре клетки, нейрохимическое содержание может быть определено для зарегистрированных нейронов 59,74. Например, внутриклеточный белок тирозин гидроксилазы может быть immunolabeled для однозначной идентификации DA нейронов 13.

DA нейроны в основном сосредоточены в SN Парс компактов, с гораздо более низкой плотностью , присутствующей в SN Парс геисиЫа, где они перемешаны с большим числом ГАМК нейронов 75. В то время как тело клетки DA нейронов часто больше, чем у ГАМК-нейронов, визуальной идентификации этих клеток с ИК-видеомикроскопии является неопределенным и частично препятствует непрозрачности Парс компактов. Чтобы обойти эти ограничения, предварительный выбор DA нейронов может быть облегчено за счет использования трансгенных мышей , экспрессирующих флуоресцентный маркер в конкретной популяции нейронов (TH 65 или DAT для DA нейронов, ГТРдля ГАМК нейронов) и эпифлуоресцентной освещения. В качестве альтернативы, флуоресцентный краситель, могут быть включены в раствор соматичекой электрода для облегчения визуализации дендритов. Увеличенное разрешение флуоресцентного клетки вносят Nipkow вращающийся диск конфокальной 14,22,30 или двухфотонной микроскопии 7 в сочетании с ИК-6 DGC. Несколько преимуществ связаны с DGC по сравнению с DIC. Во- первых, как ДИК призм не требуется, изображение ИК-DGC могут быть наложены с 49,52,53,76 флуоресцентного изображения. Во- вторых, РСК может быть объединен с фотостимуляцией и оптогенетика 77.

Недостатком препарата ломтика является сохранение целостности нейронов. DA нейроны расширяют свои дендриты в трех пространственных плоскостях 78,79 и поэтому укорочение дендритов отсека не может быть полностью избежать в срезах 80. Выбор ориентации срезов (корональные, горизонтальный или парасагиттальный) является компромиссом. Происхождение иннервации и опытно-конструкторских необходимо учитывать, чтобы выбрать правильную ориентацию срезов.

Прямой дендритных латание это метод, используемый для картирования распределения функциональных ионных каналов в разных отсеках ячеек. Кроме того, этот метод предлагает определить изменчивость функциональных свойств каналов 20. В качестве дополнения расположение и плотность ионных каналов можно определить с помощью иммуногистохимии на уровне 17,23 световой и электронной микроскопии. Этот подход также дает возможность определить плотность каналов в малых калибров структур, которые недоступны для патч-пипеток. Однако эти каналы могут быть в отдельном функциональном состоянии 24 или даже неактивного по сравнению с теми , записанные с использованием методов патч-зажим. Оба метода Поэтому необходимо, чтобы получить полное представление о местоположении и свойствахионных каналов в конкретной сотовой зоне 17. С развитием напряжения чувствительных красителей, визуализация напряжения использовалась для изучения распространения точек доступа и ВПСП в нейронах в нескольких местах 81. В качестве альтернативы двойной записи патч-зажим, этот подход может даже быть реализован для тонких дендритов, которые не доступны для патч-пипеток, но вызывают необходимость точной калибровки сигнала и усреднения.

