Визуальное стромул Частота с флуоресцентной микроскопией

Summary

Описаны протоколы исследования динамики стромопластных стромул, заполненных стромой канальцев, которые отходят от поверхности хлоропластов.

Abstract

Стромулы, или "канальцы, заполненные стромой", являются узкими, трубчатыми ответвлениями от поверхности хлоропласта, которые повсеместно наблюдаются в растительных клетках, но функции которых остаются загадочными. Наряду с растущим вниманием к роли хлоропластов в координации реакций растений на стресс, интерес к стромулам и их связи с динамикой передачи сигналов хлоропластов возрос в последние годы, чему способствовали достижения в области флуоресцентной микроскопии и белковых флуорофоров, которые позволяют быстро и точно визуализировать динамику стромул. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для анализа частоты стромоль в эпидермальных хлоропластах Nicotiana benthamiana, что является отличной модельной системой для исследования биологии стропул хлоропластов. Мы также предлагаем методы визуализации стропул хлоропластов in vitro путем извлечения хлоропластов из листьев. Наконец, мы описываем стратегии выборки и статистические подходы для анализа различий в частотах стромоль в ответ на стимулы, такие как стресс окружающей среды, химическая обработка или подавление экспрессии генов. Исследователи могут использовать эти протоколы в качестве отправной точки для разработки новых методов для инновационных экспериментов, чтобы изучить, как и почему хлоропласты производят стромолы.

Introduction

Хлоропласты — это динамические органеллы в растительных клетках, отвечающие за фотосинтез и множество других метаболических процессов. Сигнальные пути от хлоропластов также оказывают значительное влияние на физиологию и развитие растений, координируя реакцию растений на стресс окружающей среды, патогены и даже форму листьев^1-6. В последнее время биологи заинтересовались малоизученным аспектом структуры хлоропластов: стромулами, очень тонкими канальцами, заполненными стромой, которые отходят от поверхности хлоропласта⁷.

Биологические функции стромулов остаются неизвестными, хотя известно, что частота стромулов изменяе....

Protocol

Примечание: Для этого протокола, мы сосредоточились на опробование стромул частоту в эпидермисе N. benthamiana листья. Несколько устойчивых трансгенных линий были сформированы , которые могут быть использованы для этой цели, в том числе 35S _PRO: FNRtp: EGFP , ¹³ и NRIP1: Cerulean ^6. Обе эти линии показывают устойчивую экспрессию флуорофоров в хлоропласт строме листьев, выращенных в широком диапазоне условий. В качестве альтернативы, хлоропластов таргетингом флуорофоры могут быть выражены в скоротечно N. benthamiana с использованием Agrobacterium преобразований ^13. Это меньше , че....

Results

Этот протокол был использован для визуализации стромул частоту днем и ночью в семядолях молодых N. benthamiana рассады. Ломтики из z- стека были объединены в одно изображение (рисунок 1А). Для визуальных целей, что изображение было тогда ненасыщенный и перевернутый таким образом , что стромы появляется черный (рисунок 1В). Хлоропласты были помечены либо как не имеющие стромул (зеленая звездочка) или имеющие по меньшей мере один стромул .......

Discussion

При исследовании стромул, три важных фактора должны быть рассмотрены на протяжении: (I) манипуляции ткани растений должны быть сведены к абсолютному минимуму, (б) экспериментальная система должна быть последовательной, и (III) стратегии отбора проб должны быть тщательно спланированы, обеспечить надежные, воспроизводимые данные анализируются.

Стромул удивительно динамичным: они могут распространяться и быстро убирается перед глазами наблюдателя под микроскопом. Кроме того, стромул частота зна.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Сорбит	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп	Carl Zeiss Inc	Модель: LSM710
Карбоксифлуоресцеин диацетат (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Диметилсульфоксид (ДМСО)	EMD	MX1458-6
Блендер Waring		Модель: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Программное обеспечение с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений