Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

порождающий

8.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54697

⸱

25 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем метод нового для генерации антиген-специфические Т-клеточные рецепторы (TCR) путем спаривания TCRα или TCR & beta существующего TCR, обладающих антигенной специфичности интересов, с дополнительным hemichain репертуара клеточных рецепторов периферических Т. В De Novo , сгенерированные ТКО сохраняют антиген-специфичность с различной аффинностью.

Аннотация

Т-клеточные рецепторы (TCR), которые используются в клинике, чтобы направить специфичность Т-клеток целевых опухолей в качестве перспективного механизма иммунотерапии. Таким образом, клонирование ТКР специфические для различных ассоциированных с опухолью антигенов было целью многих исследований. Для того, чтобы вызвать эффективный Т-клеточный ответ, ТКС должен распознавать антиген-мишень с оптимальной сродства. Тем не менее, клонирование таких ТКО было проблемой, и многие доступны ТКО обладают субоптимальную сродством к родственным антигеном. В этом протоколе мы опишем метод клонирования De Novo высоким сродством антиген-специфические ТКО с использованием существующих ТКО за счет использования hemichain Centricity. Известно, что для некоторых ТКР, каждый TCRα или TCR & beta; hemichain не способствуют в равной степени к распознаванию антигена, и доминирующий hemichain упоминается как Центрическая hemichain. Мы показали, что путем спаривания Центрическая hemichain с ответными цепями, отличающимися от исходного контр-цепи, мы можем поддерживать антиген Specificity, в то время как модулировать свои силы взаимодействия для родственного антигена. Таким образом, терапевтический потенциал данного TCR может быть улучшена за счет оптимизации спаривание между центрированных и счетчик hemichains.

Введение

Т-клеточные рецепторы (TCR) являются гетеродимерные адаптивные иммунные рецепторы, выраженные Т-лимфоциты, состоящие из цепи TCRα и TCR & beta;. Они генерируются с помощью соматической перегруппировки V (D) J сегментов гена, который производит чрезвычайно разнообразный репертуар, способных распознавать практически неограниченные конфигурации по HLA / пептидных комплексов. Клинически, Т - клетки , сконструированные для экспрессии клонотипическим ТКР , специфичные к опухолевым антигенам, продемонстрировали эффективность в различных раковых заболеваний 1. Тем не менее, многие ТКР клонированные для этой цели не обладают достаточной аффинностью к интересующему антигену, что ограничивает их терапевтическое применение.

Здесь мы опишем метод, чтобы преодолеть это ограничение для существующих ТКО за счет использования цепи Ориентированность. Сообщалось , что один TCR hemichain мог бы играть более доминирующую роль в признании антигена - мишени 2, здесь называют Centricity. Хрустальные структурные анализы показали, что один Centrichemichain из TCR может объяснить большинства след на MHC / пептид 3,4. Используя эту концепцию, ранее мы показали , что SIG35α TCRα может спариваться с разнообразным репертуаром TCR & beta ; цепей и поддерживать реактивность против MART1 27-35 пептида , представленного HLA-A2 5. Аналогичные результаты были получены с TAK1 TCR, где Центрическая TCR & beta ; hemichain сопряженным с различными цепями TCRα и обслуживаемой реакционной способностью по отношению к WT1 235-243 пептида , представленного HLA-A24 6. Оба MART1 и WT1, являются ассоциированные с опухолью антигены. Сеть Ориентированность был также применен для изучения распознавания антигена CD1d-ограниченных инвариантных натуральных киллеров (iNKT) ТКР, соединяя инвариантную Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα цепь ТКР iNKT человека с различными Vβ11 цепей TCR & beta ; 7.

Во всех случаях мы смогли сформировать заново репертуар ТКР по трансducing Центрическая TCR hemichain к Т-клеток периферической крови, где введена hemichain спаренных с эндогенным TCRα или TCR & beta; контр-цепей. По существу, ориентированный hemichain служит в качестве приманки, которые могут быть использованы для идентификации соответствующих встречные цепи, которые при сопряжении вместе образуют ТКО, которые поддерживают антигенную специфичность интерес, но различных по сродству. Из этих новых репертуаров, мы были в состоянии изолировать клонотипичной ТКО с улучшенной прочностью взаимодействия против антигена-мишени по сравнению с уже существующими ТКО. Поэтому мы считаем, этот метод ускорит трубопровод определения оптимальных ТКО для клинического применения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Ретровирусное Construct Кодировка TCR Hemichain Интереса

