Методическая статья

Автоматизированная Количественное и анализ процедур Cell подсчет с использованием ImageJ плагинов

DOI:

10.3791/54719

⸱

17 ноября 2016 г.

 ,  , 
1Department of Biology, York University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается количественная оценка гемоцитометра и микрофотографий миграции/инвазии с помощью двух новых плагинов ImageJ с открытым исходным кодом: Калькулятор концентрации клеток и счетчик анализа миграции. Кроме того, в нем описываются протоколы получения изображений и калибровки, а также подробно обсуждаются требования к вводу плагинов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Национальный институт здравоохранения ImageJ является мощным, свободно доступны для обработки изображений пакет программного обеспечения. ImageJ имеет алгоритмы анализа частиц комплексные, которые могут быть эффективно использованы для подсчета различных биологических частиц. При подсчете большого числа образцов клеток, гемоцитометре представляет собой узкое место в отношении времени. Точно так же, подсчитывая мембраны от миграции / инвазии анализов с Счетчик клеток ImageJ плагин, хотя точные, исключительно трудоемкий, субъективная, и печально известный за причинение боли запястья. Для удовлетворения этой потребности, мы разработали два плагина в пределах ImageJ для единственной задачей автоматизированной гемоцитометра (или известного объема) и подсчета миграции / инвазии клеток. Оба плагина полагаться на способность приобретать высококачественные микрофотографии с минимальным фоном. Они просты в использовании и оптимизирован для быстрого подсчета и анализа больших размеров образцов со встроенными инструментами анализа, чтобы помочь калибровки графов. Объединив основной принципе годы Счетчик клеток с автоматизированной алгоритма подсчета и после подсчета анализа, это значительно увеличивает легкость, с которой миграционные анализы могут быть обработаны без потери точности.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В пробирке подсчета клеток является важным основным методом в широком диапазоне экспериментов для культур тканей. Точного определения количества клеток в культуре , имеет важное значение для экспериментальной воспроизводимости и стандартизации в 1,2 раза . Подсчета клеток можно осуществить вручную с помощью гемоцитометра, а также с использованием различных автоматизированных методов, каждый со своими преимуществами и недостатками 3,4,5. Большинство автоматизированных методов подсчета клеток принадлежат к одному из двух классов, те, которые используют принцип Coulter или проточной цитометрии. счетчики Coulter воспользоваться клеток электрического сопротивления, чтобы определить количество и размер ячейки. Они быстрые, точные и дешевле, чем цитометров. Тем не менее, они редко используются только для подсчета клеток из - за их значительной стоимости по сравнению с ручным подсчетом 3. Поток цитометры, с другой стороны, являются дорогими, но они имеют много приложений, таких как подсчет клеток, анализ формы клеток, стructure и измерения внутренней ячейки маркеров 4,5. Машины, которые используют любой из этих двух принципов доступны от многих производителей. Ручной подсчет является доступным , но отнимает много времени и при условии смещения в то время как автоматизированные методы приходят с фракцией времени , необходимого для ручного подсчета , но с использованием дорогих машин 6.

Другие процедуры общей культивирования клеток в пробирке клеток моторики анализов, а именно, миграции клеток и вторжения 7. Миграция и инвазия анализы обычно используются для изучения подвижности клеток и инвазивности в ответ на хемотаксисного ответа. Кроме того, они широко используются для изучения эмбрионального развития, дифференцировки, воспалительную реакцию, и метастазирование нескольких типов клеток 7-11. Клетки, которые мигрировали или захватившие через пористую мембрану анализа миграции может быть определена количественно двумя различными способами. Во-первых, путем окрашивания клеток с флуоресцентным красителем, диссоциации сюдам мембрану, и количественно оценить с помощью флуоресцентного читателя 12. Ограничение этого метода количественного определения является то , что запись не может быть сохранена мембран и нет никакой возможности для дальнейшего анализа 13. Второй метод Количественное для мигрировали / захвачена клетки, которые будут фиксировали и окрашивали с флуоресцентным красителем или, чаще всего, с цитологическим красители, такие как кристаллический фиолетовый, толуидиновым синим красителем или гематоксилином; Затем клетки количественно вручную , используя перевернутые микроскопические изображения этих мембран , что является очень трудоемкой задачей 12,13.

Для того, чтобы преодолеть недостатки подсчета клеток вручную, были разработаны два надежных и точных автоматизированных счетчиков клеток для концентрации клеток и для анализа миграции. Эти автоматизированные алгоритмы счетчика клеток были разработаны для ImageJ как плагин с использованием языка программирования Java от Oracle. ImageJ является публичным и широко используемым инструментом для обработки изображений, разработанная Национальным институтом HeaLtH (NIH) 14,15; Таким образом, записывая эти плагины для ImageJ облегчает интеграцию в биологическом сообществе.

Автоматизация подсчета клеток обеспечивает высокую пропускную способность и воспроизводимость по сравнению с ручным подсчетом. Хотя другие доступное программное обеспечение и плагины могут быть использованы для расчета концентрации клеток на основе анализа изображений 5,16,17, Cell концентрационного Calculator плагин очень быстро и может также обрабатывать разведений клеток и лечения. Кроме того, все результаты и расчеты из этих двух счетчиков могут быть сохранены и экспортированы. Эти два плагина, описанные в этой статье, оптимизированы для использования контрастного микроскопа фазы для клеток живого изображения и большим полем зрения (полный цикл захвата мембраны) изображений для анализа миграции мембран за счет использования в рамках рассекает. Плагины свободно доступны для загрузки с инструкциями по установке от: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Соединение микроскопа и настройки фотокамеры (Cell Концентрация калькулятор)

  1. Увеличение яркости лампы в полном объеме с помощью ручки регулировки света, переключиться на линзы объектива 4X, а также обеспечить выбраны фильтры фазового контраста.
    Примечание: Любой перевернутый фазовый контраст микроскопа для культуры тканей с темным фоном, например, фазовый контраст PhP, могут быть использованы в соответствии со стандартными процедурами микроскопа и камеры.
  2. В программном обеспечении микроскопа, установить параметры съемки изображения значения по умолчанию.
    Примечание: Обратитесь к руководству пользователя микроскопа, чтобы найти расположение этих настроек.
    1. Установка параметров "яркости", "контрастности" и "насыщение" до 100% и "гамма" и "усиление" до 1,0.
      Примечание: В зависимости от программного обеспечения, "яркости" и "контрастности" может по умолчанию на значение 0% вместо 100%.
    2. Установить изображения, которые будут захвачены в черно-белом, используя высокое разрешение availablе (1600 х 1200 пикселей (пикселей) или больше).
      ПРИМЕЧАНИЕ: "насыщение" 0% достаточно, если черно-белая установка недоступна.
  3. Поместите стандартную гемоцитометра на столик микроскопа и захватить изображение , как показано на (рис 1А); это "Калибровка изображения Volume '. Регулировка времени экспозиции по мере необходимости.

2. Изображение Объем калибровки

  1. Открыть ImageJ и из меню плагинов, запустите Cell Концентрационный Калькулятор (CCC) плагин, например, Плагины> Анализатор> 'Cell Концентрация Калькулятор ".
    1. Если панель с правой стороны 'Image Volume Calibration' не видно, нажмите на кнопку "Калибровка", чтобы показать его.
  2. В ImageJ, откройте "Volume Calibration изображение ', начиная с шага 1.3 (' Файл '>' Open ') и CCC нажмите на кнопку« Получить размеров изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет заполнить как изображения Ширина иВысота текстовых полей с разрешением изображения в пикселях автоматически.
  3. В ImageJ, выберите 'Straight Line Tool "рядом с инструментами выделения и нарисовать прямую линию по всей длине гемоцитометр первичной (P) -Square показано в (Рисунок 1В), перетаскивая курсор.
    1. Нажмите клавишу 'M', чтобы отобразить окно результатов, содержащий измерения прямой линии. Введите значение из столбца Length в "P-квадрат длины" текстовое поле в КТС (рис 1B).
    2. Нажмите на кнопку "Рассчитать объемное изображение", чтобы выводить объемное изображение в изображение Volume текстового поля. С другой стороны, если объем изображения уже известно, введите объем в нл в образ тома текстового поля.
  4. Нажмите на кнопку "Сохранить".
    Примечание: Плагин теперь откалиброван.

