Методическая статья

Роботизированная Дозирование Техника для ориентации поверхности и Bioprinting клеток

DOI:

10.3791/54604

⸱

18 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает методологию биопечати с использованием автоматизированной роботизированной системы осаждения, которая включает в себя вытравленные топографические подсказки с прецизионным осаждением клетки, содержащей гидрогелевые биочернила. Напечатанные элементы доставляются непосредственно к вытравленным элементам и способны воспринимать и ориентироваться с их помощью.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает введение функций клеток наведения с последующей прямой доставки клеток к этим функциям в гидрогеле bioink с использованием автоматизированной роботизированной системы дозирования. Частности bioink был выбран, поскольку это позволяет клеткам оседать в сторону и почувствовать особенности. Система дозирования bioprints жизнеспособных клеток в гидрогелевых bioinks используя противодавлении помощь печатающей головки. Тем не менее, путем замены печатающей головки с заостренным пером или скальпель, система дозирования может также быть использован для создания топографические сигналы путем травления поверхности. Движение стилуса может быть запрограммирован с шагом 10 мкм в X, Y и Z.. Узорчатые канавки были способны сориентировать мезенхимальные стволовые клетки, влияя на их принять удлиненную морфологию в соответствие с направлением канавок. Структурирование может быть разработан с использованием построения программного обеспечения в прямых линий, концентрических кругов и синусоидальных волн. В последующей процедуре, фиброзноВзрывы и мезенхимальные стволовые клетки суспендировали в 2% желатина bioink, для bioprinting в противодавления приводом экструзионной головки. Клетка подшипник bioink затем распечатаны с использованием тех же запрограммированным координаты, используемые для травления. В bioprinted клетки были способны воспринимать и реагировать на протравленных черты, как продемонстрировано их удлиненным ориентации вдоль направления протравленных канавок.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Преднамеренное структурирование размещения клеток способствует формированию культур , которые имитируют в естественных условиях клеточной организации 1. Действительно, исследование взаимодействия между несколькими типами клеток может быть оказана помощь путем организации их пространственного размещения 2,3. Большинство систем паттерна полагаются на процедуры модификации поверхности для содействия или предотвращения адгезии клеток с последующим пассивным осаждением клеток. Bioprinting предлагает пространственную и временную контроль над распределений клеток 1. В дополнение к этим функциям, bioprinting был описан как технически простой, быстрый и экономически эффективный способ для формирования геометрически сложных строительных лесов 4. Он использует разработки программного обеспечения компьютера и позволяет введение клеток в процессе изготовления 4.

Системы Bioprinting были отнесены к категории основаны на их принципах работы как лазер на основе, для струйной печати на основе или экструзии на основе 4, Экструзионная bioprinting был описан как наиболее перспективным , поскольку оно позволяет изготовление организованных конструкций клинически значимых размеров в реалистичные сроки 4-6. Она выполняется либо механическим или обратного давления при содействии экструзии гидрогеля bioink клеток подшипника. В способе, представленном здесь, использовали обратное давление. Как уже упоминалось, клетки доставляются в cytocompatible bioink. Такой bioink должна поддерживать доставку клеток , не вызывая вредного напряжения сдвига, и иметь достаточную вязкость , чтобы сохранить целостность печатного следа, без разрушения или распространения (упоминаемый как "чернила просачиваться") 7-10.

Взаимодействие клеток с их липкого поверхности, как известно, влияют на клеточное поведение. Рельеф поверхности может контролировать форму клеток, ориентации 11, и даже фенотип. В частности, изготовление пазов и каналов было продемонстрировано, чтобы побудитьрастянутая, удлиненная морфология на нескольких типах клеток. Применение данной морфологии было обнаружено, что влияние на фенотип мультипотентных и плюрипотентных клеток. Например, при выравнивании по канавкам, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , показывают доказательства дифференциации по отношению к кардиомиоцитов 12,13 и клеток гладкой мускулатуры сосудов принимают сократительную фенотип над синтетическим 10,14-17.

Клетка совместив каналы или канавки могут быть сформированы на полимерной поверхности с помощью ряда способов, например, глубоко реактивное ионное травление, литография электронный луч, прямой лазерной печати, фемтосекундного лазерного, фотолитографии и плазменного сухого травления 18. Эти подходы часто отнимает много времени, требует сложной аппаратуры и может быть ограничение в виде узора генерируемой. Кроме того, они не синхронизируются с bioprinting кучность и не позволяют к немедленному cellularization. Координационно контролируемое движение автоматизированнойсистема дозирования может следовать сложные шаблоны для осаждения растворов. Здесь показано, как движение микромасштабная под контролем может быть использована для создания каналов для клеточной ориентации. Заостренную стилус или скальпель прикреплен к печатающей головке вместо экструзионной шприца и оборудование может затем протравить поверхность полимера под руководством программного обеспечения черчения. Метод обеспечивает универсальность в конструкции картины и применима к полимерным материалам, обычно используемых в биоинженерии, таких как полистирол, PTFE, и поликапролактон. В качестве следующей стадии к травлению, клетки могут быть bioprinted непосредственно к поцарапанном канавками. Желатин bioink используется здесь был в состоянии поддерживать как след и позволяют осажденные клетки ощутить Протравленная черты. Мезенхимальные стволовые клетки bioprinted к протравленных канавок были продемонстрированы удлиняться вдоль них в различных линиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Этот протокол описывает использование вспомогательной роботизированный дозирующей системы (рис 1А) в обратном давлении в качестве поверхностного травления (рис 1б) и на основе экструзионной bioprinter (рисунок 1C) 10.

