Характеристика Multi-субъединица белковых комплексов человеческого MxA Использование неденатурирующем электрофорез на полиакриламидном геле

Summary

В этой статье описывается простой и быстрый протокол оценки олигомерного состояния динаминоподобного белка GTPase MxA из лизатов клеток человека с использованием комбинации неденатурирующего PAGE с вестерн-блоттингом.

Abstract

Образование олигомерных комплексов является важнейшей предпосылкой для правильной структуры и функционирования многих белков. Индуцированный интерфероном противовирусный эффекторный белок MxA обладает широкой противовирусной активностью в отношении многих вирусов. MxA является динаминоподобной ГТФазой и обладает способностью образовывать олигомерные структуры более высокого порядка. Тем не менее, требуется ли олигомеризация MxA для его противовирусной активности, является спорным вопросом. В данной работе мы описываем простой протокол оценки олигомерного состояния эндогенно или эктопически экспрессируемого MxA в цитоплазматической фракции клеточных линий человека методом неденатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) в сочетании с вестерн-блоттингом. Важнейшим этапом протокола является выбор детергентов для предотвращения агрегации и/или осаждения белков, особенно связанных с клеточными мембранами, таких как MxA, без вмешательства в его ферментативную активность. Еще одним важным аспектом протокола является необратимая защита свободных тиоловых групп остатков цистеина йодоацетамидом для предотвращения искусственных взаимодействий белка. Этот протокол подходит для простой оценки олигомерного состояния MxA и, кроме того, позволяет установить прямую корреляцию противовирусной активности мутантов интерфейса MxA с их соответствующими олигомерными состояниями.

Introduction

Четвертичная структура белка, играет решающую роль во многих клеточных процессах. Сигнальных путей, экспрессии генов и ферментов активация / деактивация все полагаются на правильность сборки белковых комплексов ^1-4. Этот процесс также известен как гомо- или гетеро-олигомеризации происходит из-за необратимого ковалентного или обратимых электростатических и гидрофобных взаимодействий белок-белок. Олигомеризации не только разнообразит различные клеточные процессы , без увеличения размера генома, но также обеспечивает стратегию для белков , чтобы построить устойчивые комплексы, которые более устойчивы по отношению к денатурации и деградации ^5. Дефекты в олигомеризации оказывают влияние на функцию белков и может привести к развитию заболеваний. Например, фермент фенилаланин гидроксилазы образует тетрамерный комплекс. Некоторые мутации в белковом комплексе может ослабить образование тетрамерное и приводят к фенилкетонурии болезни ^6.

Белок MxA человек представляет собой интерферон (ИФН) индуцированный противовирусную эффекторной белка , оказывающего широкий противовирусной активностью в отношении различных РНК, а также ДНК - вирусов ^7. Он относится к надсемейства динамина подобных крупных ГТФаз и обладает способностью образовывать большие олигомерные структуры в пробирке ^8. Олигомеризация было предложено , чтобы защитить MxA от быстрой деградации ^9,10. Несмотря на интенсивные усилия многих исследовательских групп, молекулярный механизм действия остается в значительной степени неуловимым и роль олигомеризации состояния MxA для своей противовирусной функции находится на стадии обсуждения ^9,11,12. В связи с этим, Гао и его коллеги предложили модель , где MxA проявляет свою противовирусную активность при взаимодействии с вирусными нуклеопротеидами в виде крупных кольцевых олигомерных структур ^11. Тем не менее, в последнее время , мы показали , что MxA димеры обладают противовирусной активностью и взаимодействуют с нуклеопротеида вируса гриппа А ^12. ВAsed на кристаллическую структуру MxA, Гао и его коллеги определили несколько аминокислотных остатков в интерфейсных областях , которые имеют решающее значение для его олигомеризации в пробирке и его противовирусной функции ^11,13. Поэтому для того, чтобы выяснить, который олигомерные состояние MxA проявляет противовирусную активность, мы стремились создать простой протокол для быстрого определения oligmeric состояния интерфейса мутантов MxA, выраженные в клетках человека, а также эндогенными MxA выраженное после стимуляции IFN &.

Хотя существует много методов, которые обычно используются для исследования взаимодействия между белками , такими как белок сплит-зеленый флуоресцентный (сплит-GFP) комплементационная анализ ^14, поверхностного плазмонного резонанса ¹⁵ и Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) ^16, они не обеспечивают информация о точной стехиометрии олигомерного белкового комплекса. Для исследования этого конкретного аспекта, методы, такие какмульти-угол рассеяния света (MALS) ¹⁷ и аналитической ультрацентрифугирования ¹⁸ очень полезны. Как правило, белки анализировали с помощью этих методов являются очищенные белки. Процессы олигомеризации может также зависеть от других клеточных факторов. Если эти факторы неизвестны, анализ является более трудным. Кроме того, некоторые белки трудно выразить в Е. палочки и очистить. Таким образом, эти методы не являются оптимальным выбором для анализа белка олигомеризации в клеточной среде. Кроме того, эти методы требуют дорогих инструментов, которые не легко доступны.

Non-денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), гель -проникающей хроматографии или химического сшивания с последующим обычным додецилсульфата натрия (SDS) -page являются полезными инструментами для характеристики образования олигомеров из клеточных лизатов ^2,19,20. Эти методы не требуют специального оборудования и может быть легко реrformed в стандартной лаборатории. Первоначально мы оценивали различные химические сшивающие протоколы, которые инвариантно привели к неспецифической агрегации и осаждению МХА. Таким образом, мы в следующий раз испытал протоколы СТР неденатурирующем. В качестве не денатурирующее СТР исключает использование SDS, миграция белков зависит от их родного заряда. Сине-нативный страница использует кумасси бриллиантовым синим G250 , чтобы загрузить белки с общим отрицательным зарядом, аналогично SDS, но не денатурации белка ^21. К сожалению, кумасси бриллиантовый синий осаждается в присутствии высоких солей и двухвалентных катионов (например , Mg ²⁺⁾ , которые часто включают в лизиса буферов. В зависимости от используемых буферов, может быть трудно анализировать образец без дальнейшей оптимизации шагов, которые могли бы оказать влияние на олигомерного белкового комплекса.

Здесь мы приведем простой протокол , основанный на ранее опубликованного метода ²² , чтобы определить , олигомеризациюбелок человеческого MxA полученный из клеточных лизатов с использованием неденатурирующем PAGE.

Protocol

Примечание: Этот протокол основан на опубликованной ранее неденатурирующих протокола ^стр.12. В этом исследовании олигомерного состояния белка МхА оценивали с использованием либо клеток Vero с гиперэкспрессией MxA или ИФН-альфа-стимулированных клеток A549, экспрессирующих эндогенный МХА. Протокол, описанный ниже, может быть использован для анализа олигомерного состояния любого белка в дополнение к МХА. Тем не менее, может потребоваться дальнейшей оптимизации.

1. Получение клеточного лизата для неденатурирующем ПААГ

Примечание: Для анализа олигомерного состояния человеческого белка МхА либо в Vero или клетки А549, собирали 1,0 × 10 ⁶ клеток. В зависимости от типа клеток или от избытка белка для анализа, количество клеток должно быть отрегулировано. Кроме того, важно, чтобы защитить лизис буфера от воздействия света, как только будет добавлен светочувствительный йодацетамида.

