генотипирование<em&gt; Стафилококк</em&gt; рибосомальным Spacer ПЦР (RS-PCR)

Краткое содержание

Здесь рибосомный спейсер ПЦР (РС-ПЦР) используется вместе с миниатюрной системой электрофореза в качестве быстрого метода генотипирования S. aureus с высоким разрешением при умеренных затратах, что обеспечивает высокую пропускную способность.

Аннотация

Рибосомный спейсер ПЦР (РС-ПЦР) - это метод генотипирования S. aureus с высоким разрешением, который обеспечивает высокую производительность при умеренных затратах и, следовательно, подходит для использования в рутинных целях. Для достижения наилучшего разрешения, оценки и управления данными требуется миниатюрная система электрофореза. Вместе с такой системой электрофореза и программным обеспечением собственной разработки (в свободном доступе здесь) присвоение рисунка полос генотипу стандартизировано и является простым. Экстракция ДНК проста (подготовка к кипячению), реакции легко настроить, и их можно запустить на любой стандартной ПЦР-машине. Цикличность ПЦР распространена, за исключением длительного времени нарастания и удлинения. По сравнению со спа-типированием и мультилокусным секвенированием (MLST), РС-ПЦР не требует секвенирования ДНК, что значительно упрощает анализ и обеспечивает высокую производительность. Кроме того, разрешающая способность для штаммов S. aureus у крупного рогатого скота по меньшей мере так же хороша, как у спа-типирования, и лучше, чем у MLST или гель-электрофорез с импульсным полем (PFGE). База данных РС-ПЦР в настоящее время включает в себя в общей сложности 141 генотип и вариант. Метод в значительной степени связан с моделью генов вирулентности, контагиозностью и патогенностью штаммов S. aureus, участвующих в мастите крупного рогатого скота. S. aureus с генотипом B (GTB) заразен и вызывает проблемы в стадах, что приводит к большим затратам в Швейцарии и других европейских странах. Все остальные генотипы, наблюдаемые в Швейцарии, заражают отдельных коров и четвертинников. Генотипирование с помощью RS-ПЦР позволяет надежно прогнозировать эпидемиологический и патогенетический потенциал S. aureus, участвующего в внутримаммарной инфекции крупного рогатого скота (ИМИ), двух ключевых факторах для клинической ветеринарии. Благодаря этим полезным свойствам, а также умеренной стоимости и высокой пропускной способности, целью данной публикации является предоставление подробного, пошагового протокола для упрощения создания и проведения RS-ПЦР для генотипирования S. aureus в других лабораториях.

Введение

Стафилококк (S. стафилококк) известен как самый важный патоген во всем мире , ответственного за интрамаммарной инфекции (IMI) у крупного рогатого скота ^1. Исследование , проведенное Fournier и соавт. ² продемонстрировано в швейцарских коров и исследованиях Cosandey и др. ³ и Boss и др. ⁴ у коров 12 европейских стран , что С. стафилококк , выделенной из бычьих ИМИ представляет собой генетически гетерогенную группу. С помощью ПЦР - амплификации межгенном спейсерной области 16S-23S рРНК (RS-PCR), в общей сложности 17 генотипами были первоначально обнаружены в 101 эпидемиологически независимых изолятов ^2. Генотип В и генотипа С (КТЗ) были наиболее распространенным (80%), в то время как остальные 15 генотипов (ГСТ) происходили редко, каждый из которых вносит 1 до 4% от всех изолятов. На европейском уровне ^3, GTB, GTC, ГТФ, GTI и GTR были самыми важными генотипы , содержащие 76% всех анализируемых штаммов (n = 456). GTB был расположен в центральной части Европы, шhereas другие генотипы были широко распространены. Остальные 24% штаммов включали 41 генотипов, многие из них, однако, наблюдались только один раз.

В работах Fournier и соавт. ^2, Cosandey и др. , ^3, и Грабером и др. ⁵ дополнительно показано , что генотипы были высоко связаны с их рисунком генов вирулентности, а также на швейцарцев , как на европейском уровне. Исследования дополнительно выявил массовые различия в распространенности среди IMI S. стафилококк GTB, GTC и другие генотипы ^2,5: учитывая GTB, до 87% коров в стаде были заражены этим генотипом. В случае GTC и других генотипов, однако, IMI был только найден в 1 до 2 коров стада.

IMI , вызванные S. стафилококк, как правило , приводит к воспалению соответствующих молочных желез и увеличение воспалительных клеток в молоке. Как следствие, соматической клетки совместноунц в молоке (SCC), основным показателем качества молока в большинстве стран, увеличивается, приводящий к снижению цен на молоко или даже доставки остановки.

Кроме того, RS-PCR из Fournier и др. ^2, другие методы типирования были описаны для подтипов бычьим штаммам S. из стафилококк ^8-11. Два наиболее часто встречающиеся из них включают спа набрав ¹² и мульти Locus последовательность ввода (MLST) ^13. Первый из них основан на секвенирование ДНК переменной спейсерной области стафилококкового гена Spa кодирующего белок А, тогда как последний из них требует секвенирование 7 генов домашнего хозяйства. Это означает , что один ¹² и семь ДЗП ^13, соответственно, должны быть выполнены, с последующей очисткой ампликона, реакции секвенирования и анализа с использованием специального оборудования. По сравнению с RS-PCR, эти методы требуют значительных дополнительных усилий в лабораторных условиях, что приводит к низкой пропускной способности образца и высокой стоимостью.пропускная способность особенно низка для PFGE. Принимая во внимание решение этих методов для бычьих штаммов S. стафилококк, RS-PCR, по крайней мере так же хорошо , как спа , набрав ⁴ и лучше , чем MLST ⁴ или PFGE ^15.

Все эти методы , включая бинарного ввода ¹³ продемонстрировали свою эффективность в получении дальнейшее понимание патогенеза крупного рогатого скота IMI , вызванного S. стафилококк, но из - за указанных ограничений они менее подходят для крупных клинических исследований. Кроме того, с помощью генотипирования RS-PCR , как описано Fournier и др. ² позволяет надежно предсказывать эпидемиологические и патогенного потенциала S. стафилококк участвует в коровьем IMI, два ключевых значения в клинической ветеринарной медицины.

Протокол

1. стафилококк изоляты

1. Спред 10 мкл S. Исходную культуру стафилококка или одной колонии выращивают на селективной среде на чашках с агаром Columbia , содержащей 5% овечьей крови (BA).
2. Выдержите аэробно при температуре 37 ° С в течение 18 часов до 24 часов.

2. ДНК-экстракции

1. Готовят ТЕЛ буфера , содержащего 10 мМ Трис-HCl и 10 мМ Na ₂ EDTA, рН 8,5. Подготовка аликвоты и автоклаве при 121 ° С в течение 15 мин.
2. Соберите 1 колонию от БА с помощью стерильной пластиковой петли или стерильную деревянную кирку зуба и ресуспендируют в 100 мкл TEL. Используйте 1,5 мл пробирки с винтовыми крышками.
3. Инкубируют при 95 ° С в течение 10 мин. Затем поместите образцы сразу на мокром льду.
4. Развести образцов 1: 100 в H ₂ O , подходящей для ПЦР (= ДНК - матрицы для ПЦР). В неразбавленной и разведенные образцы можно хранить при -20 ° С в течение 1 месяца.