  1. Линеаризацию Рмх вектор, чтобы позволить вставку гена TCR в последующих стадиях. Гидролизуют плазмидной ДНК с помощью ферментов рестрикции EcoRI и NotI при температуре 37 ° С в течение 3 часов (таблица 1) 8.
  2. Провести электрофорез расщепленной плазмиды на 1,2% агарозном геле. Акцизной полосу примерно 4500 пар оснований (БТС), и элюат в 30 мкл стерильной воды с использованием коммерчески доступных наборов для экстракции геля 9.
  3. Дизайн 5 'и 3' праймеры для гена TCR интереса , который также закодировать 15-20 базисных пунктов перекрывающихся переваривания сайт EcoRI и NotI из рМХ вектора соответственно 8.
  4. Amplify гена TCR с праймеров. Проводят электрофорез продукта ПЦР и элюции полосу примерно 1000 бод, как описано на стадии 1.2.
  5. Клонирование гена TCR в переваренной вектор, комбинируя каждый линейный фрагмент с коммерчески доступной плазмидысборка мастер-реагента смесь и инкубирования при 50 ° С в течение 1 ч.
    Примечание: Обратитесь к протоколу производителя для относительных объемов каждого компонента. Этот метод сборки основан на методике , впервые описанной Gibson и др. 10.
  6. (Необязательно) ген Tag TCR к Марку трансдуцированных клеток с усеченной формой человеческого нерва рецептора фактора роста (ΔNGFR, аминокислоты 1-277) 11 , разделенных Фурин сайта расщепления, серин-глицин линкера, и 2А Последовательность из 12,13. Дизайн праймеров последовательности, кодирующие перекрывающие концы фрагмента и монтируем плазмиды, как описано в пунктах 1.3-1.5.
    Примечание: Эти последовательности можно найти в ссылках 11-13.
  7. Transform химически компетентную E. палочка с собранной плазмиды следующим протоколом производителя 14. Семенной трансформированных бактерий на чашках с агаром (20 мг / мл лизогении бульона (LB), 15 мг / мл агара и 1 мкг / мл ампициллина) и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 18 часов.
  8. Культура одна бактерия колонии в 50 мл LB-среды (20 мг / мл LB и 1 мкг / мл ампициллина) в течение 16 ч в качалке инкубаторе при температуре 37 ° С и 200 выстрелов в минуту.
  9. Очищают плазмид с использованием коммерчески доступных наборов midiprep в соответствии с протоколом производителя. Развести плазмиды в концентрации около 1 мкг / мкл.
    Примечание: Протокол очистки плазмидной основан на методе щелочной экстракции 15.

2. Создание прочной упаковке клеточной линии

ПРИМЕЧАНИЕ: Оба 293GPG и PG13 клетки являются приверженцем. Культура клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS) и 50 мкг / мл гентамицина. Культура 293GPG клетки с 1 мкг / мл тетрациклина, до трансфекции. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO 2 между всеми шагами.

  1. Трансфекцию 293GPG упаковочные клетки , культивированные в 16 T75 колбе с вектором hemichain-кодирования , полученного на стадии 1.9, USIнг коммерчески доступного реагента для трансфекции в соответствии с протоколом производителя 1 7. Примечание: трансфекцию 293GPG клетки на 50-60% сплошности.
  2. Отберите среда для 293GPG клеток и добавляют 10 мл свежей DMEM среда 1 день после трансфекции.
  3. Урожай скоротечно получают вирус от трансфицированных клеток 293GPG 2 дня после того, как шаг 2.2 путем переноса культуральной среды в шприц и проходящий через фильтр 0,45 мкм.
    Примечание: Вирус можно использовать сразу или хранить при -80 ° С для последующего использования.
  4. Культура 1 х 10 5 PG13 клеток в T25 колбу. Граф клеток с использованием гемоцитометра. После того, как один день, аспирация культуральной среды и добавляют 1,5 мл 293GPG-производного вируса с шага 2,3 и 1,5 мл DMEM среды, вместе с 8 мкг / мл полибрена.
  5. Изменение среды, как описано в пункте 2.4 один раз в день в течение 4-х дней, чтобы установить стабильное PG13 линию упаковывающих клеток, продуцирующих ретровирус, кодирующие TCR hemichain интерес.
  6. Отберите средних и заменитьсо свежей средой DMEM для линий PG13 клеток 24 ч после последней инфекции для дальнейшей культуры.
    Примечание: Замораживание или субкультура клеток путем разъединением с 0,05% раствором трипсина-ЭДТА.
  7. Для того, чтобы производить вирус из клеточных линий , трансдуцированных PG13, культуру 2 х 10 6 клеток в T75 колбу с 10 мл среды DMEM и вирус урожая , как это описано в шаге 2.3 через три дня после посева клеток.
    Примечание: Вирус лучше всего использовать сразу, но можно хранить при температуре -80 ° С в течение до двух месяцев.

