Методическая статья

Анализы для изучения роли Vitronectin в бактериальной адгезии и сопротивление сыворотки

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54653

⸱

16 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Microbiology, Department of Translational Medicine, Lund University, 2Department of Molecular Biology, Umea University

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем докладе описываются протоколы для характеризующие взаимодействия между бактериальной внешней мембранных белков и vitronectin регулятор человека дополнением. Протоколы могут использоваться для изучения реакции связывания и биологические функции vitronectin в любых бактериальных видов.

Аннотация

Бактерии использовать дополнение регуляторы в качестве средства уклонения от иммунного ответа. Здесь мы описываем протоколы для оценки роли vitronectin приобретения в бактериальной клетке поверхности играет в сопротивление иммунной системы. Потока цитометрии эксперименты определены человеческой плазмы vitronectin как лиганд для белка наружной мембраны бактерий рецептор H Haemophilus influenzae типа f. Энзим соединенный assay иммуносорбента был нанят характеризовать белок белковых взаимодействий между очищенной рекомбинантных белков H и vitronectin, и обязательного соответствия была оценена с помощью био слоя интерферометрии. Биологическое значение привязки vitronectin белка H на поверхности бактериальных клеток в уклонение иммунного ответа было подтверждено с помощью пробирного сопротивления сыворотки с нормальным и vitronectin истощены человеческой сыворотки. Значение vitronectin в бактериальных присоединения был проанализирован с использованием стекла слайды с и без vitronectin покрытия, следуют грамм пятная. Наконец бактериальной адгезии клеток человека альвеолярного эпителия монослои было расследовано. Протоколы, описанные здесь может быть легко адаптирована к изучению любых бактериальных видов интерес.

Введение

Vitronectin (Vn) является важным человека гликопротеин, участвующих в поддержании гомеостаза через регулирование фибринолитической системы. VN также функционирует как дополнение регулятор, подавляя терминала дополнением путь во время C5b6-7 комплекс формирования и C9 полимеризации. Было показано несколько бактериальных патогенов набирать Vn на поверхности клеток как средство противодействия дополнением осаждения1,2,3. Кроме того Vn функционирует как «сэндвич» молекула между бактериями и принимающих рецепторы эпителиальных клеток, способствуя присоединению и интернализации патогенов2,4,5. Связывание Vn к поверхности бактериальной клетки при посредничестве других в настоящее время неопознанные белков. Полностью определить функциональную роль Vn привязки в уклонение шланг иммунного ответа поэтому потребует идентификации Vn Рекрутинг белков.

Первым шагом в выявлении Vn связывающих белков является для тестирования ли возбудитель интереса можно привязать очищенный В.н. проточной цитометрии удобный и простой метод, чтобы определить, привязан ли Vn возбудителя клетки. В этом исследовании мы оценивали привязки Vn различных клинических изолятов Haemophilus influenzae типа f (Hif)6. Метод, описанный здесь количественных и может использоваться для различения связывающая способность широкого спектра бактериальных штаммов. В предыдущем исследовании мы охарактеризовал белка H (рН) Hif как Vn связывания белка7. Таким образом в настоящем исследовании, Vn привязки потенциал одичал тип (WT) Hif и Hif M10ΔЛПХ мутанты были сопоставлены с использованием описанных протоколов.

После того, как выясняется, что возбудитель связывает Vn, второй шаг должен характеризовать поверхности протеома с целью выявления потенциальных Vn связывающих белков. Различные подходы могут быть использованы для этой цели8,9, но эти методологии не описаны в настоящем докладе. Метод, наиболее подходящий для изучения взаимодействия протеин протеина является recombinantly выразить выбранный бактериальных белков на поверхности в E. coli и очищают хромотографией сродства. Здесь мы используем PH и ее молекулярного взаимодействия с Vn проиллюстрировать метод. Взаимодействие между рекомбинантных PH и ВН были охарактеризованы с помощью иммуноферментного анализа (ИФА)7 и недавно разработанных лейбл свободный метод, известный как био слоя интерферометрии (BLI)10,11. В то время как ELISAs может использоваться для подтверждения белок белковых взаимодействий, BLI предоставляет подробные данные относительно кинетические параметры взаимодействия.

Для изучения функциональной роли Vn бактериальных соблюдения, могут быть использованы два разных анализов. Первая проба, описанные здесь является прямое измерение бактериальной присоединения к Vn покрытием стеклянных поверхностей, в то время как второй assay рассматривает присоединение к поверхности эпителиальных клеток. Для первого assay стекло слайды были покрыты Vn, и связывание WT или мутантных штаммов Hif оценивали по Граму и микроскопии. Этот метод легко различает бактерии, основанный на способности связать Vn12. Бактериальной адгезии клеток млекопитающих затем анализируется путем добавления искусственного бактерий на монослое типа II альвеолярных клеток эпителия; Бактериальные вложение оценивалась путем подсчета количества формирования колонии единиц (CFUs). Соблюдаться и интернализированных бактерии могут быть выделены в наличие или отсутствие Vn4,13.

Роль Vn приобретения в бактериальных сыворотки сопротивление было оцениваются с помощью пробирного убийство сыворотки (то есть, бактерицидную активность сыворотки). Чтобы оценить значение Vn приобретения в сыворотке сопротивления, бактерицидная активность сыворотки, Vn истощены (VDS) был по сравнению с нормальной человеческой сыворотки (NHS). Метод, используемый легко отличает Vn привязки против обязательной бактерий на основе сыворотки сопротивления. Мы использовали этот метод для изучения роли Vn в сыворотке сопротивление ряда бактериальных патогенов4,12.

Были зарегистрированы многочисленные методы для изучения взаимодействия хост патогена. Здесь мы описывают набор протоколов, которые могут быть легко адаптированы к изучению любых возбудитель для того, чтобы оценить роль в патогенезе Vn. Мы проверили эти протоколы, используя различные патогенные микроорганизмы, и Hif была выбрана в качестве примера для этого отчета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. анализ Vn как лиганд бактериального белка на поверхности

