Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Интранальная инъекция Escherichia coli В крысиной модели пиелонефрита

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54649

⸱

18 июля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Case Western Reserve University, 3Department of Urology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи описывается хирургическая модель пиелонефрита на крысах с использованием прямого внутрипочечного заражения Escherichia coli в почечную лоханку. Экспериментальная процедура может быть использована для изучения патогенеза пиелонефрита, а также связанного с ним воспаления и фиброза.

Аннотация

Пиелонефрит - это бактериальная инфекция почек, которая чаще всего вызывается кишечной палочкой. Рецидивирующие инфекции могут вызвать значительное воспаление почек и фиброз, что в конечном итоге приводит к снижению функции почек. Прежде чем можно будет начать улучшенное клиническое лечение и профилактику пиелонефрита, необходимо создать надежную модель на животных для изучения механизмов прогрессирования, рецидива и терапевтической эффективности. Модель трансуретральной инфекции близко имитирует пиелонефрит человека, но демонстрирует значительные вариации из-за ее зависимости от уретрального рефлюкса для транспортировки бактерий в почки. В настоящем документе представлен подробный хирургический протокол для выполнения бактериальных инъекций в почечную лоханку крысы, который подтверждается неинвазивной магнитно-резонансной томографией (МРТ). Используя этот протокол, животные получают прямой контакт с желаемой концентрацией бактерий E. coli и могут полностью восстановиться после хирургической процедуры при адекватном послеоперационном уходе. Это облегчает последующую продольную МРТ-оценку экспериментальных моделей на животных для сравнения с физиологическим раствором (фиктивным) контролем. При использовании этого подхода прямой доставки тяжесть инфекции контролируется и применима для механистических исследований прогрессирования, а также для разработки новых стратегий лечения.

Введение

Модели грызунов использовались для изучения многочисленных проявлений заболеваний человека, включая пиелонефрит и инфекции мочевых путей (ИМП). ИМП являются глобальной проблемой здравоохранения и могут влиять на детей, мужчин и женщин всех возрастов. 1 , 2 , 3. Первоначальное проявление ИМП включает цистит, и если инфекция поднимается вдоль мочеточника, может появиться инфекция почек (пиелонефрит). В то же время распространенность диабета приближается к 400 миллионам человек во всем мире. 4 , 5 Важно отметить, что заболеваемость УТИ может быть в 4 раза выше у пациентов с ожирением или сахарным диабетом 2-го типа, что приводит к увеличению риска рецидивирующей инфекции ИМП (rUTI), сепсиса, почечного фиброза от пиелонефрита и дисфункции мочевого пузыря. 6 , 7 , 8 ГрызунМодели играют важную роль в изучении ИМП, поскольку современные антибактериальные терапии производят устойчивый профилактический ответ только в подгруппе пациентов с ИМП. Для улучшения клинического ухода за УТИ основными задачами являются понимание механизма rUTI и его патофизиологических процессов от острой инфекции до воспаления до фиброза, а также влияния сахарного диабета 2-го типа.

Целью улучшения моделей на животных является разработка методов, позволяющих более точно оценивать прогрессирование заболевания и терапевтические вмешательства. Было применено несколько различных подходов для индукции пиелонефрита у крыс и / или мышей для изучения патофизиологии повреждения почек, влияния лечения антибиотиками и других аспектов естественного течения ИМВП. Общим подходом к созданию ретроградной ИМП является трансуретральная катетеризация. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Этот метод вводит бактерии через уретру в мочевой пузырь анестезированных животных. Хотя этот метод близко имитирует пиелонефрит человека, фактическая частота и величина инфекции пиелонефрита могут быть сильно варьируемыми из-за множества факторов, включая отсутствие спонтанного мочеточникового рефлюкса или мочеиспускания во время или сразу после инокуляции. 11 В результате, экспериментальная изменчивость в индукции восходящий пиелонефрит инфекции может ограничить полезность этой модели для изучения инфекции почек, а также терапевтические стратегии.