1. Модификация поверхности Полистирол

  1. Используйте 1 мм Листы из полистирола, так как культуры полистирола ткани пластины, как правило, носовое вверх в центре, разрушая согласованность высоты обоих травления и печати.
    Примечание: В качестве полистирольные листы не модифицированы для клеточной адгезии, плазменная обработка проводится.
  2. Кислородная плазменная обработка.
    1. Во-первых, выберите давление 2 бара на регулятора кислородного баллона, соединенного с плазменной машиной. Затем включите плазменную машину и введите следующие условия в панель управления аппарата: 150 Вт, 30 SSCM кислорода, 10 мин (для мощности, расхода газа и времени соответственно).
    2. Поместите полистирол substratе в плазменную камеру, запечатать дверь и нажать кнопку запуска на панели управления. Замачивание кислородной плазмы обрабатывают полистирольный субстрат в эмбриональной телячьей сывороткой и инкубировать при 37 ° С в течение 2 часов, прежде чем трехкратной промывки 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).

2. Программирование печати Шаблоны

  1. Используйте программу для первой протравливания поверхности с помощью стилуса или скальпелем.
    1. При использовании стилуса, вставьте диаметр 1,5 мм текстильную иглу (с внутренней стороны с большой осторожностью) в сопло дозирующего шприца (5 или 10 мл), пока она не станет вклинивается и обеспеченным. При использовании скальпель, выбрать круглый обработан скальпелем так, что он может быть закреплен в механизм зажима печатного рычага.
      Примечание: Стилус травит изогнутые модели лучше, чем скальпелем.
    2. При первой попытке создать bioprinted расположение, эскиз желаемого рисунка на миллиметровой бумаге с пронумерованными осей для генерации координат XY. Затем яNput координаты травленым / bioprinted шаблон в программное обеспечение электронной таблицы (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: "желаемая картина" может быть во многих формах, таких как линейные, S-образной или круговой. Выбор зависит от экспериментальной модели требуется, например, параллельных линейных линий для дифференциации MSCs к кардиомиоцитов, как показано здесь. Функция рассеяния график позволяет визуализировать предложенного шаблона участка.
    3. Откройте для печати / раздаточного программного обеспечения. Выберите "Program> Добавить программу", а затем "Edit> Add Point", чтобы установить программу. Экспорт х и у значения координат, полученные из электронной таблицы в печати / выдачи программного обеспечения с помощью "Копировать и Вставить" функцию.
    4. Откалибруйте "Z" Высота робота перед каждым запуском, чтобы поместить наконечник пера / печати на поверхность.
      1. В печати / раздаточного программного обеспечения, выберите опцию "робот", нажмите на "Изменение режима &# 34; и включить опцию "Учебный режим". После того, как выбран, программное обеспечение позволяет функции "Jog" робота.
      2. Колесика, сначала инициализировать робота позицию по умолчанию, выбрав следующие команды из меню; "Робот> Мека Initialize", затем выберите "Robot> Jog". Входные числовые значения (в мм) в "слоты X и Y", необходимых для размещения стилуса точно о происхождении картины.
      3. Затем введите числовое значение (в мм) в "Z слота" для размещения стилуса или печати сопла в контакте с поверхностью, но не прогибается или выравнивать поверхность. Эта точка обозначается как "Z" начального значения.
        Примечание: Глубина каждой канавки может изменяться без труда с использованием Z-высоту системы. Пазы 40, 80, и 170 мкм продемонстрированы , чтобы разрезать на поверхности толщиной 1 мм Листы из полистирола (рисунок 4 и таблица 1).
    5. Выберите ринструкция ечать для каждой из точек координат, то есть "начало строки Разлить" , чтобы определить первую точку и начало печати, "линия , проходящая" для обозначения промежуточных точек и "Конец строки Разлить" , чтобы сигнал к роботу , чтобы прекратить действие тираж.
    6. Связь программы с роботом, выбрав команды следуют из верхней панели меню: "Robot> Отправить C & T Data".
    7. Инициировать травления / тираж, путем изменения робота в режим "Run". Сделайте это, выбрав "Robot> Изменение режима> Включить режим Run" из верхней панели меню.
    8. Запустите процедуру печати, нажав на кнопку "Старт" зеленый на консоли робота диспенсера.