3. Активация и трансдукция человеческих Т-клеток

Примечание: Человеческие образцы получены и использованы в соответствии с институциональными комитет по этике утвержденных протоколов. Культура первичные клетки человека в Roswell Park Memorial института (RPMI) среде с добавлением 10% сыворотки крови человека вместо FCS и 50 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO 2 между всеми шагами.

  1. Isolate человека мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от плотностиГрадиент разделения в соответствии с протоколом изготовителя 18.
  2. Активация Т-клеток, чтобы индуцировать пролиферацию, необходимое для ретровирусной инфекции. Культура 2 х 10 7 свежей или оттаивают РВМС на лунку в 6-луночные планшеты, в 5 мл RPMI среде с 100 МЕ / мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека (рИЛ-2) и 50 нг / мл анти-CD3 моноклональными антителами (клон ОКТ3).
  3. Три дня после стимуляции, собирают Т-клеток с помощью пипетки и центрифуги при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и семян 0,5-1 × 10 6 Т - клеток на лунку в 24-луночный планшет , ресуспендировали в 1 мл вируса PG13 от стадии 2.7, и 1 мл RPMI среде , дополненной 200 МЕ / мл рИЛ-2. Центрифуга пластины при 1000 х г и 32 ° С в течение 1 часа.
  4. Через 24 часа собирают Т-клетки, с помощью пипетки и центрифуге при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл вируса PG13 от стадии 2.7, и 1 мл RPMI среде, дополненной 200 МЕ / мл рИЛ-2. Повторите этот шаг для в общей сложности 6 Infectионов.
    Примечание: Количество инфекций должна быть оптимизирована в зависимости от титра вируса, полученного путем упаковки клеточной линии. При необходимости, проход Т-клетки путем удаления 20-30% клеток, каждый день, чтобы предотвратить чрезмерно быстрый рост.
  5. 24 ч после последней инфекции, Т-клетки собирают пипеткой и центрифуге при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в RPMI среде с 100 МЕ / мл рИЛ-2 для дальнейшей культуры.
  6. Через 2-3 дня после шага 3.5, пятно Т-клеток с HLA мультимеру при 4 ° С в течение 30 мин, а затем анти-CD3 человека и сорецептора моноклональные антитела (МАт) при 4 ° С в течение 15 мин. Анализ с помощью проточной цитометрии. Используйте ненужную мультимер и / или untransduced клетки в качестве отрицательного контроля (Рисунок 1 - 3) 19.
  7. Если введенный ориентированных hemichain является TCRα цепь, анализировать использование Vβ из De Novo мультимеров положительных клеток с использованием коммерчески доступного Vβ специфичную панели антител с помощью проточной цитометрии 20.

4. Клонирование De Novo TCR Counter-hemichains

  1. Сортировка De Novo мультимеров положительное населения на этапе 3.6 с помощью проточной при содействии сортировки клеток.
  2. Изолировать РНК из отсортированных Т - клеток с использованием кислоты гуанидина тиоцианата-фенол-хлороформ методом экстракции 21,2 2.
    Примечание: РНК можно хранить при температуре -80 ° С, но их следует использовать для генерации кДНК как можно скорее.
  3. Обобщить библиотеки кДНК из экстрагированной РНК с использованием коммерчески доступных наборов обратной транскриптазы-PCR в соответствии с протоколом производителя 23,24.
  4. Если клонирование TCR & beta; встречные цепи, дизайн ген Vβ и TCR & beta; константная область специфических праймеров, как определено на этапе 3.7, и клонировать полнометражных гены TCR & beta; как описано в пунктах 1.3-1.9. См шаг 4.5, если встречное цепь TCRα, в противном случае переходите к шагу 5.1.
  5. Коммерчески доступные Vα-специфические антитела ограничены, таким образом, использование гена Vα не можетопределяется с помощью проточной цитометрии. Клон TCRα контр-цепи с помощью 5'-быстрой амплификации концов кДНК (RACE) 25, с использованием коммерчески доступного 5 'RACE комплекты 6.
    1. Обобщить 5 'RACE совместимую кДНК из РНК, выделенной на этапе 4.2 в соответствии с протоколом производителя.
    2. Выполнить 1 - й раунд ПЦР , как описано в таблице 2.
    3. Проводят электрофорез продукта ПЦР и элюции полосу примерно 1100 бод, как описано в пункте 1.2.
    4. Выполнение 2 - го тура ПЦР , как описано в таблице 3, с использованием 1 - й тур ПЦР - продукт в качестве матрицы.
      Примечание: Последовательности праймеров , показанные под таблице 3 были разработаны для клонирования в EcoRI и NotI расщепляли PMX вектор.
    5. Проводят электрофорез продукта ПЦР и элюции полосу примерно 1000 бод, как описано в пункте 1.2.
    6. гены клонов TCRα в EcoRI и NotI расщепляли вектор PMX и пуриFY плазмид, как описано в пунктах 1.5-1.9.