В этом отчете описывается модель хирургического пиелонефрита, где E. coli непосредственно вводится в почки крысы. Несмотря на то, что эта модель крысы является инвазивной, количество E. coli, доставляемое в почку, можно эффективно контролировать, обеспечивая надежную инфекцию почек и воспаление. 14 В рамках этой процедуры мы также описываемКак эти индуцированные почечные инфекции могут контролироваться продольно с помощью магнитно-резонансной томографии in vivo (МРТ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на животных проводились в соответствии с утвержденными протоколами Комитета по институциональному контролю и использованию животных (IACUC) в Университете Case Western Reserve. Продолжительность хирургической процедуры, описанной ниже, составляет приблизительно 45-60 мин. Сама процедура МРТ составляет приблизительно 15 минут для каждой временной точки.

1. Анестезия

  1. Анестезируйте крысу в изофлурановой камере, установленной на 2% изофлуране, смешанном с кислородом, для облегчения обработки животных и сдержанности перед введением инъекционной анестезии внутрибрюшинно.
  2. Через 3-5 минут воздействия изофлюрана убедитесь, что животное анестезировано и не имеет никакого ответа на пинч.
  3. Дальнейшая седативная крыса с внутрибрюшинной инъекцией смеси ксилазина и кетамина: 75 мг / кг кетамина / 10 мг / кг ксилазина. При выполнении внутрибрюшинных инъекций оттягивайте иглу, чтобы убедиться, что части кишечника или других жизненно важных органов не были проколоты.
  4. яNject 2 мг / кг бупивакаина подкожно в месте разреза, чтобы обеспечить местное облегчение боли.

2. Подготовка хирургической зоны

  1. Стерилизовать хирургические инструменты и материалы, прежде чем они будут использоваться для хирургии, и выложить на хирургическую подушку для стерильности. Большинство инструментов и расходных материалов можно автоклавировать и повторно использовать.
  2. Используйте стерильные перчатки для всех хирургических процедур.
  3. Используйте электрическую бритву, чтобы побрить мех с правой стороны животного. Бритье животного от нижней части грудной клетки до верхней части задней ноги обеспечивает большую область без волос для разреза.
  4. Поместите животное на стерильную хирургическую подушку, чтобы изолировать дезинфицированную область от окружающих областей.
  5. Скраб кожи с дезинфицирующим средством, таким как повидон йод или бетадин. Начните очистку в центре хирургического участка и перемещайтесь наружу круговым способом. Повторяйте по крайней мере три раза с новой вытиранием повидона йода или бетадина.
  6. Скраб хирургического сайта с 70% спиртовых мазков, пока кожа не станет прозрачной, так как йод может быть токсичным, если он поглощается.

3. Хирургическая процедура

  1. Поддерживайте эту процедуру в асептических условиях.
  2. Поместите обезболивающее животное на теплый нагревательный слой в левом боковом разрезе с правым боком, обращенным вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Следует соблюдать осторожность, чтобы поддерживать температуру тела основного тела животного при 35-37 ° C для предотвращения гипотермии. Этот нагревательный слой также следует стерилизовать по мере необходимости для поддержания асептических условий.
  3. Почувствуйте грудную клетку и сделайте небольшой правый дорзальный забрюшинный разрез на 2-3 см, используя лезвие скальпеля стерильного размера 10, начиная с нижней части грудной клетки.
  4. Поместите стерильную марлю в продольном направлении вдоль каждой стороны разреза.
  5. Отсеките подкожную ткань, жир и мышцы, чтобы визуализировать и получить доступ к брюшной полости. Используйте ножницы Mayo с изогнутыми лопастями, чтобы обеспечить более глубокое проникновениеРацион в рану и разрезать толстые ткани.
  6. Как только печень будет хорошо видна и доступна, используйте тупые щипцы, чтобы отвести печень вверх.
  7. Используя другую пару тупых щипцов в другой руке, выставляйте правую почку, чтобы она сидела прямо за брюшной полостью.
  8. Используйте указательный палец и большой палец левой руки, чтобы удерживать почку в нужном положении. С правой стороны медленно и неуклонно вводить 0,1 мл раствора UTI89 E. coli (концентрация между 1 × 10 8 -1 × 10 9 ) из стерильного шприца в почечную лоханку (которая появляется как белый пузырь) 15 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. Подготовьте бактериальный титр, как описано в ссылке 15 .
  9. Поместите полоску абсорбируемого гемостата поверх иглы, чтобы предотвратить отток инокулята в брюшину. Медленно вытащите иглу из почечной лоханки.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Следует соблюдать осторожность, чтобы не прокалывать или не инфицировать окружающие ткани, что приводит к заражению вне мишениИ / или осложнений.
  10. Используйте более крупный шприц для тщательного полоскания почки с нормальным физиологическим раствором перед тем, как поместить его обратно в брюшную полость.