  1. Обнаружение Vn-привязки на поверхности бактерий с помощью проточной цитометрии
    Примечание: В проточной цитометрии, мы использовали стороны точечной и вперед разброс для ворот позитивные события. Для изучения взаимодействия с Vn, Hif клинических изолятов (n = 10)7 были выбраны вместе с е. coli BL21 (DE3) как отрицательный контроль (рис. 1А).
    1. Культура Hif клинических изолятов в мозг сердце среднего инфузии (BHI) дополнена NAD 10 мкг/мл и гемин при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин. Используйте Лурия-Бертани среднего для культуры е. coli14. Урожай Hif на этапе среднего журнала (OD600 = 0,3)15и Ресуспензируйте бактерий в фосфат амортизированное saline (PBS), рН 7,2, содержащей 1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА) (блокирующий буфер; PBS-BSA). Настройка подвески 109 кое/мл.
    2. Передача аликвоты, содержащие 5 х 106 кое по 5 мл, полистирола раунд нижней трубы (12 x 75 мм2) и добавьте 1 mL блокировки буфера. Центрифуга подвеска на 3500 × g при комнатной температуре (RT)16 5 мин для пеллет бактерий, а затем тщательно удалить чтобы удалить супернатант не нарушая гранулы.
    3. Ресуспензируйте бактериальных окатышей с 50 мкл блокирующий буфер, содержащий 250 Нм Vn и Проинкубируйте образцы для 1 h на RT без встряхивания. После инкубации Пелле бактерии центрифугированием в 3500 x g 5 минут, а затем вымыть окатышей, три раза с использованием PBS и аналогичные шаги центрифугирования.
    4. Для бактериальных Пелле добавьте 50 мкл первичных овец античеловеческие Vn поликлональных антител (пабы) в разведении 1: 100 в PBS-BSA. Инкубировать подвеска для 1 h на RT, а затем промойте бактерий в три раза с PBS удалить несвязанные антитела (как описано в шаге 1.1.3).
    5. Затем добавьте 50 мкл PBS-BSA, содержащий флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-конъюгированных осла анти овец пабы (разбавления 1: 100) и Инкубируйте на RT 1 h в темноте.
    6. Подготовьте пустой элемент управления путем инкубации бактерий с блокировкой только буфера и пабы без Vn.
    7. Промойте бактерий в три раза с 1 мл раствора блокировки буфера и Пелле подвеска центрифугированием, как описано в разделе 1.1.2. Наконец Ресуспензируйте бактериальных лепешка с 300 мкл PBS и анализировать поток цитометрии7.
  2. ИФА анализ взаимодействия между рекомбинантных PH и ВН
    Примечание: Элементы управления должны быть включены для исключения неспецифического связывания. Человеческий фактор H (FH) или C4b-связывания белка (C4BP) используются в качестве положительной и отрицательной контроля, соответственно.
    1. Развести каждого человека белков (Vn, FH и C4BP) отдельно до 50 Нм в Tris-HCl, рН 9,0 (покрытие буфера). Отказаться от 100 мкл раствора белка в каждой скважине плиты микротитровальных Polysorp. Закройте пластины с крышкой и хранить при 4 ° C на ночь (16 h) для облегчения иммобилизации белков на микротитровальных тарелка скважин.
    2. Отменить решение от микротитровальных пластины, наклоняя вниз над раковиной и Промыть лунки три раза с 300 мкл PBS/хорошо. Блокировать покрытием скважин на 1 ч на RT с PBS, содержащие 2,5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
    3. После удаления блокировки решение, промойте скважин три раза с 300 мкл PBS, содержащие 0,05% (v/v) анимации 20 (PBST) за хорошо. 100 мкл 50 Нм рекомбинантного его меткой PH для каждого образца хорошо и инкубировать 1 час на RT. В скважинах управления только 100 мкл PBS-BSA.
      Примечание: Ген ЛПХ , кодирование PH от Hif усиливается ПЦР и клонирован в вектор выражения pET26b, который добавляет 6 × его тег в C-terminus выраженной белка. Рекомбинатные вектор был преобразован в E. coli BL21(DE3) для выражения. Ni-НТА смола используется для очистки рекомбинантных белков15.
    4. Отменить решение белка и удалите unbound протеины, промывки скважин три раза с 300 мкл PBST за хорошо. 100 мкл PBS-BSA содержащие пероксидазы (ПХ)-конъюгированных против его пабы (1:10, 000 разрежения) и инкубировать 1 час на RT.
    5. Готовят раствор 20 мм A путем растворения тетраметилбензидина в раствор 5% ацетона и 45% метанола. Подготовить раствор B, распустить 19,2 г лимонной кислоты в 1000 мл, H2O, регулировка рН до 4.25, добавив Кох, затем 230 мкл 30% H2O2. Хранить оба решения в темноте на RT. Непосредственно перед использованием Смешайте 500 мкл раствора B с 9,5 мл раствора A подготовить ELISA обнаружения реагента.
    6. Промыть лунки три раза с 300 мкл PBST за хорошо и выявления комплексов антиген антитела, добавив 100 мкл Реагента ELISA обнаружения для каждой скважины.
    7. Добавьте 50 мкл 1 М H2так4/well чтобы остановить реакции. Измерение оптической плотности скважин на 450 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
  3. Исследование кинетики взаимодействия рекомбинантных PH и Vn, используя BLI
    1. Иммобилизации человека Vn Амин реактивной датчиков с помощью аминов, муфты метод, по словам производителя рекомендации11.
    2. С помощью PBS, серийно разбавить лиганда (рекомбинантной PH) от 0 до 4 мкм и передать результирующее решения 96-луночных черный, с плоским дном микротитровальных плиту. Запустите эксперимент при 30 ° C, с помощью инструмента BLI17.
    3. Загрузите папку данных в программное обеспечение для анализа данных BLI. Выберите параметр «Выбор датчика» . Затем, выберите «ссылка хорошо» (Vn покрытием датчик в PBS) для вычитания.
    4. Выберите «Выровнять оси y базовой линии» и «interstep коррекции и выровнять ассоциации». Пресс «данных процесса», который будет автоматически открывать вкладку анализ.
    5. На вкладке Анализ выберите параметр «ассоциации и диссоциация» под кривой. Выберите модель ' 1:1 привязки и глобальные установки '. Нажмите «подходят кривой» и установку данных17экспорта.

