Методическая статья

Визуальное стромул Частота с флуоресцентной микроскопией

DOI:

10.3791/54692

⸱

23 ноября 2016 г.

 ,  , 
1Plant Gene Expression Center, Agricultural Research Service, USDA, 2Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описаны протоколы исследования динамики стромопластных стромул, заполненных стромой канальцев, которые отходят от поверхности хлоропластов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стромулы, или "канальцы, заполненные стромой", являются узкими, трубчатыми ответвлениями от поверхности хлоропласта, которые повсеместно наблюдаются в растительных клетках, но функции которых остаются загадочными. Наряду с растущим вниманием к роли хлоропластов в координации реакций растений на стресс, интерес к стромулам и их связи с динамикой передачи сигналов хлоропластов возрос в последние годы, чему способствовали достижения в области флуоресцентной микроскопии и белковых флуорофоров, которые позволяют быстро и точно визуализировать динамику стромул. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для анализа частоты стромоль в эпидермальных хлоропластах Nicotiana benthamiana, что является отличной модельной системой для исследования биологии стропул хлоропластов. Мы также предлагаем методы визуализации стропул хлоропластов in vitro путем извлечения хлоропластов из листьев. Наконец, мы описываем стратегии выборки и статистические подходы для анализа различий в частотах стромоль в ответ на стимулы, такие как стресс окружающей среды, химическая обработка или подавление экспрессии генов. Исследователи могут использовать эти протоколы в качестве отправной точки для разработки новых методов для инновационных экспериментов, чтобы изучить, как и почему хлоропласты производят стромолы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хлоропласты — это динамические органеллы в растительных клетках, отвечающие за фотосинтез и множество других метаболических процессов. Сигнальные пути от хлоропластов также оказывают значительное влияние на физиологию и развитие растений, координируя реакцию растений на стресс окружающей среды, патогены и даже форму листьев1-6. В последнее время биологи заинтересовались малоизученным аспектом структуры хлоропластов: стромулами, очень тонкими канальцами, заполненными стромой, которые отходят от поверхности хлоропласта7.

Биологические функции стромулов остаются неизвестными, хотя известно, что частота стромулов изменяется в ответ на стимулы окружающей среды7-9, и стромулы могут быть способны передавать сигнальные молекулы между органеллами6. Все типы пластид (не только зеленые, фотосинтезирующие хлоропласты, но и прозрачные лейкопласты, амилопласты, наполненные крахмалом, и пигментированные хромопласты, если назвать несколько типов пластид) образуют стромулы, и стромолы обнаружены во всех видах наземных растений, которые были исследованы до настоящего времени. Стромулы могут динамически расширяться и втягиваться, появляясь или исчезая в течение нескольких секунд, или они могут оставаться относительно неподвижными в течение длительного времени. Одним из основных препятствий, с которыми сталкиваются биологи стромул, является то, что стромулы часто изучаются с использованием совершенно разных методов, тканей и видов, что затрудняет сравнение литературы по биологии стромул. В будущем стандартные методы и подробные описания экспериментальных систем, используемых для изучения стромул, будут иметь решающее значение для открытия функции этих вездесущих особенностей морфологии хлоропластов.

Здесь мы описываем методы визуализации образования стромул в эпидермальных хлоропластах листьев Nicotiana benthamiana. В мезофилле хлоропласты плотно упакованы в большие трехмерные клетки, что затрудняет точную и быструю визуализацию стромол с помощью конфокальной микроскопии. Напротив, эпидермальные клетки относительно плоские, содержат меньше хлоропластов и находятся на поверхности листа, что позволяет легко и быстро визуализировать стромулы. N. benthamiana является идеальной модельной системой для этих экспериментов, потому что, в отличие от многих видов растений, все клетки эпидермиса N. benthamiana производят хлоропласты10. В эпидермисе большинства растений, включая Arabidopsis thaliana, только устьичные защитные клетки имеют хлоропласты, в то время как другие эпидермальные клетки имеют «лейкопласты», пластиды, которые являются прозрачными, относительно аморфными и нефотосинтезирующими9,11,12. Таким образом, в то время как в одном поле зрения эпидермиса A. thaliana может быть всего несколько хлоропластов в паре защитных клеток, поле зрения эпидермиса N. benthamiana будет включать десятки или даже сотни хлоропластов. Однако все описанные здесь методы могут быть модифицированы для исследования других вопросов биологии стромул; например, мы использовали тот же подход для изучения лейкопластных стромол A. thaliana9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Для этого протокола, мы сосредоточились на опробование стромул частоту в эпидермисе N. benthamiana листья. Несколько устойчивых трансгенных линий были сформированы , которые могут быть использованы для этой цели, в том числе 35S PRO: FNRtp: EGFP , 13 и NRIP1: Cerulean 6. Обе эти линии показывают устойчивую экспрессию флуорофоров в хлоропласт строме листьев, выращенных в широком диапазоне условий. В качестве альтернативы, хлоропластов таргетингом флуорофоры могут быть выражены в скоротечно N. benthamiana с использованием Agrobacterium преобразований 13. Это меньше , чем идеал трансгенных линий, так как Agrobacterium инфильтрацию вызывают некоторые базальные защитных реакций в N. benthamiana и взаимодействия с Agrobacterium может изменять частоту стромул в листе 14, потенциально усложняя интерпретацию результатов. И, наконец, визуализировать стромул образование в пробирке,Хлоропласты могут быть извлечены из любых видов растений, с использованием либо генетически кодируемых флуорофоры или флуоресцентный краситель, как описано в разделе 5 ниже. 9,15