4. Швы

Примечание. Шов, который будет зарыт в тканях, должен быть 4-0 неабсорбируемыми плетеными швами. Абсорбируемые или моноволоконные швы могут использоваться для поверхностей тела.

  1. Поместите швы равномерно и как можно ближе к краю ткани, чтобы предотвратить обструкцию кровотока; Обычно не более 0,3 см от края.
  2. Возьмитесь за кожу и слегка поверните ее, используя пару тонких зубчатых щипцов, и поверните держатель иглы в пронатанное положение, готовясь к прошивке кожи.
  3. Проведите иглу через всю толщину кожи, заставив запястье вращать иглу и пропустить ее через кожу.
  4. Повторите этот процесс для края кожи, ближайшего к человеку, выполняющему процедуру.
  5. затянутьШвов достаточно, чтобы противостоять краям ткани. Любой более жесткий будет препятствовать кровоснабжению, медленному заживлению ран и может привести к исчезновению.
  6. Закрепите шов, используя квадратные узлы, как если бы это был простой прерывистый шов, за исключением того, что разрезали только короткую нить, оставляя около 3-4 мм хвост.
  7. После того, как первый шов был завязан, приготовьте второй шов примерно на 3 мм от первого и продолжайте работу шовного материала.
  8. Как только конец разреза будет достигнут, полностью не протащите последний шов. Вместо этого используйте петлю, которая удерживается здесь с держателем иглы в виде короткой нити, чтобы завязать дистальный конец шовной крышки.
  9. Используя инструменты, закрепите шов, используя квадратные узлы. Это приводит к тому, что 3 нити торчат из завершенного узла на дистальном конце.

5. Восстановление животных

  1. Внедрить 2,1 мг / кг йохимбина внутрибрюшинно после операции для отмены анестезии.Ожидается, что после операции через 3-5 часов полностью восстановится после хирургической процедуры.
  2. Держите животное на нагревательной подушке (во избежание гипотермии) и впитывающих мягких постельных принадлежностях после операции.
  3. Обеспечьте регидратацию пероральными или парентеральными жидкостями, пока они не смогут вернуться к нормальному питанию (в течение 24 часов). Внесите приблизительно 0,6 мл нормального физиологического раствора в брюшную полость сразу после операции, чтобы ограничить эффект дегидратации.
  4. Обеспечьте анальгезию, как описано в утвержденном IACUC протоколе по уходу за животными и использованию. Внесите 5 мг / кг carprofen подкожно для лечения боли.
  5. Регулярно контролируйте надрезы для набухания, экссудации, боли или исчезновения.