1. Семенной 0,3 х 10 ⁶ А549 или Vero клеток на лунку в6 а-х блюд. Сохранить клетки в 2 мл среды для роста на лунку (таблица 1). Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С, 5% СО _2).
2. Сбора клеток путем промывки 1 мл фосфатно-буферного раствора (PBS) и отделяться путем добавления 0,5 мл 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) 1x раствор в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре.
3. Как только клетки отделяются от блюдо, добавьте 0,5 мл питательной среды и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
4. Передача клетки в каждую лунку в одну 2 мл пробирку и осадить их, используя настольную центрифугу (5000 XG, 4 ° C, 5 мин).
5. Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки, не нарушая клеточный осадок.
6. Промывают клетки с 1 мл охлажденного льдом PBS, тщательно пипеткой клеточной суспензии вверх и вниз.
7. Гранул клетки в настольную центрифугу (5000 XG, 4 ° С, 5 мин).
8. Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки Wiбез промежуточного отсоединением осадок клеток.
9. Ресуспендируют клеток в 200 мкл охлажденного льдом буфера для лизиса (таблица 1) с помощью пипетки вверх и вниз и поставить на лед.
10. Сразу же, защитить лизат от света путем покрытия труб с использованием оловянную фольгу и инкубировать в течение 30 минут на льду.
    Примечание: После инкубации в течение 30 мин на льду, он больше не является необходимым для защиты лизат от воздействия света, так как защита от свободных тиоловых групп является необратимым.
11. Удалить остатков клеток путем центрифугирования в предварительно охлажденный настольную центрифугу (13 000 XG, 4 ° C, 20 мин).
12. Равновесие диализных столбцы в буфере диализом (таблица 1) в холодном помещении при температуре 4 ° С в течение 20 мин во время стадии центрифугирования. Использование колонки с молекулярной массой от 10000.
    1. Прикрепите колонки к флоат буя и поместить их в стакан, наполненный диализного буфера. Для того, чтобы обеспечить осторожное перемешивание, используют магнитную мешалку. Не прикасайтесь к мембране.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Dialysкак столбцы могут быть приобретены или получены из 1,5 мл пробирки в соответствии с протоколом , описанным Фиала и его сотрудниками ^19.
13. Удалить столбцы из буфера диализ и поплавковой буем. Передача очищенных лизатов в подготовленную колонку диализной пипеткой, не касаясь мембраны. Прикрепите колонки к флоат буя и положил их обратно в стакан, наполненный диализного буфера.
14. Диализировать лизата в химический стакан , содержащий ледяной буфера для диализа (таблица 1) , по крайней мере 4 ч (или предпочтительно в течение ночи) при температуре 4 ° С при тщательном перемешивании с использованием магнитной мешалки. Использование по меньшей мере, 100 мл буфера для диализа в течение 200 мкл лизата.
15. Передача Диализованную пробу в 1,5 мл пробирку. Удалить преципитаты центрифугированием в настольную центрифугу (13 000 XG, 4 ° C, 20 мин). Для предотвращения диссоциации олигомерного белка комплексов продолжают с протоколом (раздел 2) сразу же после диализа. Не замораживатьподготовленные лизатов.

2. Электрофорез

Примечание: Электрофорез проводили , как описано ранее , с некоторыми изменениями ^22. В протоколе, описанном ниже, были использованы предварительно литые градиентные гели (4-15% градиент). В качестве альтернативы, гели можно приготовить в лаборатории. Очень важно, чтобы исключить какого-либо денатурирующего агента, такого как SDS, чтобы предотвратить диссоциацию олигомерных белковых комплексов. Время электрофореза был оптимизирован для различных олигомерных состояний человеческого белка МхА. Тем не менее, он может варьироваться для других белков, в зависимости от размера олигомеров комплекса, а также диапазон разделения, которая должна быть достигнута, чтобы проанализировать комплекс. Таким образом, оптимальное время электрофореза должны быть определены эмпирически. Для Оптимальное разрешение олигомеров необходимо проанализировать ток не должен превышать 25 мА.

1. Соберите гель PAGE без денатурации в гелевой камере. Заполните тон внутреннюю и внешнюю камеру с предварительно охлажденным рабочим буфером (таблица 1).
2. Предварительно запустить гель с заранее охлажденный проточном буфере при 25 мА на гель в течение 15 мин в холодном помещении при температуре 4 ° С.
3. Смешайте 15 мкл полученного выше лизатов с 5 мкл 4х буфера образца (таблица 1). Не кипятите образец.
4. Нагрузка 15 мкл образца и нативный стандартного белка выбора на геле. Выполнить гель при 25 мА в течение 4 ч в холодном помещении при температуре 4 ° С.
   Примечание: Для получения полуколичестветшых анализов, протокол Количественную оценку белка (например, анализ протеина по Брэдфорду ²³⁾ могут быть выполнены для того , чтобы обеспечить загрузку равных количеств общего белка на полосу.

3. Вестерн-блот

Примечание: Ниже описан протокол мокрой западной системы блоттинга. Любая промокательной мембрана может быть использована. Активировать поливинилиденфторид (PVDF) мембраны в 100% метанола, прежде чем уравновешивания в промокательной БУФФер. Полусухое западный метод блот может быть использован в качестве альтернативы, но должна быть оптимизирована для больших олигомерных комплексов.