2. характеристика роли Vn в бактериальных присоединения

  1. Исследование бактериальных присоединения к Vn покрытием стеклянных поверхностей
    1. Подготовьте раствор 2 мкг/мл в PBS и пипетки 10 мкл этого решения на стекло микроскопа слайд как одна капля Vn. Разрешить падение сушиться на слайде 30 мин на RT. пальто слайд с человеческого сывороточного альбумина (HSA) как отрицательный контроль.
    2. Вымойте белка покрытием стекла слайды три раза путем окунать слайды на две секунды в стакан, содержащие PBS для удаления избыточного немелованной белка. Добавить 20 мл свежего Hif культуры (описано в шаге 1.1.1) в стерильных пластиковых Петри и погрузите Vn- / покрытием HSA стеклышки в среде культуры. Инкубируйте блюда при 37 ° C в течение 1 ч при встряхивании в 20 об/мин.
      Примечание: Hif M10 и Hif M10ΔЛПХ были выращены в жидкой среде BHI или на шоколадный агар пластины. Средство для ЛПХ мутант был дополнен 10 мкг/мл канамицин15.
    3. После инкубации удалите любые свободные бактерии, погрузив слайды три раза в стакан, наполненный PBS. Визуализация бактерии с грамм пятная, как описано.
      1. Удалите избыток PBS из каждого слайда, наклоняя его и трогательно края на папиросной бумаги. Просушите слайды для 3-5 мин на RT и исправить придерживался бактерий, передавая каждый слайд три раза на огне.
      2. Держите слайд за края двумя пальцами на окрашивание лоток, а затем добавить 3-4 капли (200 – 300 мкл) фиолетовый кристалл 2,3% раствора. Подождите 60 s, а затем вымыть слайды под нежный поток водопроводной воды для 3-4 s.
      3. Добавьте 3-4 капли раствора йода 0,33% на слайды. Подождите 1 мин, затем ополосните слайд под нежным струей водопроводной воды. Тщательно высушите слайды на промокательной бумаги.
      4. Добавьте 3-4 капли обесцвечивания раствора, содержащего 75% изопропиловый спирт и 25% ацетона на слайд. После 5-10 сек Вымойте слайд под нежным струей водопроводной воды.
      5. Добавьте 3-4 капли (200 – 300 мкл) основных carbolfuchsin раствора. Подождите 1 мин, затем ополосните слайды под нежным струей водопроводной воды. Сухие слайды с помощью промокательной бумаги.
      6. Визуализируйте бактерий под микроскопом света, при выборе объектива нефти погружение на 100 X увеличение18. Сравните присоединения Hif WT и мутантов бактерий на поверхности стекла Vn - и HSA покрытием.
  2. Изучение Vn-зависит от приверженности эпителиальных клеток бактерий
    Примечание: Этот assay эффективного соблюдения был использован в наших предыдущих исследований4,7.
    1. Культура A549 клетки (тип II альвеолярные клетки эпителия) в 75-cm2 культуры ткани колба с F12 среднего дополнена 10% плода теленка (vol/vol) сыворотки (FCS) (полная средний) и 5 мкг/мл гентамицина. Инкубируйте 3 дней до 80% притока колбу в инкубаторе с 5% CO2 при 37 ° C (confluency может быть оценена путем визуализации поверхности покрытия с помощью инвертированного микроскопа клетки). Следующие четыре шага описывается, как подготовить эпителиальных клеток для пробирного19,20.
      1. Вымойте монослое клеток в колбу дважды с 20 мл PBS, нежный закрученной. Чтобы отсоединить клетки с поверхности колбы, добавить 2 мл раствора фермента отряд клеток и инкубировать Фляга для 5 минут при 37 ° C. Нажмите колбу с вашей ладони, чтобы отсоединить все клетки с поверхности пластика. Пипетка вверх и вниз несколько раз чтобы разгонять скопления клеток.
      2. Добавить 18 мл F12 полной среды в колбу и передать всю ячейку подвеска 50 мл стерильной пробирке Falcon. Центрифуга суспензию клеток для 5 минут при 200 x g в RT и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл полные средства F12.
      3. Удаление 10 мкл суспензии клеток и поместите его в пробирку Эппендорф, затем 90 мкл раствора Трипановый синий. Загрузить образец в Горяева (глубина 0,1 мм) после размещения coverslip.
      4. Подсчет всех жизнеспособных клеток в областях A, B, C и D (каждое поле состоит из 16 квадратов, и каждая площадь имеет площадь 0,0025 мм2), затем вычислить среднее количество клеток ([A + B + C + D] / 4). Рассчитайте количество клеток на миллилитр, используя следующее уравнение:
        Жизнеспособных клеток/мл = средний клеток фото × 104 × разрежения фактор20.
        Примечание: Здесь, коэффициент разрежения составляет 10.
      5. Разбавления суспензии клеток до 5,0 x 103 клеток/мл, используя полный средних содержащего гентамицин 5 мкг/мл. Отказаться от 500 мкл суспензии клеток в каждой скважине плиты культуры клеток 24-хорошо. Инкубируйте пластины при 37 ° C в 5% CO2 , до тех пор, пока клетки являются 90% притока.
    2. До бактериальной инфекции удалите средство из скважин и F12 среднего (без FCS), затем Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    3. Вымойте монослое клеток три раза с 500 мкл PBS на RT. место пластину на льду и 100 мкл предварительно охлажденные средства F12, содержащие 10 мкг/мл В.н. инкубировать пластины на 4 ° C на 1 ч. Для контроля скважин добавьте только F12 среднего.
    4. После инкубации, отказаться от решения, закупорить и мыть слоя клеток дважды с 1 мл раствора PBS на RT. Ресуспензируйте культуры свежезаваренным выращенных Hif M10 (шаг 1.1.1) в F12 (2 × 108 кое/мл). 100 мкл этой бактериальных подвеска для каждой скважины и инкубировать пластину для 2 ч при 37 ° C.
      Примечание: Каждый хорошо содержит приблизительно 2 x 105 A549 клетки. Для инфекции, 2 x 107 бактериальных CFU были добавлены, соответствующий к разносторонности инфекции 100.
    5. Удалите носитель, закупорить и мыть A549 эпителиальных клеток в три раза с PBS. Добавьте 50 мкл/хорошо мобильный отряд решения и инкубировать пластину для 5 минут при 37 ° C.
    6. Добавьте 50 мкл F12 полного среднего за хорошо чтобы остановить ферментативной реакции. Передать эпителиальных клеток (≈100 мкл [то есть, весь объем]) от каждой скважины 6-mL стеклянная трубка, содержащая четыре стеклянных бусин. Лизируйте клетки на RT, vortexing на 2 мин.
    7. 100 раз разбавлять 10 мкл lysate клетки путем добавления 10 мкл lysate 990 мкл средства F12. Пластина 10 мкл разбавленного образца на шоколадный агар пластину.
    8. Инкубировать шоколадный агар пластины при 37 ° C на ночь, а затем подсчитать колоний. Каждая колония представляет один кое.

3. анализ Vn-зависит от сопротивления бактерицидную активность сыворотки крови человека

  1. Покупка ГСЗ из коммерческих источников. Как было описано выше12Подготовьте VDS. Пополнять ДСТС с 180 Нм Vn, что эквивалентно Vn, присутствующих в ГСЗ.
  2. Подготовка тепло инактивированная сыворотки (HIS) путем нагревать ГСЗ в 56 ° C за 30 мин для инактивации белков комплемента.
    Примечание: Hif15эмпирически определены оптимальные сывороточной концентрации (5%) и время инкубации (15 мин) для assay, описанные в шагах 3.3 – 3,7; эти параметры могут различаться для других бактериальных патогенов.
  3. Культуры бактерий (в данном случае, Hif M10 и мутанта Hif M10ΔЛПХ) к середине журнала фазы (OD600 = 0,3). Пелле бактерий центрифугированием в 3500 x g за 10 мин.
  4. Ресуспензируйте бактериальных лепешка с 1 объем декстрозы желатин Veronal буфера (DGVB++; рН 7.3) содержащий 2,5% (w/v) глюкозы, 2 мм MgCl2, 0,15 мм CaCl2и 0,1% (wt/vol) желатина.
  5. Добавить 1,5 х 103 CFU бактерий до 100 мкл DGVB++ , содержащая 5% сыворотки (NHS, его, VDS, или VDS + 180 Нм Vn). Инкубируйте образца при 37 ° C 15 мин с встряхивания на 300 об/мин.
  6. Удаление 10 мкл аликвота из реакционной смеси на 0 мин (T0 образец) и 15 мин (Tt образец) и пластины на шоколадный агар. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.
  7. После инкубации счетчик колоний, появляясь на плите. Рассчитать процент бактерий убиты12 , используя следующее уравнение: (CFU на Tt) / (CFU T0) × 100.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