6. Проверка с помощью магнитно-резонансной томографии

  1. Проведение я п Vivo экспериментов МРТ на высоких полевую МРТ сканеров небольших животных.
  2. Вызвать анестезию с 3% изофлураном в кислороде и разместить животное с правой почкой в ​​изоцентре в МРТ-сканере и соответствующим образомЕли радиочастотную катушку. Обеспечьте животных 1-2% изофлурановой анестезией непрерывно во время процедуры визуализации с помощью носекона.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для изображений МРТ in vivo, показанных на рисунке 1 , использовалась объемная обмотка крысы (внутренний диаметр = 72 мм).
  3. Используйте систему контроля и контроля животных, чтобы поддерживать скорость дыхания каждого животного (40-60 вдохов / мин) и температуру тела ядра (35 ± 1 ° C).
  4. Используйте мультиреакцию с множественным эхо-эхо-повторением MRI для получения изображений с высоким разрешением, осевых T2-взвешенных изображений как инфицированных, так и контрольных почек. Типичными параметрами получения МРТ являются время повторения = 5000 мс, время эха = 40 мс, толщина среза = 2,0 мм, пространственное разрешение в плоскости = 200 мкм, 3 средних сигнала и время захвата 8 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Медицинские методы визуализации дают возможность неинвазивно оценивать ИМП и терапевтическую эффективность. Поэтому МРТ использовалась для подтверждения индукции острой инфекции после инъекции 1-2 × 10 7 UTI89 E. coli и для визуализации изменений в почках до и после операции. На рис. 1а-б показан прогрессивно увеличивающийся участок почек (желтые стрелки). Изображения МРТ, полученные для каждого животного в 1 и 4 день после инфицирования, характеризую...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Восходящий острый пиелонефрит у грызунов (т.е. мышей и крыс) может быть получен путем трансуретральной катетеризации. 16 , 17 , 18 Этот метод трансуретральной инфекции выгоден тем, что он неинвазивный и имитирует патофизиологию человека восходящей инфекции. 17 , 18 , 19 , 20 Однако этот метод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Других разглашений у авторов нет.

Благодарности

Авторы выражают признательность за поддержку NIH/NIDDK K12 DK100014 (Lan Lu), Case Comprehensive Cancer Center (NIH/NCI P30 CA43703) и Clinical and Translation Science Collaborative of Cleveland (NIH/NCATS UL1 TR000439).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Впитывающая прокладкаFisher14-127-47
Стерильная ватная марлевая салфеткаFisher22-415-469
Латексные хирургические перчаткиHenry Schein Animal Health21540
Изогнутые ножницы МайонезаFisherS17341
Прямая тупоя форцепсFisher08-895
Ручка скальпеля Fisher08-913-5
Стерильные лезвия скальпеляFisher53220
1 мл Шприц Luer-LokBD Biosciences309628Для бактериальных инъекций
20 мл Шприц Luer-LokBD Biosciences301031Для промывки солевым раствором
HemostatSeneca Medical240267
23 г 3/4 дюйма. Игла BD Biosciences305143
30 G 1 дюйм Игла BD Biosciences305128
Инсулиновый шприц U-100Exel International 25846Для инъекций лекарств
ИзофлуранHenry Schein Animal Health050033
ксилазинHenry Schein Animal Health33197Inject IP
КетаминPatterson Vetrinary 07-881-9413Инъекции
йохимбина (Атипамезола)Patterson Vetrinary 07-867-7097Инъекция ВП после операции
Бупивакаин (Маркаин)Patterson Vetrinary 07-890-4584Введение SQ в область разреза
4-0 Хромовый шов для кишечникаEthicon Inc.U203H
4-0 Плетеный викрил Шовный материалEthicon Inc.J304H
1 мл SubQ ШприцBD Biosciences309597
E. coli  UTI89 или CFT073ATCC700928
Surgicel Absorbable HemostatEthicon Inc.ETH1951CS 
Biospec 9.4T MRI Bruker 94/20 ЕВР

Ссылки

  1. Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
  2. Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
  3. Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
  4. Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
  5. Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
  6. Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
  7. Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
  8. Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329(2007).
  9. Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
  10. Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
  11. Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
  12. Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
  13. Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
  14. Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
  15. Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
  16. Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
  17. Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
  18. Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
  19. Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
  20. Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Escherichia coli
Интранальная инъекция Escherichia coli В крысиной модели пиелонефрита
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.