1. Разберите гель и осторожно перенести его в SDS - буфере (таблица 1).
2. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре при осторожном встряхивании.
3. Подготовьте 2 губки, 4 листов бумаги фильтра целлюлозы и промокательной мембрану на гель. Замочите их в буфере для блоттинга (таблица 1).
4. Соберите бутерброд следующим образом (снизу вверх): 1 губка, 2 целлюлозные фильтры бумажные листы, мембраны, гель, 2 целлюлозы фильтровальной бумаги листов, 1 губка.
5. Положите бутерброд в промокательной бак. Убедитесь, что мембрана обращена к положительному полюсу, а гель сталкивается с отрицательным полюсом.
6. Заполните промокательную резервуар с предварительно охлажденном буфере блоттинга.
7. Пятно при 90 мА в течение ночи при 4 ° С для получения наилучших результатов переноса белков.
8. Разберите бутерброд и визуализировать стандарт белка путем инкубирования мембраны в PONÇEau S раствор в течение 5 мин при комнатной температуре.
9. Destain мембраны, тщательно смывая пунцовый S деионизированной водой, пока вы можете ясно видеть полосы белкового стандарта.
10. Отметьте полосы стандарта белка с помощью ручки.
    Примечание: Остаточное Понсо S может помешать иммунным. Чтобы избежать этого, мембрана может быть обесцвечивают далее путем инкубации в 0,1 М NaOH в течение 1 мин и последующей промывки деионизированной водой.
11. Блок мембраны блокирующим буфером (см таблицу 1) в течение не менее 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
12. Визуализируйте (ы) белка интереса иммунным окрашиванием с использованием антител, направленных против белка для анализа.
    Примечание: Белок MxA человек визуализировали с использованием кроличьих поликлональных антител , специфичных для человеческого MX1 разводили 1: 1000 в блокирующем буфере (таблица 1). Раствор антител инкубировали в течение ночи при температуре 4 ° С. В качестве альтернативы, моноклональноеNTI-MxA антитела (клон 143) , могут быть использованы (данные не показаны) ^24.

Results

Используя неденатурирующем PAGE, мы проанализировали олигомерного состояния дикого типа человека МхА, димерные интерфейс мутанты MxA (R640A) и MxA (L617D), а также мономерной интерфейса мутанта МхА (M527D) из клеточных лизатов ^12. Клетки лизируют в буфере , содержащем 1% октилфеноксиполиэтоксиэтанол (NP-40) и иодацетамид , чтобы обеспечить солюбилизацию белка и защиты свободных тиоловых групп (см рисунок 1). Как было описано выше, соли и небольшие метаболиты удаляли диализом ^19. ра...

Discussion

Здесь мы опишем простой метод, который позволяет быстрое определение олигомерных состояния белков, экспрессированных в клетках млекопитающих путем неденатурирующем ПААГ с последующим Вестерн-блот-анализа. Основное преимущество этого подхода состоит в том, что олигомерные состояние данного белка может быть определена из целых клеточных лизатов без очистки предшествующего белка. Это может быть важно для белков, которые олигомеризации или проявляют свою функцию, в сочетании со вспомогательными факторами. Кроме того, белки,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Диализные установки Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 мл	Thermo Fisher Scientific	69570	Предварительное равновесие в диализном буфере (при желательном удалении глицерина) Может быть изготовлен самостоятельно в соответствии с Fiala et al. 2011
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-луночный,	Bio-Rad	456-1083	Предварительный запуск в рабочем буфере для регулировки буферной системы
cOmplete, Mini, без ЭДТА	Roche	11836170001	использовать 1 таблетку на 50 мл
PBS, pH 7,4  разлить по 500 мл Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC надевайте перчатки и защищайте глаза
NativeMark Unstained Protein Standard  50µ l	Invitrogen	P/N 57030	загрузка 5 & l/well
A549 клетки	ATCC	ATCC CCL185	Выращивание в питательной среде (см. Таблица 1)
Клетки Vero	ATCC	ATCC CCL81	Выращивание в питательной среде (см. Таблица 1)
анти-Mx1 антитела	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Использование в разведении 1:1,000
ECL Antirabbit IgG, целое антитело, связанное с пероксидазой хрена (от donkey)	GE-Healthcare	NA934V	Использование в разведении 1:10,000
0,5% Трипсин-ЭДТА (1x)              Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Йодоацетамид   5 г	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4,5 г/л Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Стрептококк 100 х        100мл                            life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Глутамакс 100x Stock, 100 мл        life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, диализированная, США Происхождение 500 мл Gibco Лот:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Целлюлозная фильтровальная бумага	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  мембрана	GE-Healthcare	10600022
Tris(гидроксиметил)аминометан	Biosolve	0020092391BS
фторид натрия (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, без ЭДТА	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% раствор	Amresco	N907
DL-дитиотреитол (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
ортванадат натрия (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Глицерин	Sigma Aldrich	G7757
β-Глицерофоспат	Sigma Aldrich	G9422
Сухое молоко	Migros/Switzerland
Метанол	Millipore	1.06009
глорид натрия (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
хлорид магния (MgCl2)	Amresco	288
Додецилсульфат натрия (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
гидроксид натрия (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045