VN привязки к поверхности бактерий определяется проточной цитометрии. Все Hif клинических изолятов испытания в этом исследовании набраны Vn на поверхности клеток. Не взаимодействие Vn с поверхности клеток наблюдалось отрицательного контроля штамм E. coli (рис. 1A). Как показано на рисунке 1B, рН является основным Vn связывающий белок на поверхности клеток Hif. Связывание Vn, штамм WT Hif...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Патогенные набирать Vn на поверхности клетки и использовать этот регулятор дополнением для предотвращения осаждения факторов комплемента и завершения комплекс мембраны нападение2. VN также функционирует как молекула мост между бактериальных белков на поверхности и принимающей ячейки поверхности рецепторы, таким образом позволяя патогенов присоединиться к поверхности эпителиальных клеток и впоследствии посредником интернализации. В этом исследовании мы описываем протоколы, которые могут использоват...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких финансовых конфликтов интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана гранты от фонда Анна и Эдвин Бергер, Ларс Hierta, о.е. и Эдла Йоханссон фонд, шведский Совет медицинских исследований (Грант номер K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Фонд рака в университете Больница в Мальмё, физиографические общества (Forssman в фонд) и Совет графства Сконе исследований и Фонд развития.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Термомиксер 1,5 млEppendorf5355Шейкер для нагрева и охлаждения сухого блока
5 мл полистирольная трубка с круглым дном BD Falcon60819-13812 &x 75 мм тип
5% CO2 прилагаемый инкубатор Термо Научный 
Трубка из полистирола с круглым дном объемом 6 мл VWR89000-47812 × 75 мм стиль с колпачком
24-луночные планшетыBD Falcon08-772-1HКлеточная культура марки
30% Перекись водорода (H2O2) растворSigma-AldrichH1009-100MLЛабораторный анализ марки
75 см2 колба для культуры тканейBD FalconBD353136Vented
96 луночная черная пластина с плоским дномGreiner Bio-One655090Культура тканей обработана & микро; Прозрачные черные пластины
A549 Клеточная линия человекаSigma-Aldrich86012804-1VL
Фермент клеточной отслойки (Аккутаза) Sigma-AldrichA6964-500MLДатчики для клеточных культур класса
AR2GPall Life Science18-5095Датчик для иммобилизованного белка путем аминосвязывания 
АцетонVWR97064-786Оценка
бычьих сывороточных альбуминов (БСА)Sigma-AldrichA2058Подходит для клеточных культур
Бибулус бумага VWR28511-007
Биослойный интерферометрPall Life ScienceFB-50258Оборудование для измерения двухслойной интерферометрии
Кристаллический фиолетовый растворSigma-AldrichHT90132-1L
C4BP (C4b-связывающий белок)Complement Technology, Inc.A109Куплено как замороженная жидкая форма
Хлорид кальция (CaCl2)Sigma-AldrichC5670-500G
Раствор карбол-фуксинаSigma-AldrichHT8018-250ML
Лимонная кислотаSigma-Aldrich251275-500GАмериканское химическое общество (ACS)
сорт Обесцвечивающий растворSigma-Aldrich75482-250ML-F
E. coli хозяин (E. coli BL21)Novagen69450-3Хозяин экспрессии белка
F12 средаSigma-AldrichD6421Cell Culture
Grade Flow cytometer BD Biosciences651154Класс клеточного анализа для исследовательских целей 
Фетальная сыворотка теленка (FCS)Sigma-Aldrich12003CПодходит для клеточной культуры
Нормальная человеческая сыворотка (NHS)Complement Technology, Inc.NHS Объединенная человеческая сыворотка
FITC-конъюгированные ослиные антитела против овец AbD SerotecSTAR88FПоликлональный
гентамицинSigma-AldrichG1397Клеточная культура класса
глюкозыSigma-AldrichG8270-1KG
ЖелатинSigma-AldrichG9391Подходит для клеточной культуры
ГемоцитометрMarienfeld640210
HRP-конъюгированные антитела анти-His TagAbcamab1269Поликлональный
человеческий фактор HComplement Technology, Inc.A137куплен как замороженная жидкость у
C4BPComplement Technology, Inc.A109Замороженный раствор
Сывороточный альбумин человекаSigma-AldrichA1653-10Gлиофилизированный порошок
Колонна аффинной смолы Гистидина (HisTrap HP)GE Health Care Life Science17-5247-01Колонки предварительно упакованы с Ni Sepharose
Меченый PHРекомбинантно экспрессируется и очищается в нашей лаборатории
Раствор йодаSigma-AldrichHT902-8FOZ
МетанолVWRBDH1135-1LPАнализ сорта
  МикроскопOlympusIX73Инвертированный
микроскоп Предметные стеклаSigma-AldrichS8902обычный, размер 25 мм &в раз; 75 мм 
Хлорид магния (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-1KG
Плазмида содержит C-терминал 6x His-tag на позвоночнике (pET26(b))Novagen69862-3ДНК-вектор
Polysorb микротитровые пластины Sigma-AldrichM9410для ИФА
Гидроксид калия (KOH)Sigma-Aldrich6009Американское химическое общество (ACS)
класс Овцы против антител VnAbD SerotecAHP396Поликлональный
шейкерStuart ScientificSTR6Шейкер
Фляга для культуры тканейBD Falcon317516775 см<суп>2
  Термомиксер Sigma-AldrichT3317Шейкер для нагрева и охлаждения сухих блоков
ТетраметилбензидинSigma-Aldrich860336-100MGИФА
класс Витронектин (Vn) из плазмы крови человекаSigma-AldrichV8379-50UGкласса клеточной культуры
BBD6220

Ссылки

  1. Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
  2. Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709(2016).
  3. Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
  4. Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
  5. Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
  6. Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
  7. Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
  8. Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615(2017).
  9. Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
  10. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  11. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
  12. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
  13. Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
  14. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  15. Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
  16. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  17. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  18. McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4(2005).
  19. Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
  20. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
  21. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
  22. Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
  23. Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
  24. Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HHaemophilus influenzae

Похожие статьи