Методическая статья

обнаружение Trypanosoma brucei Вариант поверхности гликопротеин Переключение с помощью магнитных Активированный сортировки клеток и проточной цитометрии

DOI:

10.3791/54715

⸱

19 октября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Lymphocyte Biology, Rockefeller University, 2Department of Biology, Harvey Mudd College, 3Masters School

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Африканские трипаносомы, выращенные in vitro, подвергаются антигенной изменчивости с низкой скоростью, так что популяции состоят из паразитов, экспрессирующих доминирующий тип поверхностного гликопротеина (VSG) варианта, и небольшой популяции "переключаемых" вариантов. Этот протокол описывает быстрый метод обнаружения и количественной оценки этих популяций.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trypanosoma brucei, простейший паразит, вызывающий африканский трипаносомоз человека и животных (известный как сонная болезнь и нагана соответственно) циклически переключается между переносчиком цеце и млекопитающим-хозяином. Он уклоняется от иммунной системы млекопитающего-хозяина, периодически переключая плотный, вариативный поверхностный гликопротеин (VSG), который покрывает его поверхность. Обнаружение антигенных вариаций у Trypanosoma brucei может быть как трудоемким, так и трудоемким. Здесь мы представляем метод количественной оценки числа паразитов, которые «переключились» на экспрессию нового VSG в данной популяции. Паразитов сначала окрашивают антителом против исходного VSG, а затем окрашивают вторичным антителом, прикрепленным к магнитной бусине. Паразиты, экспрессирующие исходный VSG, затем отделяются от остальной популяции путем прогона паразитов через колонку, прикрепленную к магниту. Паразиты, экспрессирующие доминантную, исходную VSG, задерживаются на колонке, в то время как проточный содержит паразитов, экспрессирующих новую VSG, а также некоторые загрязнители, экспрессирующие исходную VSG. Эта проточная популяция снова окрашивается флуоресцентно меченным антителом против исходного VSG для мечения загрязнителей и йодидом пропидиума (PI), который мечет мертвые клетки. Известное количество абсолютных счетных шариков, которые видны с помощью проточной цитометрии, добавляются к проточной популяции. Отношение гранул к количеству собранных клеток может быть затем использовано для экстраполяции количества клеток во всем образце. Проточная цитометрия используется для количественной оценки популяции переключателей путем подсчета количества PI-отрицательных клеток, которые не окрашиваются положительно для исходного, доминирующего VSG. Затем с помощью данных проточной цитометрии можно рассчитать долю переключателей в популяции.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Простейшим паразитом, Trypanosoma brucei, является возбудителем заболеваний , которые влияют на людей (через Trypanosoma brucei gambiense и Trypanosoma brucei rhodesiense) и животных (через Trypanosoma brucei brucei) во всей Африке к югу от Сахары. Он передается хозяину млекопитающего через слюну цеце вектора мухи. Оба человека и животных Африканский трипаносомоз вызывают серьезное экономическое бремя в эндемичных районах, а также несколько препаратов доступны или в развитии для лечения этих болезней. Понимание механизмов иммунной уклонения имеет решающее значение для разработки лекарств для трипаносомозу. Антигенная изменчивость плотного вариантные покрытия поверхности гликопротеина (VSG) , который покрывает паразита является одним из основных средств , с помощью которых Т. brucei уклоняется реакции антитела млекопитающих. Около 2000 вариантов гена VSG существуют в геноме трипаносом, но только один транскрибируется в любой момент времени от одного из ~ 15 Expresсайты Sion. "Переключение" выраженного VSG может происходить либо путем копирования гена VSG в сайт активного выражения, или путем транскрипционной активации ранее немого сайта выражения (обзор 1).