5. воссоздании новый антиген-специфические TCR Клоны

Примечание: Культура Jurkat 76 клеток и последующие клеточные линии в RPMI среде с добавлением 10% FCS и 50 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO 2 между всеми шагами.

  1. Трансдукции Jurkat 76 ячеек 26 (или эквивалент TCR - / - Т - клеточной линии человека) с центрической TCR hemichain с использованием вируса 293GPG , полученного на стадии 2.3. Для Jurkat 76 семян 5 х 10 4 клеток на лунку в 24-луночный планшет с 1 мл вируса и 1 мл RPMI среды. Центрифуга пластины при 1000 х г и 32 ° С в течение 1 часа.
  2. 24 ч после заражения, собирают hemichain трансдуцированная Jurkat 76 клеток с помощью пипетки и центрифуги при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют в свежей среде RPMI для дальнейшей культуры.
  3. Очищают трансдуцированных клетки, если hemichain молекулярно помечены 2-3 дня после того, как шаг 5.2, с помощью окрашиванияING с флуорофором , конъюгированные анти-NGFR мАт с последующим потоком при содействии или магнитно-помощь сортировки клеток ( по желанию) 27.
  4. Следующие шаги 2.1 до 2.3, производят вирус 293GPG, кодирующий ТКР встречное цепь, клонированного из шагов 4.4 или 4.5.
  5. Для того, чтобы полностью восстановить ТКР, трансдукции Т-клеточной линии, стабильно экспрессирующие TCR центрическую hemichain генерируется на этапах 5.1-5.3 с использованием вируса с шага 5.4. Выполните трансдукции, как описано в пунктах 5.1-5.2.
  6. Очищают CD3 + трансфектантов с помощью анти-CD3 магнитной помощь сортировкой клеток в соответствии с протоколом производителя, через 2-3 дня после шага 5.5 27.
  7. Для проверки антигенную специфичность, испачкать трансфектантов, выражающие клонотипическим ТКО, состоящие из Центрическая TCR hemichain сопряженным с различными противоионами цепями, с анти-CD3 и / или моноклональными сорецептора и HLA мультимеру, 3-5 дней после очистки CD3. Анализ клеток с помощью проточной цитометрии (рис 4 - 5) 19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Без предварительного знания которых hemichain является цепью ориентированных, цепь TCRα и TCR & beta ; должен быть отдельно клонировали и трансдуцированная в периферической крови Т - клеток, что и было сделано в случае HLA-А24 / WT1 реактивная TAK1 TCR (рисунок 1). Трансдукция TAK1β дали заметно более высокую частоту антиген-специфических Т-клеток. С другой стороны , трансдукция не-центрической hemichain не уступал De Novo мультимеров положительных Т - клето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Первое требование для успешного применения этого метода является достижение достаточной эффективности трансдукции первичных Т-клеток с hemichain интереса. По нашему опыту, сочетание использования PG13 в линии упаковки клеток и PMX в качестве ретровирусных вектора приводит к стабильной и эффективной экспрессии введенного гена в первичных Т-клеток человека. PG13 упаковочные клетки могут быть одноклеточные клонировали, чтобы выбрать для упаковки клеток с высоким титром для повышения эффективности трансдукции. Кроме того, у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Университетская сеть здравоохранения подала заявку на патент, связанный с этой методологией, в котором Н.Х., М.Н. и Т.О. названы изобретателями. У других авторов нет финансовых конфликтов интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NIH R01 CA148673 (NH); премией Института исследований рака Онтарио IA-039 (NH); Грант на катализатор BioCanRX (NH); Фонд принцессы Маргарет по борьбе с раком (MOB, NH); Стипендия для выпускников Канадского института исследований в области здравоохранения (TG); Стипендия для аспирантов Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (TG); Провинция Онтарио (TG, MA); и стипендиальная премия Гульетти (TO). Мономеры HLA и CD1d были любезно предоставлены установкой по производству тетрамеров NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин-ЭДТАWisent Bioproducts325-043-CL
293GPG клеткиПолучены Ory et al. (ref 8)
AgarWisent Bioproducts800-010-CG
AgaroseWisent Bioproducts800-015-CG
Ампициллин натриевая сольWisent Bioproducts400-110-IG
ХлороформBioShopCCL402
Смесь растворов дезоксинуклеотидов (dNTP)New England BiolabsN0447L
DMEM, высокий уровень глюкозы, пируватLife Technologies11995065
EcoRINew England BiolabsR0101S
EZ-10 Набор для экстракции геля ДНК с спиновой колонкойBS353
Life Technologies12483020
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