3. Калибровка камеры экспозиции

  1. После сбора клеток дляподсчета с помощью гемоцитометра, нагрузка 10 мкл клеток в камере гемоцитометра и поместите его на столик микроскопа.
  2. Используя те же параметры, начиная с шага 1.2, настройте время экспозиции, так что фоновые линии гемоцитометра исчезают.
    1. Отрегулируйте фокусировку так, чтобы внутренняя часть ячеек темнее, чем мембраны клетки, что указывает на фокус в центральном сечении клетки и не полюсах.
    2. Далее настроить экспозицию так, чтобы клетки не передержано и напоминают те , изображены на рис (1С).
      Примечание: Слегка видимые гемоцитометра линии являются приемлемыми. Рекомендуется записать или сохранить эти настройки для поддержания точности и воспроизводимости.

4. Получение изображения

  1. Для каждого образца клеток, нагрузка 10 мкл в обеих палатах гемоцитометра увеличить мощность статистического вывода 2. Поместите гемоцитометра на столик микроскопадля работы с изображениями.
    Примечание: Разрешение и увеличение каждого изображения должно быть таким же, как 'Volume калибровочное изображение ". Плагин подсчитывает все изображения любой выбранной папки; сохранять изображения, которые будут учитываться вместе в той же папке.
    1. Если функция файла автоматическое приращение доступна, включите его и убедитесь, что каждое изображение не отображается после захвата для увеличения пропускной способности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ручное сохранение и закрытие каждого изображения будет значительно замедлить процесс. Обратитесь к руководству пользователя микроскопа для получения информации о наличии функцией автоматического приращения.
    2. Захват по меньшей мере, три неперекрывающихся изображения центральной области гемоцитометра, хотя и более (5-10) рекомендуется для повышения точности.
      Примечание: Избегайте как верхние и нижние участки камер, как клетки имеют тенденцию к увеличению плотности в обоих местах. Возьмем то же количество изображений для каждой камеры. Это необходимо для правильного функционирования подключаемого модуля во время подсчета голосов.

5. подсчитывая и Разведения Изображение

  1. В КТС, нажмите на кнопку "Count ячеек" и наблюдать диалоговое окно выбора каталога. Выберите папку для подсчета.
  2. Обратите внимание на поле ввода номера образца после выбора папки. Введите количество снимков , сделанных в камере, то есть 4.1.2, и нажмите кнопку "Ok". Плагин теперь будет считать все JPG, TIFF и PNG изображений в выбранной папке в алфавитном порядке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии на кнопку "Пример просмотра" появится окно просмотра Пример отображения информации о считанных образцах. Концентрация образца средняя концентрация всех снимков, сделанных в камере. Образцы с безразмерными концентрации могут быть добавлены в этот список, например, добавление лекарственного средства или небольшого лечения молекулы.
    1. Пересчет образцы клеток, если концентрации значительно варьироваться в пределах отсчетов одних и тех же образцов (раздел 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета разведений для всех тон считал-образцы, CCC автоматически использует формулу С 1 V 1 = C 2 V 2.
  3. Используйте сценарий высева 15000 клеток на 200 мкл в 30 лунки 96-луночного планшета + 1 дополнительная:
    1. Установите текстовое поле справа от метки С2 до 15000 и объемной концентрации текстового поля до 200, изменяя блок поле со списком, примыкающий к '' мкл.
      Примечание: плагин будет в конечном счете вычислить концентрацию в клетках / мл.
    2. Убедитесь, что поле со списком имеет объем V2, выбранный (конечный объем) и в текстовом поле справа введите 6200 (200 мкл х (30 + 1)), выбор '' мкл в поле со списком единице объема.
  4. Нажмите на кнопку "Рассчитать Разбавление", чтобы добавить введенный в данный момент разбавление в левый нижний список.
    Примечание: Для каждого разведения добавленного, будет решена для каждого образца и отображаются в дереве диаграмме справа. Двойной щелчок по каждой записи расширяться.
  5. Щелчок тон кнопку "Сохранить" под кнопкой "Пример просмотра", чтобы записать в файл все образцы данных и разбавителей.
  6. Примечание: Эти данные могут быть восстановлены в любое время, нажав кнопку "Load" и выбрав сохраненный файл.