Хотя большая работа посвящена исследованию антигенной изменчивости T. brucei, факторы, влияющие на частоту переключения до сих пор плохо изучены. Исследования на сегодняшний день было затруднено тем , что в то время как переключение происходит стохастически в пробирке, частоты переключения очень низкие, порядка 1 в приблизительно 10 6 клеток 2. Это делает его трудно измерить ли уменьшение заданного возрастает фактор или частоту переключения, так как переключение трудно обнаружить в первую очередь. До 2009 года, методы выделения коммутаторами в данной популяции были длительными и трудоемкими. К ним относятся пассажей трипаносом через мышей, иммунизированных против доминирующего VSG, а затем сбора клетокчерез день 3, или считая сотни клеток с помощью иммунофлуоресценции 4,5. Другая стратегия зависит от отбора на устойчивость к лекарственным препаратам для выделения коммутаторами 6. Поскольку африканские трипаносомы , выращенные в пробирке , как правило , состоят из большого населения , выражающего один крупный вариант, и гораздо меньшее население коммутаторами , выражающих альтернативные варианты, мы имеем в виду основной вариант в этой статье в качестве доминирующей, начиная VSG. При этом мы ни в коей мере хотим сказать, что этот крупный вариант имеет большую пригодность по сравнению с другими вариантами в популяции.

Здесь мы опишем метод, который может надежно оценить число трипаносом, выражающую недоминирующую VSG в данной популяции в 3 - 4 ч. Этот метод особенно полезен, когда кто-то хочет, чтобы установить, увеличивает ли данное генетическое манипулирование или медикаментозное лечение количество коммутируемых клеток в популяции. Вместо того, чтобы избавить население клеток, экспрессирующих Д.О.СМОРОДИНСКИЙ, начиная VSG через наркотики или иммунологическими средствами, эти клетки уничтожаются путем первого нанесения на них магнитными гранулами, соединенными с антителом против доминирующего VSG, а затем изолировать их на магнитной колонке. Коммутируемая население затем собирают в проточные и вновь окрашивали Флуорофор меченными анти-VSG антитела для выявления загрязняющих веществ. Количественное достигается путем добавления определенного числа абсолютных счетных бус для каждого образца так , что отношение бусинок к клеткам могут быть определены и использованы для количественного определения количества коммутаторами в популяции 7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: В ходе технологического процесса, необходимо сохранить клетки на льду. Холодные носители также должны использоваться на всем протяжении.

1. Образец урожая

  1. Grow Lister 427 штамм трипаносом кровотока до плотности 0,5 - 1 миллион / мл. Лучше всего, чтобы начать культур с небольшим количеством паразитов. Спин вниз 50 х 10 6 клеток / образец в течение 10 мин при 1500 х г. Не забудьте оставить 1 × 10 6 клеток в культуре для последующего использования в качестве положительного и отрицательного контроля антител.
    Примечание: Этот протокол также может быть использован на трипаносом, выделенных из крови животных (обсуждение см для более подробной информации).
  2. Пипеткой или слейте большую часть супернатанта (оставьте около 750 мкл). Передача клетки 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  3. Спин клетки при 4 ° С в течение 4 мин при 5,200 XG в микроцентрифуге и удаления надосадочной жидкости.