3. RS-PCR

1. Для каждого образца пипеткой в ПЦР - пробирку 1,5 мкл H ₂ O, 12,5 мкл Taq Master Mix, 2 мкл G1 праймер 10 мкМ, 2 мкл L1 праймера 10 мкМ, и 7 мкл матричной ДНК , что соответствует приблизительно 30 нг чистого ДНК - ^2.
2. Выполните следующую программу велосипедный в стандартной ПЦР-амплификатора: 15 мин 95 ° С, а затем 27 циклов, включающих 94 ° С в течение 1 мин, а затем 2 мин рампе и отжига при температуре 55 ° С в течение 7 мин. Еще через 2 мин рампе, продлить при 72 ° С в течение 2 мин. Terminate ПЦР конечным удлинением при 72 ° С в течение 10 мин с последующим охлаждением до 4 ° С.
   Примечание: ПЦР-продукты можно хранить при -20 ° С в течение 5 дней.
3. Для каждого запуска RS-PCR включают положительный контроль, т.е. образец с известным генотипом (обычно GTB), и отрицательный контроль (H ₂ O).

4. Электрофорез

1. Использование коммерческих миниатюрного набор для электрофореза ДНК (MED комплект) вместес Bioanalyzer, подключенного к ПК и установленного программного обеспечения. Внимательно изучите соответствующие инструкции изготовителя.
2. Установите чип заливную станцию ​​и отрегулировать шприц клип в соответствии с инструкцией изготовителя.
3. Приготовить смесь гель-краситель в соответствии с инструкцией изготовителя.
4. Загрузка смеси гель-краситель (в соответствии с инструкцией изготовителя).
   1. Равновесие смесь гель-краситель комнатной температуре в течение 30 мин перед использованием.
   2. Поместите новый чип ДНК на чипе заливочной станции. Пипетка 9 мкл гель-красителя в отчетливой G.
   3. Убедитесь, что поршень расположен в 1 мл, а затем закройте чип заливную станции. Нажмите плунжер до тех пор, пока удерживается шприцем клипа. Подождите, ровно на 30 секунд, затем отпустите шприц клип.
   4. Подождите в течение 5 сек. Медленно потяните поршень 1 мл положение.
   5. Открытый чип грунтование станция и пипетка 9 мкл гель-красителя в обеих скважинах отмечены 'G'.
5. Загрузка Marker
   1. Пипетировать 5 мкл маркера во всех 12 образцов скважин и в лестнице хорошо. Не оставляйте какие-либо из этих 13 скважин пустые.
6. Загрузка лестницы и образцов.
   1. Пипетка 1 мкл лестницы ДНК к хорошо со знаком лестницы.
   2. Пипетка 1 мкл образца (использованные лунки) или 1 мкл деионизованной воды (неиспользуемых скважин).
   3. Поместите фишку горизонтально в штекере и в вихре в течение 1 мин при 2400 оборотах в минуту.
   4. Запустите чип в Bioanalyzer в течение 5 мин.
7. Выполнение анализа
   1. Запустите Bioanalyzer и подключенный компьютер. Откройте программное обеспечение.
   2. Откройте крышку Bioanalyzer и поместите чип в держатель чип (чип подходит только один путь). Осторожно закрыть крышку.
   3. В контексте инструментов программного обеспечения выберите "Электрофорез"> "дц"> "ДНК - 7500". Принять текущего префикса файла программного обеспечения или изменить его.
   4. Нажмите кнопку Пуск, присутствующей в программном обеспечении. Введите имена образцов в программном обеспечении. Когда чип запуска закончена (примерно через 30 мин) Конец Run сообщения появляется в программном обеспечении Bioanalyzer.
   5. Извлеките чип и очистить электроды Bioanalyzer в соответствии с инструкциями изготовителя.