6. Миграция и Invasion (счетчик)

  1. Выполните миграцию и инвазию анализов с использованием стандартного метода Бойден камеры 7-9.
  2. После того, как клетки мигрировали / захвачена, осторожно удалите носитель внутри вставки путем переворачивания и осторожно постукивая. Фитиль от любых избыточных средств массовой информации присоединились к нижней части мембраны, касаясь края к бумажным полотенцем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к самой мембраны к полотенцу, это может сместить прилипшие клетки.
  3. Закрепить и окрашивать клетки как сообщалось 7-9 в 24-луночный планшет с установленной каждой строки , содержащей ~ 500 мкл другого раствора, например, фиксирующим средством , морилку 1, морилку 2 и затем дважды дистиллированной водой (DDH 2 O). Заполните вторую пластину с 1x PBS то размещения вставок в перед нарезкой.
  4. Вымойте вставки, помещая их в лунки , заполненные DDH 2 O и заполнить вкладыш с DDH 2 O. Слейте воду перед моечные прочь клеток путем инверсии.
  5. Используйте чистую хлопчатобумажную аппликатор для удаления не-мигрировали / деинсталлировать вторглись клетки из верхней части мембраны, стараясь не повредить мембрану. Будь тщательное вокруг краев мембраны.
  6. Обрежьте мембрану с помощью бритвы или скальпель и осторожно перенести мембрану (снизу вверх) на чистую предметное стекло.
  7. Добавить небольшую каплю решение для монтажа под и на верхней стороне мембраны и покрывают тонким покровным.
    Примечание: во избежание захвата пузырьков внутри монтажного раствора, чтобы сохранить точность подсчета.

7. Анатомический Scope и Camera Setup

  1. Включите источник света микроскопа и камеры.
    Примечание: Обратитесь к руководству пользователя микроскопа подробные инструкции.
  2. остроумиегин программного обеспечения, устанавливать параметры захвата изображения микроскопа значений по умолчанию.
    Примечание: Если функция усреднения существует, то значение четырех рекомендуется. Это хороший компромисс между степенью усреднения и получения изображений времени. Точно так же, небольшая степень резкости может повысить точность воспроизведения изображения.
    1. Установка параметров "яркости", "контрастности" и "насыщение" до 100% и "гамма" и "усиление" до 1,0.
      Примечание: В зависимости от программного обеспечения, "яркости" и "контрастности" может по умолчанию на значение 0% вместо 100%.
    2. Установите дисплей (в режиме реального времени) и разрешение захвата их максимальных настройках (1600 х 1200 пикселей и 2592 х 1,944 пикселей, соответственно).
      Примечание: Разрешение дисплея можно регулировать по мере необходимости, если частота обновления слишком медленно. Более низкие резолюции сделает его более трудно сосредоточиться точно, но увеличить частоту обновления.
  3. Для стадии сферы рассекает, используйте твердый белый backgroунд; черный или стекло фон недостаточно.
  4. Используйте источник света выше стадии, предпочтительно от двух гибких светодиодных огней справа и слева от сцены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ниже стадии источник света будет освещать поры внутри анализа миграции мембраны, которая может негативно повлиять на точность последующих отсчетов.
  5. Поместите заполненную анализа миграции мембраны слайд на сцену. Глядя на реальном времени изображение, отображаемое с помощью программного обеспечения, регулировать увеличение с помощью ручки регулировки зума так, чтобы края одной мембраны только в поле зрения камеры.
    Примечание: Размещение слайдов на стеклянной пластине возвышаться белый фон этап делает его легче маневрировать слайд для работы с изображениями.
  6. Отрегулируйте положение источников света (7.6.1) и времени экспозиции воспроизвести настолько близко , насколько это возможно идеальный образ , изображенный на рисунке 2А. В зависимости от яркости, время воздействия 5-60 мс должно быть достаточно.
    ЗАМЕТКА:Цель состоит в том, чтобы произвести изображение с минимальным цветом фона , как это возможно и равномерно освещенную мембрану без уменьшения точности изображения, то есть, передержка , ведущей к потере видимых ячеек.
    1. Установите левый и правый источники света под небольшим углом по отношению к слайду. Это поможет удалить пятна и фон хроматических аберраций. Попытка держать каждый источник света прямо напротив другой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При маневрировании каждый источник света в положение, поверните друга. Это помогает центрировать область освещения на мембрану сама более легко и точно.
  7. Удалить слайд и баланс белого изображения с помощью нажатия одной кнопки в программном обеспечении микроскопа.
    Примечание: микроскоп откалиброван. Сохранить как можно больше параметров, как это возможно для использования в будущем и принять к сведению позиции источника света и интенсивности.