2. Магнитный Этикетировочное

  1. Ресуспендируют клеток в 150 мкл культуральной среды (HMI-9 Wiй сыворотки, например) + первичное антитело против ВСГ в соответствующем разведении.
    Примечание: анти-ВСГ антитело производится в доме и использовали в разведении 1:50. Важно использовать первичный анти-VSG антитело, которое не меченного флуорофором.
  2. Вихревые клетки, используя вихревой адаптер-60 при скорости 6 - 8 в холодном помещении при температуре 4 ° С в течение 10 мин. Мытье с 800 - 1000 мкл холодного HMI-9 с сывороткой.
  3. Спин при 4 ° С в течение 4 мин при 5,200 XG и аспирата супернатант. Мытье с 1 мл HMI-9 с сывороткой и спином, как указано выше. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют осадок в 100 мкл HMI-9 с сывороткой.
  4. Добавьте 110 мкл магнитных активированных сортировки клеток (MSC) микрогранулы. С помощью анти-мышь, анти-кроличий или анти-биотин шарики в надлежащих случаях для первичного антитела анти-VSG. Хорошо перемешать. Вихревые клетки в холодном помещении при 4 ° С в течение 10 мин.
  5. В то время как клетки встряхиванием, установить одну магнитную активированные разделения колонок / образец на магнит разделения. Обязательно иметь повторноceptacle (мы используем центрифужную пробирку 15 мл) в колонке, чтобы собрать проточные. Настройка устройства в холодном помещении.
  6. Добавляют 2 мл HMI-9 с сывороткой к прайм колонке. После того, как заливка место 15 мл центрифужные пробирки под колонну для сбора проточный из каждого образца.
  7. После 10-минутной инкубации на стадии 2.4, добавьте 800-1000 мкл холодной HMI-9 с сывороткой. Отжима при температуре 4 ° С в течение 4 мин при 5,200 XG и удалить супернатант для удаления несвязанного антитела. Промыть 1 мл HMI-9 с сывороткой и повторите оставляя 100 мкл супернатанта.
  8. Флик центрифужную пробирку энергично и визуально проверить трубку, чтобы убедиться, что осадок полностью ресуспендировали. Добавьте 1 мл HMI-9 с сывороткой и пипеткой вверх и вниз, чтобы убедиться, что клетки хорошо ресуспендировали.

3. Магнитное разделение

  1. Убедитесь, что столбцы загрунтованы, как описано выше. Применить клетки к колонке. Сбор проточные с клетками, экспрессирующими недоминантную В.С.G. 1 мл среды + трипаносомы обычно занимает 6 - 7 мин, чтобы протекать через колонку.
  2. Мытье 2x 1 мл HMI-9 с сывороткой и собирать проточного в той же трубе, как в шаге 3.1.
  3. Разделить проточный (3 мл) в две 1,5 мл микропробирок.
    Примечание: это могут быть объединены позже или половина может быть использована для выделения РНК и т.д.
  4. Удалить столбец из магнита. Добавьте 3 мл HMI-9 с сывороткой в ​​колонну и погрузить колонку в 15 мл центрифужную пробирку, чтобы получить клетки, которые выражают начальную, доминирующую VSG. Удалить 300 мкл элюированного материала для последующего анализа. Держите эти клетки на льду.
  5. Для использования в качестве положительного и отрицательного контроля, занимает приблизительно 1 миллион клеток из исходной культуры контрольных клеток, растущих при 37 ° C (те, как ожидается, не часто переключаться) и пипетку их в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    Примечание: положительные контрольные клетки будут окрашивали флуорофора меченных антител на этапе 4.1. Отрицательные контрольные клетки РЭМАв неокрашенными в остальной части протокола.
  6. Спин проточные образцы и положительный контрольный образец антител при 4 ° С в течение 4 мин при 5,200 XG и удалить супернатант.
    Примечание: Другой 300 мкл аликвоты элюированной клеток может быть использован в качестве положительного контроля для анти-VSG окрашивания.

4. Окрашивание выявлять загрязняющие вещества и коммутаторами

  1. Ресуспендируют проточные образцов и положительных контрольных клеток в 100 мкл HMI-9 с сывороткой + первичным, флуорофора меченных, анти-VSG-антитело в соответствующем разведении.
    Примечание: меченными анти-ВСГ антител производится в доме и использовали в разведении 1: 1000. Флуорофор меченных анти-ВСГ может быть из того же источника, что и немеченых антител при разделении MACS step.There должно быть 3 мл проточного образца в двух микропробирок следующие стадии 3.5.
  2. Для того, чтобы проанализировать все проточные с помощью проточной цитометрии, объединить окатышей в двух микропробирок при повторном Сусв ожидании образцов в 100 мкл HMI-9 с сывороткой + анти-VSG антителом. Хорошо перемешать.
  3. Вихревые клетки в холодном помещении при 4 ° С в течение 10 мин. Добавить 800 - 1000 мкл холодной HMI-9 с сывороткой. Образцы отжима при температуре 4 ° С в течение 4 мин при 5,200 XG и удалить супернатант для удаления несвязанного антитела.
  4. Вымойте клеток с 1 мл HMI-9 с сывороткой. Образцы отжима при температуре 4 ° С в течение 4 мин при 5,200 XG и удаляют супернатант. В течение этого последнего спина, спина вниз элюированный-образцы со стадии 3.4 и отрицательного контрольного образца.
  5. Ресуспендируют все проточные и элюированные образцы в: 148,5 мкл HMI-9 с сывороткой, 25 мкл абсолютного подсчета шарики и 1,5 мкл Пропидиум йодида окрашивание раствора (175 мкл общего объема). Ресуспендируют положительные и отрицательные контрольные образцы антитела в 175 мкл HMI-9 с сывороткой. Обязательно запишите число абсолютных подсчета шариков / 25 мкл для конкретной партии используется.
  6. Запуск всех образцов через поток цитометр и сбор данных. Мертвые клетки пятно, как PI +. Загрязнения пятно , как PI - VSG +. Видеомикшеры пятно , как PI - VSG - 8.
  7. Рассчитать частоты коммутации с использованием проточной цитометрии данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения инструкций о том , как рассчитать частоты переключения, пожалуйста , обратитесь к дополнительному файлу потока цитометрии Calculations.docx и в таблице 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь метод был использован для демонстрации того, что двунитевых разрывов внутри сайта экспрессии VSG увеличилось количество коммутаторами в популяции 8. Здесь мы покажем, репрезентативные результаты из популяции трипаносом, которые были аналогичным образом индуцированными для генерации двухцепочечной разрыв на участке экспрессии. Мы сравниваем эти трипаносом к тем, которые не были индуцированная , чтобы генерировать двухцепочечной перерыв. На рисунке 1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Что касается экспериментальной техники, наиболее важный компонент протокола держит все образцы холодной. Трипаносомы очень быстро усваивают антитела , связанные с их поверхностью 9, но этот процесс зависит моторику, и не оказывает влияния на анализ тех пор , пока клетки выдерживали при 4 ° С. Все образцы должны всегда находиться на льду, и пипеткой должно быть сделано быстро, чтобы свести к минимуму воздействие на окружающую среду C лаборатории 25 °. Холодный ЧМИ-9 с сывороткой должны быть доступны в начале э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы иметь в виду Георгиевский крест общих рекомендаций по трипаносом биологии. Эта работа также была поддержана грантом GCE Билла и Мелинды Гейтс, DS в НФС Graduate Fellowship (Research DGE-1325261) для управления записями и NIH / NIAID (грант № AI085973) в ФНП. Мы благодарим Галадриэль Hövel-Miner для использования штамма, содержащего ген и распознавания сайта I-SCEI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
немеченое антитело против VSGн/дн/дантитело VSG изготовлено в собственном
флуорофоре меченое антитело против VSGн/д н/дантитело VSG изготовлено в собственном
помещении среда HMI-9н/д н/дHMI-9 изготовлено в доме
Пропидиум ЙодидBD Pharmingen556463
CountBright абсолютный подсчет бусинThermofisher НаучныйC36950
ЛД колонкиMiltenyi Biotech130-042-901
MACS магнитMiltenyi Biotech130-042-303
MACS магнитный сепараторMiltenyi Biotech130-042-302
вихревой адаптер-60ThermoFisher научныйAM10014
проточный цитометрCoulterн/д
программное обеспечение для анализа проточных цитометровFloJon/a

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
  2. Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
  3. Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).
  4. Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).
  5. Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).
  6. Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).
  7. Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).
  8. Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).
  9. Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
  10. Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

VSG

Похожие статьи