Примечание:. Подробные методы выращивания растений были описаны ранее 16 Вкратце, растут N. benthamiana растения в 4 -х "горшочки , наполненные какой - либо профессиональной почвенную смесь , которая обеспечивает хороший дренаж. Покрыть рассаду с прозрачным пластиковым куполом в течение первых 10-14 дней , чтобы обеспечить влажную среду для прорастания. Добавление любого стандартного смеси удобрений в соответствии с инструкциями производителя по 14- дневного возраста растения. выращивать растения под белым светом, используя ~ 100 мкмоль фотонов м -2 сек -1 интенсивность света. Водные растения регулярно.

1. Подготовка образцов листьев для визуализации

Примечание: динамика стромул страдают от ранив 8, поэтому препарат ткани следует проводить непосредственно перед визуализируя стромулс помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. В идеале, выборка должна быть визуализированы с 15 мин после снятия с завода.

  1. Вырезать небольшой участок листа с помощью очень острым лезвием бритвы. Всегда используйте один и тот же участок листа для консистенции, и быть уверенным, чтобы визуализировать ту же поверхность (адаксиальная или абаксиальный) во всех экспериментах.
  2. Сразу же после отрезания секции листа, погрузить раздел листьев в 5 мл безыгольного шприца, наполненного водой, удалить воздух из шприца, и применять вакуум путем покрытия шприца отверстие пальцем и потянув поршень.
    1. Отпустите поршень осторожно, чтобы не повредить участок листа. Повторите это два или три раза, или пока большая часть воздуха не был удален, и лист, как представляется, темно-зеленый.
      Примечание: Этот шаг удаляет воздух в листе, которые могут помешать точной визуализации стромул.
  3. Добавить каплю воды на предметное стекло и поместите раздел лист на этой капли. Затем добавьте еще один ДрОп воды в верхней части листа, и место покровное стекло над листом. Если есть какие-то пузырьки воздуха, слегка постучите покровное, пока они не будут удалены. Ползун теперь готов к микроскопии, а также должны быть визуализированы немедленно.

2. Визуализация стромул с конфокальной флуоресцентной микроскопии

  1. С проходящем свете, фокус на поле зрения вблизи центра участка листа (от клеток, поврежденных лезвие бритвы). Используйте объектив 20X, так что многие хлоропласты могут быть визуализированы одновременно. Сохранение изображения с пропускаемого света таким образом, чтобы типы клеток можно отличить позже, если это необходимо.
  2. Включите источник освещения для лазера с соответствующими возбуждения и эмиссии фильтров для использования флуорофор. Например, возбуждают GFP с 488 нм лазером и собирать выбросы между 500 нм и 525 нм.
    1. Использование ПО микроскопа, выберите канал GFP и нажмите, чтобы отрегулировать обскуры диафрагму 1 Aiчень блок. Выберите лазерное сканирование, чтобы начать визуализировать образец, а затем нажмите на канал GFP для регулировки интенсивности лазерного излучения и усиления детектора, чтобы минимизировать мощность лазера в то же время четко визуализировать стромул. После того, как эти параметры были определены, держать их как можно более последовательными во всех экспериментах.
  3. Приготовьте г -stack эксперимент , который будет собирать серию изображений через эпидермы листьев в поле зрения.
    1. Для г -stack, включают в себя все эпидермальные хлоропластов в поле зрения , чтобы избежать смещения (например, если хлоропласты вблизи поверхности листа имеют больше стромул при условиях испытания).
    2. Возьмите изображения на максимальный интервал возможно , что будет включать в себя все стромул но сводят к минимуму время , необходимое для г -stack. Например, если 1 Эри единица эквивалентна секции конфокальной в фокусе, который глубоко 2 мкм, принимая изображение каждые 2 мкм, вероятно, идеальным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лист epidermis является неровная поверхность, таким образом, общая глубина г -stack будет варьироваться в зависимости от образца; В большинстве Z -stacks потребует 10-20 изображений, но может включать в себя больше.
    3. Отрегулируйте скорость сканирования и разрешение изображения по мере необходимости , чтобы убедиться , что г -stack собирают быстро (обычно в течение 5-10 мин, если это возможно). Сохраните г -stack для последующего анализа.

3. Обработка изображения

  1. Определить стромул частоту с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений. Для этого протокола, мы рекомендуем использовать ImageJ, который публично доступен из Национальных институтов здравоохранения (http://imagej.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj) или популярной модернизации ImageJ, Фиджи (http://fiji.sc /Фиджи).
  2. Слияние г -stack в одно изображение с использованием максимальной проекции интенсивности в программном обеспечении.
  3. Определить и вручную пересчитать все хлоропласты в изображении.
  4. Для каждого хлоропластов, визуально определить, действительно ли один или несколько стромулрассматриваются простирается от хлоропластов в объединенном Z -stack изображения. Для примера смотрите рисунок 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку биологические функции стромул не известны, любой тонкий, стромы заполненный, трубчатое продолжение от хлоропластов можно считать "стромул", независимо от их длины. Как правило, стромы заполненные расширение из хлоропласта является стромул , если оно меньше , чем примерно 1 мкм в диаметре вдоль большей части ее длины 7. Убедитесь в том, что один человек анализирует все изображения для контроля за субъективных различий в определении того, является ли или нет хлоропласта в стромул. Второй исследователь должен самостоятельно проверить частоты стромул для дальнейшего снижения субъективных предубеждений.

4. Экспериментальный дизайн и отбор проб

Примечание: стромул частота сильно варьирует между листьями, но несколько сообщений предполагают, что есть небольшое изменение в стромул частоты в пределах Indiviдвойного листа 9,17.

  1. Вычислить частоту листьев стромул из одного поля зрения одного листа. Выбросите лист, и рассмотреть это независимый образец. Не рассматривать отдельные поля зрения с одного листа в качестве независимых выборок.
    Примечание: Там нет сильного консенсуса о том, как лучшие изменения в стромул мера активности, и до тех пор пока функция стромул не более четко определены, исследователи должны продолжать проявлять творческий подход в количественной оценки динамики стромул. Для сравнения по литературе, однако, использовать общие стандарты отчетности должны быть использованы в дополнение к более творческих подходов. Как минимум, всегда сообщать частоту хлоропластах, которые имеют один или более стромул.
  2. Определить частоту хлоропластов, которые имеют стромул в поле зрения. Используйте ImageJ для идентификации всех хлоропластов в поле зрения. Затем для каждого хлоропластов, определяют хлоропластов сформировал ли по крайней мере один стромул. Частота стромул Доклад как PercentaGE хлоропластов с стромул.
    Примечание: Некоторые исследователи преобразовать процент, например, с помощью преобразования арксинуса, прежде чем сообщать частоты стромул; в то время как это вариант для статистического анализа, арксинус стромул частоты не является интуитивно понятным значение, и не нужно сообщать в основном тексте или фигур исследования.
    1. В качестве альтернативного подхода, подсчитать общее количество стромул, и разделить его на общее количество хлоропластов.
      Примечание: В большинстве случаев, это даст аналогичные результаты подойти 4.2; он может переоценить частоту стромул, однако, если один хлоропласт сформировал много стромул. В примере, показанном на основании репрезентативных результатов, например, несколько хлоропласты имеют два или более стромул, в результате чего число стромул в хлоропластах до 40/87 (по сравнению с частотой стромул от 33/87).
    2. В качестве альтернативы, определить длину стромул вместо стромул частоты. Длина может быть измеренав ImageJ путем отслеживания стромул с ручным инструментом линии.
      Примечание: Так как биологическая роль стромул остается неизвестным, не ясно, что стромул длина влияет на их функцию. Данные о существенных различий в стромул длины, если они наблюдаются, но также сообщают частоты стромул (как описано в разделе 4.2).
      Примечание: стромул частота может быть сильно варьирует среди различных листьев в тех же условиях роста. Поэтому, хотя определения частоты стромул может отнимать много времени, эксперименты должны быть тщательно разработаны, чтобы включать в себя большие размеры выборки. Использование наборов данных из нашей лаборатории, мы установили, что размер выборки, по меньшей мере, 16 растений для каждой обработки, как правило, достаточно мощным, чтобы определить, имеется ли статистически значимое различие по меньшей мере, 1,5-кратное изменение стромул частоты между двумя условиями (со стандартными α = 0,05 и β = 0,80).
  3. Статистический анализ результатов.
    1. Для сравнения меняА.Н. стромул частоты двух обработок, используют т тест Уэлч (также известный как гетероскедастических т тест или тест т , предполагающей неравную дисперсию).
      Примечание: Этот тест не является столь мощным , как т тест обычном Стьюдента, а т тест Уэлша является предпочтительным , так как он не предполагает , что дисперсия в стромул распределения частот аналогично между обработками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку стромул частота является "доля", ее распределение выборки по прогнозам, будет биномиальное, а не нормальное, который теоретически мог бы перекоса статистический анализ, если размеры выборки очень малы или если стромул частота очень низкая (около 0%) или очень высокий (около 100%). В некоторых докладах использовали арксинус преобразования до того статистического анализа, который предназначен для преобразования биномиального распределения к нормальному распределению, и , таким образом , удовлетворяют требованиям стандартов т теста Стьюдента или ANOVA с. На практике, однако,rcsine преобразования имеют мало или вообще не оказывает влияния на статистическом анализе, и поэтому не рекомендуется. Вместо того, чтобы повторить эксперименты, чтобы увеличить размер выборки, что позволит повысить статистическую мощность и уменьшить количество ошибок в интерпретации данных.
    2. Независимо статистический подход используется, не забудьте тщательно сообщать стратегии выборки, размер выборки, статистический тест, р значение для каждого эксперимента.
      Примечание: Как и в других областях биологии, значение р меньше 0,05 можно считать «статистически значимым», хотя исследователи , безусловно , должны сообщить точное значение , полученное р. Если р чуть выше 0,05, как увеличение размера пробы с двумя или тремя экспериментами может помочь выяснить , является ли или нет воспроизводима и статистически значимое различие наблюдалось.

5. Извлечение интактные хлоропласты визуализировать стромул Dynamics

Примечание: Существует несколько методовбыли использованы для выделения хлоропластов из листьев, в том числе несколько иной протокол в недавнем исследовании стромул образования в пробирке 15. Протокол подробно описаны ниже использует относительно простой метод , который не уступает биохимически чистых образцов хлоропластов, но вместо того, чтобы изолировать большое количество неповрежденных, здоровых хлоропластов 9,18.

  1. Подготовка холодного буфера для экстракции: 50 мМ Hepes - NaOH, 330 мМ сорбита, 2 мМ ЭДТА, 1,0 мМ MgCl 2, и 1,0 мМ MnCl 2. Доводят рН до 6,9 с помощью NaOH и HCl, и хранить в холодильнике перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, нет необходимости, используя холодные буферы и хранение проб на льду, когда это возможно даст более высокую долю интактных хлоропластов.
  2. Готовят изолирующий буфер: 50 мМ Hepes NaOH, 330 мМ сорбита, 2 мМ ЭДТА, 1,0 мМ MnCl 2, 1,0 мМ MgCl 2, 10 мМ КСl, и 1,0 мМ NaCl. Доводят рН до 7,6 с NaOH и HCl и охладите перед использованием.
  3. Если листья не являютсяэкспрессирующих генетически кодируемой стромы флуорофор, готовят карбоксифлуоресцеин диацетат раствор (CFDA): 50 мМ CFDA исходного раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) (2,3 мг CFDA на 1,0 мл ДМСО).
    Примечание: точная концентрация не имеет решающего значения. Держите CFDA запас в темноте во все времена. Хранить небольшие аликвоты 50 мМ CFDA при -20 ° С.
  4. Для того, чтобы выделить хлоропласты, удалить ~ 5-10 г листьев из нескольких растений и кратко промыть в холодной воде. Немедленно передать в 50 мл буфера для экстракции холодной. Измельчить листья с помощью блендера с несколькими короткими импульсами. Смесь фильтруют через два-три слоя марли, чтобы удалить твердые частицы листьев, делят распакованные хлоропласты в две 50 мл центрифужные пробирки и центрифуги в течение 1 мин при 750 х г.
  5. Удалите супернатант и ресуспендируют зеленые хлоропласты в буфере изоляции 10 мл. Центрифуга снова в течение 1 мин при 750 мкг, отбросить супернатант и ресуспендирования хлоропласты в буфере изоляции довести конечный объем до 5 мл.
  6. Передача 201, л хлоропластов на слайде, крышка с покровное и начать микроскопии.
    Примечание: хлоропласты из трансгенных растений, экспрессирующих пластид-мишенью флуоресцентные белки теперь готовы к визуализации с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.
  7. Пятно хлоропластов из растений, которые не выражающие пластид-мишенью флуоресцентные белки для визуализации стромул.
    1. Добавьте 5 мкл 50 мМ CFDA запаса до 5 мл хлоропластов суспендируют в буфере изоляции. Довести конечную концентрацию до 50 мкМ.
    2. Разрешить хлоропласты инкубировать в течение 5 мин, а затем передать небольшую аликвоту (~ 50 мкл) на слайд, накрыть покровным и начать микроскопии.
    3. Используйте FITC или GFP набор фильтров. Используйте объектив 20X, чтобы визуализировать много хлоропластов одновременно, или более высокую цель для визуализации одной изолированной хлоропласты.
      Примечание: CFDA будет флуоресцировать внутри стромы интактных хлоропластов.
    4. Если есть сильный фон флуоресценции, моют Chloroplasts снова в 10 мл буфера изоляции после 5-минутной инкубации с CFDA, центрифуге в течение 1 мин при 750 мкг, отбросить супернатант и ресуспендируют в 5 мл буфера изоляции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был использован для визуализации стромул частоту днем и ночью в семядолях молодых N. benthamiana рассады. Ломтики из z- стека были объединены в одно изображение (рисунок 1А). Для визуальных целей, что изображение было тогда ненасыщенный и перевернутый таким образом , что стромы появляется черный (рисунок 1В). Хлоропласты были помечены либо как не имеющие стромул (зеленая звездочка) или имеющие по меньшей мере один стромул ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При исследовании стромул, три важных фактора должны быть рассмотрены на протяжении: (I) манипуляции ткани растений должны быть сведены к абсолютному минимуму, (б) экспериментальная система должна быть последовательной, и (III) стратегии отбора проб должны быть тщательно спланированы, обеспечить надежные, воспроизводимые данные анализируются.

Стромул удивительно динамичным: они могут распространяться и быстро убирается перед глазами наблюдателя под микроскопом. Кроме того, стромул частота зна...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.O.B. и A.M.R. были поддержаны преддокторскими стипендиями от Национального научного фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HepesSigma-AldrichH3375
NaOHFischer-ScientificS320-1
СорбитSigma-AldrichS1876
EDTAFischer-BiotechBP121
MnCl2Sigma-Aldrich221279
MgCl2Sigma-AldrichM0250
KClSigma-AldrichP3911
NaClSigma-AldrichS9625
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Carl Zeiss IncМодель: LSM710
Карбоксифлуоресцеин диацетат (CFDA)Sigma-Aldrich21879 
Диметилсульфоксид (ДМСО)EMDMX1458-6
Блендер Waring Модель: 31BL92
Fijifiji.scПрограммное обеспечение с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
  2. Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).
  3. Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata. Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).
  4. Nomura, H., et al. Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis. Nat. Commun. 3, 926(2012).
  5. Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).
  6. Caplan, J. L., et al. Chloroplast stromules runction during innate immunity. Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).
  7. Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function. Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).
  8. Gray, J. C., et al. Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid. Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).
  9. Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).
  10. Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants. Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).
  11. Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis. Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).
  12. Chiang, Y. -H., et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis. Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).
  13. Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics. Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).
  14. Erickson, J. L., et al. Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays. BMC Plant Biol. 14 (1), 127(2014).
  15. Ho, J., Theg, S. M. The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana. PLoS One. 11 (2), e0146489(2016).
  16. Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).
  17. Schattat, M. H., Klösgen, R. B. Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11, 115(2011).
  18. Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).
  19. Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell. Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Nicotiana benthamiana

Похожие статьи