8. Изображение Приобретение и Flatfield

  1. В программном обеспечении, установитерасположение папки захвата и захвата по одному изображению на мембрану. Назовите изображения , следуя общему шаблону: Название - ###, например, управление - 001.tif, контроль - 002.tif, испытания снадобья - 001.tif, и так далее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов изображения, сохранить тип файла изображения, как TIFF по сравнению с другими форматами с потерями, такие как JPEG.
    Примечание: Изображения не следуя общей шаблон по-прежнему будет подсчитываются, но не будут подвергаться автоматизированной группировке и плоской Филдинг.
    1. Если flatfield коррекции желательно, для каждого слайда найти пустую область и возьмите пустое изображение вслед за соглашением об именах: имя - Бланк.
      Примечание: Заготовка представляет собой область на слайде, который не содержит мембрану, и представляет собой фоновую подсветку.
    2. Непосредственно перед изображениями, распрямите каждую мембрану, применяя давление на покровное и удалить как можно больше пузырьков, захваченных, как это возможно.
  2. В ImageJ, перейдите к плагинам и открыть TC плагин; например, Плагины> Анализ> & #39; Transwell счетчик '.
  3. В рамках ТС, нажмите на кнопку "Flatfield" и наблюдать диалоговое окно выбора каталога. Выберите папку, в которой были сохранены изображений мембраны.
    Примечание: только изображения, сохраненные с общим шаблоном выше будет автоматически flatfield корректируются и сохраняются в новой папке под названием Flatfield в выбранной папке. Смотрите рисунок 2B для примера flatfield исправленное изображение.

9. Параметры конфигурации

  1. Открыть анализа миграции мембраны изображение в ImageJ ( 'Файл'> 'Open') и выберите Image> Adjust> 'Color Threshold ...'. Обратите внимание на окно Порог цвета для настройки, какие цвета будут отфильтрованы изображения.
    1. В нижней части окна, установить метод Thresholding к 'Shanbhag', Порог цвета для «белых», и цветовое пространство RGB '' (красный зеленый синий); снимите флажок Темный фон, если выбран.
    2. Отрегулируйте верхнююползунки, перетаскивая маркеры 0, а нижние ползунки до 255 (оставить нижние ползунки на 255). Убедитесь в том, что изображение является полностью белым.
  2. Отрегулируйте зеленые и красные верхние ползунки, пока только ядра не видно.
    Примечание: Установки, выбранные будет меняться полностью на пятно клеток используется. Смотрите рисунок 2C.
  3. В ТС плагин, введите значения верхних ползунков RGB в «RGB порогового значения 'текстовые поля связанные с ним параметры конфигурации. Нажмите кнопку "Добавить / Изменить" и перезаписать конфигурацию.
    1. Оставьте диапазон значения нижнего и верхнего размера в 1 - бесконечность.
  4. В панели Параметры конфигурации, нажмите кнопку "Сохранить", чтобы записать установки на жесткий диск.

10. Подсчет изображения и калибровка

  1. Откройте плагин TC (8.2) и нажмите на кнопку "Count Folder" и наблюдать диалоговое окно выбора каталога. Выберите папку для насчиталай ждать его, чтобы закончить.
  2. Каждый подсчитывали-образец автоматически добавляется к основной таблице. Ключевые столбцы 'Count', 'Качество', и 'Калибруйте?'.
    ПРИМЕЧАНИЕ: снимите откалиброван Count это число частиц на мембране в зоне отображается в столбце "Диапазон Area '.
    Примечание: Качество варьируется приблизительно от -0,8 до 1,7; Q ≥ 0,5 является приемлемым.
    1. Соблюдайте галочку в 'Calibrate? столбец, если изображение попадает для калибровки на основании его сходства с идеальными показателями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба качества и калибровки можно предположить, что текущие настройки, возможно, являются недостаточными. Если после того, как собственно 'Цвет Thresholding' и 'Размер Диапазоны' были выбраны и калибровка по-прежнему предлагается, осмотр оригинала и подсчитывали изображения должны быть окончательным определитель действительного подсчета голосов.
  3. Выберите все образцы в таблице FLAGGED для калибровки.
    1. Щелкните правой кнопкой мыши в тон стол и выберите Пересчет> 'рекомендуемый размер. Это позволит пересчитать изображения с рекомендованной минимальной площади частиц.
    2. Щелкните правой кнопкой мыши снова и выберите "Показать Участок". Обратите внимание на частоту график рассеяния частиц областей. Идеальное изображение будет иметь график , напоминающее длинный правый хвост нормальное распределение, т.е. колоколообразной кривой. Смотрите рисунок 3B.
    3. Отрегулируйте нижний диапазон размеров, при необходимости, выбрав образец, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав Повторный подсчет> 'Ручная настройка ". Соблюдайте диалог ручной настройки. Введите нужные параметры и нажмите кнопку Count, чтобы пересчитать изображение с новыми настройками.
  4. Для регулировки счетчиков вручную, выберите образцы, щелкнув правой кнопкой мыши таблицу и выберите "Открыть изображение с помощью подсчета '. Обратите внимание на исходное изображение с красными маркерами, представляющими каждую частицу, подсчитанное плагин.
    Примечание: Пересчет> 'Показывать подсчитывали бинарное изображение "может быть полезно, чтобы проверить, насколько хорошо яndividual клетки решаются с помощью цвета пороговым.
    1. Чтобы добавить счетчик, удерживая клавишу "Ctrl" и щелкните левой кнопкой мыши. Соблюдайте маркер в позиции курсора, которая будет добавлена ​​к образцам общее количество. Чтобы удалить маркер, щелкните правой кнопкой мыши на изображение. Плагин удалит маркер ближе всего к курсору.
    2. Чтобы удалить группу маркеров, используйте инструмент выбора в ImageJ для выбора интересующей области (ROI). Удерживая "Ctrl", щелкните правой кнопкой мыши на изображение и все маркеры внутри ROI будут удалены. Обратите внимание на номер ячейки в столбце "Количество".

11. Сохранение / Открытие результатов и Экспорт в CSV

  1. В ТК, перейдите к строке меню и нажмите на кнопку "Файл"> "Сохранить результаты". Обратите внимание на диалоговое окно Результаты Сохранить. Выберите имя отправителя и получателя и нажмите кнопку "Сохранить".
    1. Используйте 'Файл'> 'Открыть результаты ", чтобы загрузить файл, содержащий все данные, отображаемые в основной таблице, includinг сюжет.
      Примечание: Файл результаты сохраняются каталоги изображений сохраняются в случае, если исходные изображения будут перемещены после сохранения, "Открыть исходное изображение 'и' открытое изображение с числом 'функций потерпит неудачу..
    2. Чтобы сбросить каталог изображений, выберите образцы, щелкните правой кнопкой мыши таблицу и выберите "Сбросить каталог образа". Обратите внимание на диалоговое окно Choose Directory. Выберите новую папку и, если существуют образы, каталоги будут сброшены. Повторно сохраните файл результатов.
  2. Для сохранения файла в разделенные запятыми (CSV), в строке меню выберите "Файл"> "Экспорт в .csv». Это создает файл с образцами, организованных в статистических группах со средним значением подсчета и стандартная ошибка среднего значения; его макет предназначен для быстрого построения графиков в общих программах построения графиков.
    Примечание: Статистические группы основаны на группах, созданных в рамках ТС.
    1. Если образцы следуют общей шаблон именования, выберите образцы, чтобы быть грouped, щелкните правой кнопкой мыши и выберите 'Auto' группировки. Это добавляет образцы с тем же именем '' к той же группе. Используя пример управления - 1, контроль - 2, лечение - 1, лечение - 2: оба элемента управления будут добавлены в группу 'Control' и лечения для "лечения".
    2. Добавьте образцы вручную группы двойным щелчком сэмпла ячейки и набрав 'Group' в названии группы. Выберите образцы, которые будут добавлены в эту группу, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Добавить в группу".

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Концентрация клеток Калькулятор

На рисунке 1 представлен общий процесс калибровки CCC и счетного получения изображения. На рисунке 1А и 1В изображают P-квадрат калибровки изображения и вычисление P-квадрат длины в пикселях. ССС определяет концентрацию клеток в заданном объеме по формуле:

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги, устранение неполадок и ограничения

Сама природа автоматизированных вычислительных методов, в частности, те из анализа частиц, требует математические способности определять эти частицы. Следовательно, точность обеих клеточных концентрационного Калькулятор и анализа миграции счетчика главно зависит от верности изображения, то есть, насколько близко захваченное изображение напоминает образец клеток или анализа миграции мембраны. Поэтому в первостепенное значение для последующего ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Канадским институтом исследований в области здравоохранения для CP (OR 142730 и OR 89931). Мы хотели бы поблагодарить Елену Бркич за ее первоначальную идею анализа бинарных частиц в ImageJ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Классические жидкие среды HyClone: RPMI 1640 - с L-глутаминомFisher ScientificSH3002702Среды для культивирования клеток 
Фетальная кровяная сыворотка крови (FBS)GIBCO BRLP00015Медиа-плющение
HTR8/SVneo трофобласт клеточной линииКлетки были получены от доктора Чарльза Грэма (Queen' Программное обеспечение разработано для работы с любыми линиями ячеек.
ТрипсинGIBCOBRL 27250-018приготовлен в виде 0,20% (мас./об.) в 10 & микро; M EDTA 1x
PBS AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
10 см Пластины для клеточных культурSARSTEDT833902Для любых обработанных культур тканей планшетов будут подойти
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0  &микро; m Размер порCostar 3422 заказан в Fisher Scientific7200150Для 24-луночных планшетов; Размер пор: 8,0 & микро; m; диаметр 6,5 мм; 0,33 см2 зона роста
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3EMD Millipore и заказаны в VWR65044A, B, & CНабор для морилки Hemacolor состоит из трех полиэтиленовых флаконов объемом 500 мл (16,9 унции) и включает в себя фиксатор метанола (раствор 1), эозин или кислотный краситель (раствор 2) и метиленовый синий или основной морилку (раствор 3)
Аппликатор с ватным наконечникомPuritan Medical806-WC
Однолезвийные промышленные бритвенные лезвияVWR55411 - 055Толщина: 0,30 мм (0,012 дюйма)
Предметные стекла для микроскопа - предварительно очищенные/простыеFisher Scientific12550A3Размеры: 25 мм x 75 мм x 1,0 мм
Чехлы Fisherbrand - Прямоугольники No 1Fisher Scientific12-545EТолщина: от 0,13 до 0,17 мм; Размер: 50 мм x 22 мм
Fisher Chemical Permount Монтаж СреднийFisher ScientificSP15-500
Leica Stereo препарирующий микроскопLeica MicrosystemsМикроскоп оснащен камерой для микроскопа Leica модели MC170 HD и программным обеспечением камеры Leica App. Suite (LAS E2) Версия 3.1.1 [Сборка: 490]. Запчасти для микроскопа:  LED3000 Модель освещения прожектором: MEB126, оптический носитель Leica M80 модели M80, объектив ахромат 1.0X, WD=90  мм Модель: MOB306 & Объективный ахромат 0,32X, WD=303  мм Модель: MOB315, Видеообъектив 0,5X Модель: MTU-293
гемацитометраГермания 0,100 мм Глубина - 0,0025 мм2
Olympus микроскоп с инвертированным светом OlympusCorporationCKX41SFМикроскоп оснащен Lumenera Infinity 1-2
2,0 мегапикселя CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2Thermo Scientific Модель: 1375Подойдет любой ламинарный шкаф для работы с клеточными культурами 
Инкубатор для клеточных культурThermo Scientific Модель: 370Подойдет любой инкубатор для клеточных культур - Клетки культивировались в увлажненной среде, 5% CO2, 37° С 
ImageJNIHVersion 1.50eМинимальная требуемая версия
Java Runtime EnvironmentOracleVersion 1.8.0_66Минимальная требуемая версия
Ассистент

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752(2008).
  2. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
  3. Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
  4. Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. Animal Cell Culture. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).
  5. Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
  6. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).
  7. Scott, W. N. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).
  8. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).
  9. Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
  10. Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
  11. Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
  12. Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
  13. Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
  14. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/ (2007).
  15. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
  16. Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
  17. Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
  18. Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).
  19. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
  20. Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , Available from: https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TC

Похожие статьи