3. Подготовка и печать Cell-содержащих Желатин Bioink

  1. Растворить 2% желатина в минимальной основной среде альфа-среде (αMEM) (с добавлением 10% FBS и 2% антибиотик / antimycotIC) при 60 ° С в течение 2 часов для получения bioink решения.
  2. Предварительная культура Красный флуоресцентный белок выражения мезенхимальные стволовые клетки (RFP-MSCs) до 70% слияния в 10 см чашки для культивирования тканей с использованием αMEM / 10% FBS. Освободить прикрепленные клетки в суспензии путем удаления среды и покрытие с 1х раствором трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С.
  3. Гранул клетки центрифугированием при 1000 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 0,5 мл 1x PBS и подсчитывают плотность клеток с помощью гемоцитометра.
  4. Дав bioink остыть до комнатной температуры, осторожно перемешать в достаточном объеме к суспензии RFP-ПКЦ в bioink для достижения конечной концентрации 5 × 10 6 кл мл -1.
  5. Залить ячейку подшипника bioink в печатный шприц с насадкой запечатанной. Холод загруженный шприц до 4 ° C для достижения для печати вязкости.
  6. Поместите загруженный шприц на автоматизированномроботизированная система дозирования и приложите линии давления воздуха. Удалите шприц Luer уплотнение и прикрепить сопло печати.
  7. Выдавливание cellularized bioinks в тонких линий с использованием 0,05 МПа обратного давления на 5 мм / сек Скорость записи от 10 мл шприца через 27 G иглы / сопла (конические рекомендуется над цилиндрической) на поверхности полистирола пленки, после предварительно запрограммированным осаждения шаблон, описанный в шаге 2.1, чтобы поместить cellularized bioink на предварительно протравленных канавок.
  8. После 1 ч инкубации при комнатной температуре, добавляют 10 мл питательной среды (с добавлением 10% FBS и антибиотиками) и инкубировать клетки в течение 24 часов (чтобы позволить клеткам ощущать и реагировать на протравленных признаки), перед просмотром с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа при 10-кратным увеличением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представительные результаты показывают , что противодавление помощь роботизированная система дозирования может быть использован в качестве экструзионного основе bioprinter для выполнения как травление поверхности и bioink печать (Рисунок 1). Он может быть использован для генерирования протравленных канавок на поверхности полимера, а затем напечатать клетки , несущей bioink непосредственно на особенности (Рисунок 1 В и С).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важным шагом этой процедуры является фактическая поставка bioprinting стволовых клеток, поскольку процесс должен позволять оседания клеток с признаками, печать без bioink распространения / кровотечение, доставляют клетки без сдвига смерти стресс клеток и не вызывают дифференциацию по отношению к нежелательной линии.

Если ожидаемое выравнивание ячейки не происходит, то вязкость bioink должны быть оценены на предмет его пригодности для печати. Важно, что bioink позволяет клеткам оседать на узо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа, представленная здесь, поддерживается Национальным исследовательским фондом Сингапура в рамках программы CREATE (NRF-Technion): Инициатива регенеративной медицины в исследовательской программе кардиологической восстановительной терапии и финансированием государственного сектора (PSF) 2012 года от Совета по научным и инженерным исследованиям (SERC) при Агентстве по науке, технологиям и исследованиям (A*STAR).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equipment
Robotic Dispensing SystemJanome2300N
Плазменная машинаFemto ScienceCovance
USB Микроскоп
Оптический микроскопOlympusIX71
Название CompanyНомер в каталоге>Комментарии
>Software
Excel
Программное обеспечение для координации печатиJanomeJR C-points
Imaging SoftwareНациональные институты здравоохранения (NIH)ImageJ
Название<strong>CompanyКаталожный номерКомментарии
Оборудование
Стилус (Лезвие)OLFAAK-5
5 мл печатный шприцSan-ei TechSH10LL-B
30 G игла для печатиSan-ei TechSH30-0,25-B
1Приобретена
Фетальная бычья сывороткаInvitrogen 10270-098
Фосфатно-солевой буферный желатинInvitrogen
Желатин из свиной кожи, Сила геля 300, Тип АSigma Aldrich9000-70-8
&альфа; MEMInvitrogen41061-029
Antibiotc антимикотикSigma AldrichA5955-100ML
Красный флуоресцентный белок мезенхимальных стволовых клеток (RFP-MSCs)Cyagen Biosciences IncorporationRASMX-01201
Spreadsheet мм листы полистирола на месте

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, Z., et al. Cell and Organ Printing. Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P. , Springer. Netherlands. 137-159 (2010).
  2. Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
  3. Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
  4. Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 123-152 (2015).
  5. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  6. Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  7. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  8. Skardal, A. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 1-17 (2015).
  9. Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16(2015).
  10. Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
  11. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
  12. Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
  13. Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
  14. Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
  15. Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
  16. Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
  17. Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089(2014).
  18. Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
  19. Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
  20. Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
  21. Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
  22. Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
  23. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  24. Merceron, T. K., Murphy, S. V. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 249-270 (2015).
  25. Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 229-248 (2015).
  26. Lee, K. V., et al. Bioprinting in Regenerative Medicine. Turksen, K. , Springer International Publishing. 33-66 (2015).
  27. Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
  28. Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
  29. Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
  30. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
  31. Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041(2014).
  32. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  33. Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
  34. Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109(2014).
  35. Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
  36. Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105(2014).
  37. Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels - The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи