Характеристика Multi-субъединица белковых комплексов человеческого MxA Использование неденатурирующем электрофорез на полиакриламидном геле

Summary

В этой статье описывается простой и быстрый протокол оценки олигомерного состояния динаминоподобного белка GTPase MxA из лизатов клеток человека с использованием комбинации неденатурирующего PAGE с вестерн-блоттингом.

Abstract

Образование олигомерных комплексов является важнейшей предпосылкой для правильной структуры и функционирования многих белков. Индуцированный интерфероном противовирусный эффекторный белок MxA обладает широкой противовирусной активностью в отношении многих вирусов. MxA является динаминоподобной ГТФазой и обладает способностью образовывать олигомерные структуры более высокого порядка. Тем не менее, требуется ли олигомеризация MxA для его противовирусной активности, является спорным вопросом. В данной работе мы описываем простой протокол оценки олигомерного состояния эндогенно или эктопически экспрессируемого MxA в цитоплазматической фракции клеточных линий человека методом неденатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) в сочетании с вестерн-блоттингом. Важнейшим этапом протокола является выбор детергентов для предотвращения агрегации и/или осаждения белков, особенно связанных с клеточными мембранами, таких как MxA, без вмешательства в его ферментативную активность. Еще одним важным аспектом протокола является необратимая защита свободных тиоловых групп остатков цистеина йодоацетамидом для предотвращения искусственных взаимодействий белка. Этот протокол подходит для простой оценки олигомерного состояния MxA и, кроме того, позволяет установить прямую корреляцию противовирусной активности мутантов интерфейса MxA с их соответствующими олигомерными состояниями.

Introduction

Четвертичная структура белка, играет решающую роль во многих клеточных процессах. Сигнальных путей, экспрессии генов и ферментов активация / деактивация все полагаются на правильность сборки белковых комплексов ^1-4. Этот процесс также известен как гомо- или гетеро-олигомеризации происходит из-за необратимого ковалентного или обратимых электростатических и гидрофобных взаимодействий белок-белок. Олигомеризации не только разнообразит различные клеточные процессы , без увеличения размера генома, но также обеспечивает стратегию для белков , чтобы построить устойчивые комплексы, которые более устойчивы по отношению к денатурации и деградации ^5. Дефек....

Protocol

Примечание: Этот протокол основан на опубликованной ранее неденатурирующих протокола ^стр.12. В этом исследовании олигомерного состояния белка МхА оценивали с использованием либо клеток Vero с гиперэкспрессией MxA или ИФН-альфа-стимулированных клеток A549, экспрессирующих эндогенный МХА. Протокол, описанный ниже, может быть использован для анализа олигомерного состояния любого белка в дополнение к МХА. Тем не менее, может потребоваться дальнейшей оптимизации.

1. Получение клеточного лизата для неденатурирующем ПААГ

Примечание: Для анализа олигомерного состояния человеческого белка МхА либо в Vero или к....

Results

Используя неденатурирующем PAGE, мы проанализировали олигомерного состояния дикого типа человека МхА, димерные интерфейс мутанты MxA (R640A) и MxA (L617D), а также мономерной интерфейса мутанта МхА (M527D) из клеточных лизатов ^12. Клетки лизируют в буфере , содержащем 1% октилфеноксиполиэтоксиэтанол (NP-40) и иодацетамид , чтобы обеспечить солюбилизацию белка и защиты свободных тиоловых групп (см рисунок 1). Как было описано выше, соли и небольшие метаболиты удаляли диализом ^19. ра.......

Discussion

Здесь мы опишем простой метод, который позволяет быстрое определение олигомерных состояния белков, экспрессированных в клетках млекопитающих путем неденатурирующем ПААГ с последующим Вестерн-блот-анализа. Основное преимущество этого подхода состоит в том, что олигомерные состояние данного белка может быть определена из целых клеточных лизатов без очистки предшествующего белка. Это может быть важно для белков, которые олигомеризации или проявляют свою функцию, в сочетании со вспомогательными факторами. Кроме того, белки,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Диализные установки Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 мл	Thermo Fisher Scientific	69570	Предварительное равновесие в диализном буфере (при желательном удалении глицерина) Может быть изготовлен самостоятельно в соответствии с Fiala et al. 2011
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-луночный,	Bio-Rad	456-1083	Предварительный запуск в рабочем буфере для регулировки буферной системы
cOmplete, Mini, без ЭДТА	Roche	11836170001	использовать 1 таблетку на 50 мл
PBS, pH 7,4  разлить по 500 мл Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC надевайте перчатки и защищайте глаза
NativeMark Unstained Protein Standard  50µ l	Invitrogen	P/N 57030	загрузка 5 & l/well
A549 клетки	ATCC	ATCC CCL185	Выращивание в питательной среде (см. Таблица 1)
Клетки Vero	ATCC	ATCC CCL81	Выращивание в питательной среде (см. Таблица 1)
анти-Mx1 антитела	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Использование в разведении 1:1,000
ECL Antirabbit IgG, целое антитело, связанное с пероксидазой хрена (от donkey)	GE-Healthcare	NA934V	Использование в разведении 1:10,000
0,5% Трипсин-ЭДТА (1x)              Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Йодоацетамид   5 г	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4,5 г/л Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Стрептококк 100 х        100мл                            life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Глутамакс 100x Stock, 100 мл        life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, диализированная, США Происхождение 500 мл Gibco Лот:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Целлюлозная фильтровальная бумага	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  мембрана	GE-Healthcare	10600022
Tris(гидроксиметил)аминометан	Biosolve	0020092391BS
фторид натрия (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, без ЭДТА	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% раствор	Amresco	N907
DL-дитиотреитол (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
ортванадат натрия (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Глицерин	Sigma Aldrich	G7757
β-Глицерофоспат	Sigma Aldrich	G9422
Сухое молоко	Migros/Switzerland
Метанол	Millipore	1.06009
глорид натрия (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
хлорид магния (MgCl2)	Amresco	288
Додецилсульфат натрия (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
гидроксид натрия (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045