Поступательный Администрация β-клеток митогенами к неповрежденной островки Mouse Ex Vivo Использование Биоразлагаемые поли (молочной-гликолевой кислоты) микросферы

Summary

Здесь мы представляем методологию создания и введения соединения микросфер поли(молочной-ко-гликолевой кислоты) (PLGA) в интактные островки мыши в культуре с последующим иммунофлуоресцентным анализом пролиферации β-клеток. Этот метод подходит для определения эффективности кандидатов в β-клеточные митогены.

Abstract

Развитие биоматериалов значительно увеличило потенциал для целенаправленной доставки лекарственных средств к различным тканей и клеток типов, в том числе и панкреатических бета-клеток. Кроме того, биоматериала частицы, гидрогели и каркасы также предоставляют уникальную возможность для введения устойчивой, контролируемой доставки лекарственного средства к бета-клеток в культуре и в пересаженных тканей моделей. Эти технологии позволяют изучение факторов пролиферации кандидат β-клеток с использованием интактные островки и поступательно соответствующую систему. Кроме того, определение эффективности и целесообразности факторов кандидатов для стимуляции пролиферации β-клеток в системе культуры имеет решающее значение , прежде чем двигаться вперед , чтобы модели в естественных условиях. Здесь мы опишем метод совместного культивирования неповрежденные островки мыши с биоразлагаемого соединения , представляющего интерес (ИСП) -loaded поли (молочной-гликолевой кислоты) (PLGA) микросферы с целью оценки влияния устойчивого высвобождения на месте O вF митогенных факторов на пролиферацию β-клеток. Этот метод подробно описывает, как генерировать микросферы PLGA, содержащих нужный груз с использованием коммерчески доступных реагентов. В то время как описанный метод использует рекомбинантный фактор человеческого роста соединительной ткани (rhCTGF) в качестве примера, легко может быть использовано широкое разнообразие ИСП. Кроме того, этот метод использует 96-луночные планшеты для минимизации количества реагентов, необходимых для оценки пролиферации β-клеток. Этот протокол может быть легко адаптирован для использования альтернативных биоматериалов и другие характеристики эндокринные клетки, такие как выживаемость клеток и статуса дифференцировки.

Introduction

Панкреатические бета-клетки являются единственными инсулин-продуцирующие клетки в организме и имеют решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы в крови. В то время как здоровые люди не имеют достаточную массу β-клеток и функционируют надлежащим образом регулировать содержание глюкозы в крови, больных сахарным диабетом характеризуются недостаточной массы β-клеток и / или функции ^1,2. Было высказано предположение , что индуцирование пролиферации β-клеток в конечном итоге может увеличить массу β-клеток и восстановление гомеостаза глюкозы у пациентов с диабетом ^3. Тем не менее, оценка и проверка потенциальных пролиферативных соединений β-кл....

Protocol

Все процедуры были утверждены и выполнены в соответствии с Institutional Animal Care и использование комитета Вандербильта.

1. Маркировка ИСП с флуорофором (Необязательно)

1. Выберите флуоресцентный краситель , который будет вступать в реакцию с свободного первичного амина (например, на белок), такие как сложные эфиры или производные сукцинимидиловых флуоресцеина, чтобы визуализировать микросферы груз. Растворите 8х молярный избыток (по отношению к числу молей ИСП) флуорофора в 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
2. Ресуспендируют 50 мг ИСП до конечного объема 800 мкл в растворе носителя (конечной концентрации 62,5 ....

Results

Рисунок 1 представляет собой визуальное представление микросферах , полученных с использованием вышеуказанного протокола. Протокол, описанный здесь, дает rhCTGF--ных микросфер различного размера. Самая большая часть микросфер будет находиться в диапазоне от 1 до 10 мкм в диаметре, хотя некоторые микросферы могут быть больше (рисунок 2). При желании размер микросферы могут быть настроены и оптимизированы на основе параметров изготовления .......

Discussion

Исследование пролиферации β-клеток в культуре, как правило, мешает несколько трудностей. Во-первых, иммортализованные β-клеточные линии характеризуются более высокими степенями пролиферации, чем то, что находится в эндогенных бета-клеток в живых островками. Кроме того, эти линии иммортализованных клеток не хватает нормальной архитектуры критической для нормальной функции β-клеток. Эти два факта делают его трудно определить , если результаты , полученные с использованием иммортализованных линий β-клеток будут справедливы.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green 488 Карбоновая кислота, сукцинимидиловый эфир, 6-изомер	ThermoFisher Scientific	O6149	Для мечения COI флуорофором
ДМСО Диметилсульфоксид	Fisher BioReagents	BP231-1	Для растворения флуорофора на этапе 1
Одноразовые обессоливающие колонки PD-10	GE Healthcare	17-0851-01	Обессоливающая колонка, используемая на этапе 1
Resomer RG 505, поли(D,L-лактид-ко-гликолид), сложный эфир с окончанием, молекулярная масса 54 000 - 69 000	Sigma-Aldrich	739960	Используется при получении микросфер на стадии 2
Поли(виниловый спирт) молекулярная масса 89 000 - 98 000	Sigma-Aldrich	341584	Используется при генерации микросфер на стадии 2
RPMI 1640	Thermo Scientific	11879-020	Для культивирования островков
Декстроза безводная	Fisher BioReagents	200-075-1	Добавка для островковых сред
Пенициллин-стрептомицин	Sigma-Aldrich	P4333	Антибиотики для островковых сред
Нормальная лошадиная сыворотка	Jackson ImmunoResearch	008-000-121	Добавка для островковых сред
96-луночный планшет для культивирования тканей	Corning	3603	Для культивирования островков
Этиленглико-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота	Sigma-Aldrich	E4378	Добавка для преданализных островковых сред
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Для вращения клеток на предметных стеклах микроскопа
EZ Single Cytofunnel	Thermo Scientific	A78710020	Для вращения клеток на предметных стеклах микроскопа
Этилендиаминтетрауксусная кислота	Fisher BioReagents	BP118-500	Используется при диссоциации островков
параформальдегид	Sigma-Aldrich	P6148	Для фиксации клеток
Triton  X-100	Fisher BioReagents	BP151	Для проникающих клеток
Нормальная сыворотка осла	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Блокирующие реагенты для иммунофлюоресценции
Anti-Ki67 антитела	abcam	ab15580	Для Ki67 иммунофлуоресценция
поликлональный Антиинсулин морской свинки	Dako	A0564	Для иммунофлюоресценции инсулина
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	Для иммунофлуоресценции Ki67
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig	Jackson ImmunoResearch	706-175-148	Для иммунофлюоресценции инсулина
DAPI (4',6-Diamidino-2-Фенилиндол, дигидрохлорид)	ThermoFisher Scientific	D1306	Для визуализации ядер в условиях иммунофлуоресценции
Aqua-Mount	Lerner Laboratories	13800	Быстросохнущий монтажный материал
FreeZone -105 ° C 4,5 литровая настольная система сублимационной сушки Cascade	Labconco	7382020	для лиофилизации микросфер