FilterCorning4312200,45 мм поры SFCA мембрана
FITC-конъюгированная античеловеческая CD271 (NGFR) mAb Biolegend345104клон ME20.4
FITC-конъюгированная античеловеческая CD3 mAbBiolegend300440клон UCHT1
GentamicinLife Technologies15750078
Gibson Assembly Master MixNew England BiolabsE2611Lиспользован для сборки многокомпонентной ДНК
пентамера HLA-A2Проиммунныйзависит от антигенного пептидаHLA-A2/MART1 мультимер, используемый здесь, был приобретен у Проиммунные
мономеры HLA/CD1dNIH Tetramer Core Facilityмультимеризовать мономеры в соответствии с протоколом, предоставленным NIH тетрамерным ядром Сыворотка
AB человекаValley BiomedicalHP1022
человеческие CD3 микрогранулыMiltenyi Biotec130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V бета-репертуар НаборBeckman CoulterIM3497
Jurkat 76 клетокСгенерировано Heemskerk et al. (ref 10)
LB BrothWisent Bioproducts800-060-LG
LS MACS колонкаMiltenyi Biotec130-042-401
NEB 5-альфа Компетентный E. coliNewEngland BiolabsC2987I
NEBuffer 3.1New England BiolabsB7203Sиспользуется для EcoRI и NotI для пищеварения
NotINew England BiolabsR0189S
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410используется для очистки плазмид
PC5-конъюгированный античеловеческий CD8 mAbBeckman CoulterB21205клон B9.11
PG13 клеткиATCCCRL-10686
Phusion HF Buffer PackNew England BiolabsB0518S
Phusion  Высокоточная ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0530L
pMX ретровирусный векторCell BiolabsRTV-010
полибренSigma-AldrichH-9268
Пролейкин (рекомбинантный человеческий интерлейкин-2)Novartisby Rx единственныйэквивалентный продукт можно приобрести у Sigma-Aldrich
Очищенное античеловеческое антитело CD3 Biolegend317301клон OKT3, используемый для стимуляции Т-клеток
RPMI 1640Life Technologies11875119
SA-PELife TechnologiesS866используемый для мультимеризации мономеров из тетрамерного ядра NIH
SMARTer RACE 5'/3'  НаборClontech634858
Стерильная водаWisent Bioproducts809-115-LL
SuperScript III Система синтеза первой нитиInvitrogen18080051для синтеза кДНК
ШприцBD30160410 мл, скользящий наконечник
Тетрациклина гидрохлоридSigma-AldrichT7660
TransIT-293Mirus BioMIR 2700используется для трансфекции клеток 293GPG
TRIzol ReagentLife Technologies15596026
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота BS353 ,

Ссылки

  1. Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
  2. Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
  3. Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
  4. Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097(2013).
  5. Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
  6. Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
  7. Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
  8. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235(2015).
  9. Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101(2010).
  10. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  11. Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
  12. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556(2011).
  13. Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
  14. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253(2007).
  15. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  16. Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
  17. Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
  18. Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673(2011).
  19. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848(2011).
  20. Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34(2011).
  21. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  22. Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470(2009).
  23. Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
  24. Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
  25. Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
  26. Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
  27. Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
  28. Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
  29. Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
  30. Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Т-клеточный рецепторцентричность по полуцепиантигенная специфичностьклонирование TCRпроточная цитометрияклетки JurkatТ-клетки периферической кровиHLA-мультимерпроизводство вируса
порождающий
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.