В то время как DA нейронов в SN и вентральной области покрышки широко исследованы с помощью соматической записей в физиологической и патофизиологической контексте, функциональные свойства их дендритов остается в значительной степени неизвестны в обоих условиях. Заделка от дендритов была реализована для нигральных нейронов допамина несколькими группами с успехом 13,25,26 и остается методом выбора рассекать возбудимых свойств этих тонких субклеточных структур 8. Дендритные записей обеспечивают дальнейшее возщества тщательно исследовать эффективность и пластичность синаптической передачи и пластичности дендритов возбудимости 82,83.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор заявляет , что он не имеет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарю д-ра Винсента Seutin за постоянную поддержку, Кристель Gillissen и Лоран Massotte за отличную техническую помощь, д-ра Жан Defourny и Сандра Ormenese для советов с конфокальной микроскопии, д-р Жак Направляемся за дар второго усилителя Axopatch 200В, Giga-изображений платформой для обмена конфокальной микроскопии и программного обеспечения Imaris и д-р Стивен Фриман для критически чтении рукописи. Эта работа была поддержана грантами от бельгийской FRS - FNRS (U.N002.13 и T.N0015.13) и издана при поддержке Фонда университета бельгийского (Publié АВЭК ле Concours де ла Fondation Университетский де Belgique).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вода двойная дистиллированнаяMilliporeSuper QУдельное сопротивление >14 MΩ см, идеальное 18,2 MΩ см при 25  ° С, фильтрованный (0,22 &; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Микрофильтр свечейRobuPorosity 3, диаметром 6 мм или 13 мм
Тканевый слайсер с виброщупомLeicaVT1200параметры резки: скорость 0,07, амплитуда 1,40
Тканевый слайсерDosakaDTK-1000параметры резки: скорость 4, частота 7
Бритвенные лезвияGiletteSuper Silver
Инструменты для вскрытияBraun, Aesculap
Резервная камераИзготовленные
на заказ полипропиленовые беккерыVWR213-1725400 мл
Шприцевой фильтрMerk MilliporeMillex - GV 0.22 & микро; m
Цианоакрилатный клей UHUSekunden Kleber"жидкий клей
Записывающая камера Луигс и Мини-камераNeumann Slice
Горизонтальный съемник пипетокSutter InstrumentsКоричнево-пламенные пипетки P-97
Hilgenberg18075242 мм наружный диаметр/1 мм стеклянные капилляры, концы отполированы, промыты
Стоматологический воскColtè ne/Whaledent ортодонтическийвосковые полоски
Платиновая сеткадля крепления срезов в записывающей камере, изготовленные на заказ с платиновым диском
MicroforgeNarishigeMF-830для огневой полировки наконечников пипеток
Метилсульфат калияMP Biomedicals215481
биоцитинМолекулярные зондыB1592
МанометрGREISINGER электронныйGDH 13 AN
МикроскопZeissFS
Dodt Gradient ContrastLuigs & Манипуляторы Neumann
Luigs & NeumannLN Mini 25
ФреймграбберИсточник изображения DFG/USB2pro
КамераDAGE-MTINC-70
КонденсаторZeissс высокой числовой апертурой, работающий с маслом
ОбъективZeissW Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR63-кратное увеличение, дальнее расстояние, высокая числовая апертура 1.0 погружение в воду цель
Четырехкратный чейнджерLuigs & Нейманмежду камерой и микроскопом
Черно-белый видеомониторSonySSM-175CE16-дюймовый, 850 ТВ, аналоговые
образцы бутылок, янтарное стекло, с колпачкомVWR215-2409для переноса срезов из установки в гистологический кабинет
Руководство AxonМолекулярные устройстваКнига
Stimfithttps://github.com/neurodroid/stimfitАнализ электрофизиологических данных
параформальдегидаSigma441244см. в ПАСПОРТЕ БЕЗОПАСНОСТИ и Директиве по опасным веществам (ЕС) перед применением
Well cell culture plateGreiner-Bio-One662160для окрашивания фиксированных срезов
Triton X-100Merk108643см. ПАСПОРТ БЕЗОПАСНОСТИ и Директиву по опасным веществам (ЕС) перед применением
мышиный анти-TH моноклональный первичныйImmunostar22941рабочая концентрация: 1/1,000
козье антимышиное вторичное антитело - Alexa Fluor 568Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-11031рабочая концентрация: 1/500
нормальной козьей сывороткиDakoX0907
ProLong Diamond AntifadeMolecular Probes - Thermo Fisher ScientificP36961
Флуоресцеин Avidin DCSVector LabA-2011
Конфокальный микроскопOlympusFV1000
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/
плагин NeuronJhttp://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/для ImageJ
Imarishttp://www.bitplane.comРеконструкция биоцитиновых заполненных нейронов
Нейромантическаяhttp://www.reading.ac.uk/neuromantic/Реконструкция биоцитин-наполненных нейронов
WinWCPhttp://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htmАнализ электрофизиологических данных
"

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  2. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  3. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
  4. Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
  5. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
  6. Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
  7. Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93(2015).
  8. Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
  9. Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
  10. Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
  11. Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  12. Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
  13. Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
  14. Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
  15. Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
  16. Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
  17. Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
  18. Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
  19. Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
  20. Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
  21. Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
  22. Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
  23. Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
  24. Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
  25. Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
  26. Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
  27. Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
  28. Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
  29. Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
  30. Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
  31. Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
  32. Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
  33. Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
  34. Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
  35. Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
  36. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  37. Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
  38. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  39. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
  40. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  41. Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
  42. Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
  43. Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50(2011).
  44. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
  45. Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
  46. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
  47. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  48. Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
  49. Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
  50. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  51. Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
  52. Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
  53. Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
  54. Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
  55. Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
  56. van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
  57. Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  58. Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  59. Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
  60. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  61. Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4(2012).
  62. Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
  63. Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
  64. Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
  65. Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
  66. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  67. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
  68. Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
  69. Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
  70. Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
  71. Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
  72. Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
  73. Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
  74. Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  75. Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  76. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
  77. Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
  78. Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
  79. Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
  80. van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54(2014).
  81. Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
  82. Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
  83. Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

post hocZ

Похожие статьи