5. Выведение генотипа из профиля электрофорез

1. Загрузите программное обеспечение Mahal (программное обеспечение находится в свободном доступе у авторов).
2. Импорт справочных данных в программное обеспечение Mahal: "Файл"> "Импорт справочных данных"
3. Откройте электрофорез работать в контексте данных программного обеспечения Bioanalyzer. Выберите профиль электрофореза одного образца.
4. Проверьте наличие соответствующих пиков.
   1. Используйте программное обеспечение Mahal, чтобы проверить наличие соответствующих пиков: "Инструменты"> "средняя флуоресценция". Вставьте в поле "флуоресцентный"значения флуоресценции обозначены как единицы флуоресценции (FU), поскольку они могут быть считаны с помощью программного обеспечения Bioanalyzer. Вставьте 4 (3) пики с самой высокой флуоресценции в порядке возрастания и разделены запятой. Пример: 126130132137.
      Примечание: Если не все из этих пиков ФУ обозначены программным обеспечением Bioanalyzer, они должны быть оценены, читая их из сюжета.
5. Нажмите кнопку "Рассчитать". Пик имеет значение, если наблюдаемая флуоресценция превышает значение, указанное в поле "минимальная высота пика".
6. Infer генотип.
   1. Вставьте в Mahal текстовом поле "Input Пикс (BP)" размеры в п.н. всех соответствующих пиков в порядке возрастания и разделены запятой. Пример: 440.462.519.579.637.
      Примечание: Если не все из этих пиковых размеров указаны программным обеспечением Bioanalyzer, они должны быть оценены, читая их из сюжета.
7. Нажмите кнопку "Рассчитать".
8. В спискеокно, обратите внимание на минимальный квадрат расстояния Махаланобиса "D2m". Если соответствующее значение Р право на это ≥0.05 то вероятность ≥5% , что нулевая гипотеза Н ₀ отвергается (Н _0: наблюдаемый и опорный профиль идентичны) , что означает , что наблюдаемый профиль принято быть идентичным опорный профиль указанного генотипа.
9. Если D2m минимальна , но поле соответствующее значение P пусто, отвергают H ₀ с вероятностью <5%.
   Примечание: Это означает, что профили неравны хотя D2m минимальна. Такой результат может быть результатом без усредненных условий электрофореза.
   1. Для коррекции этих отклонений, вставьте в текстовое поле "Наблюдаемый пик (п.н.)" значение 395 и нажмите кнопку "Рассчитать". Проверьте еще раз для минимального D2m и соответствующее значение P ≥0.05. Если не удается, попробуйте значения 405, 415, и 425.
      Примечание: Иногда небольшие шаги дажеуказали. Если до сих пор не увенчались успехом, наблюдаемый профиль не присутствует в стандартных справочных данных, это может быть новый генотип или вариант.
10. Различные профили
    1. Повторите шаги 5.6 до 5.9 для каждого профиля отдельно электрофорез.

Результаты

Определение генотипа и его варианты

Электрофоретический профиль отличаясь более чем в одной группе из всех идентифицированных генотипов рассматривается как нового генотипа. Новые генотипы названы и расширены в соответствии с Fournier и др. ⁵ , ведущие к генотипов GTA ГТЦ, с последующим генотипов GTAA к GTAZ и GTBA к GTBZ и GTCA к GTCC в настоящее время . Изменение только в одной полосе рассматривается как г...

Обсуждение

Самый важный шаг всей процедуры, когда есть избыток ДНК в RS-PCR (> 30 нг чистой ДНК / анализа) ^2. В общем, разрешение профиля является оптимальным, если все его пиков начинаются и заканчиваются в базовой линии. Если два пика слишком близко друг к другу, резолюция является неполной. В этих условиях, программное обеспечение Bioanalyzer может привести к неадекватной идентификации пика, так что требуется ручная идентификация.

Все явно разделены и соответствующие пики, выраженные в...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трис(гидроксиметил)-аминометан	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 г/моль
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 г/моль; Вещество эквивалентно Na2EDTA· 2H2O
Соляная кислота 5 моль/л Merck		1.09911.0001
Колумбийский агар + 5% овечья кровь	bioMé rieux	43049
Agilent DNA7500 Комплект	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Биоанализатор	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 экспертное программное обеспечение	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'