Автоматизированная Количественное и анализ процедур Cell подсчет с использованием ImageJ плагинов

Summary

В этой статье описывается количественная оценка гемоцитометра и микрофотографий миграции/инвазии с помощью двух новых плагинов ImageJ с открытым исходным кодом: Калькулятор концентрации клеток и счетчик анализа миграции. Кроме того, в нем описываются протоколы получения изображений и калибровки, а также подробно обсуждаются требования к вводу плагинов.

Abstract

Национальный институт здравоохранения ImageJ является мощным, свободно доступны для обработки изображений пакет программного обеспечения. ImageJ имеет алгоритмы анализа частиц комплексные, которые могут быть эффективно использованы для подсчета различных биологических частиц. При подсчете большого числа образцов клеток, гемоцитометре представляет собой узкое место в отношении времени. Точно так же, подсчитывая мембраны от миграции / инвазии анализов с Счетчик клеток ImageJ плагин, хотя точные, исключительно трудоемкий, субъективная, и печально известный за причинение боли запястья. Для удовлетворения этой потребности, мы разработали два плагина в пределах ImageJ для единственной задачей автоматизированной гемоцитометра (или известного объема) и подсчета миграции / инвазии клеток. Оба плагина полагаться на способность приобретать высококачественные микрофотографии с минимальным фоном. Они просты в использовании и оптимизирован для быстрого подсчета и анализа больших размеров образцов со встроенными инструментами анализа, чтобы помочь калибровки графов. Объединив основной принципе годы Счетчик клеток с автоматизированной алгоритма подсчета и после подсчета анализа, это значительно увеличивает легкость, с которой миграционные анализы могут быть обработаны без потери точности.

Introduction

В пробирке подсчета клеток является важным основным методом в широком диапазоне экспериментов для культур тканей. Точного определения количества клеток в культуре , имеет важное значение для экспериментальной воспроизводимости и стандартизации в ^1,2 раза . Подсчета клеток можно осуществить вручную с помощью гемоцитометра, а также с использованием различных автоматизированных методов, каждый со своими преимуществами и недостатками ^3,4,5. Большинство автоматизированных методов подсчета клеток принадлежат к одному из двух классов, те, которые используют принцип Coulter или проточной цитометрии. счетчики Coulter воспользоваться клеток элект....

Protocol

1. Соединение микроскопа и настройки фотокамеры (Cell Концентрация калькулятор)

1. Увеличение яркости лампы в полном объеме с помощью ручки регулировки света, переключиться на линзы объектива 4X, а также обеспечить выбраны фильтры фазового контраста.
   Примечание: Любой перевернутый фазовый контраст микроскопа для культуры тканей с темным фоном, например, фазовый контраст PhP, могут быть использованы в соответствии со стандартными процедурами микроскопа и камеры.
2. В программном обеспечении микроскопа, установить параметры съемки изображения значения по умолчанию.
   Примечание: Обратитесь к руководству пользователя микроскопа, чтобы....

Results

Концентрация клеток Калькулятор

На рисунке 1 представлен общий процесс калибровки CCC и счетного получения изображения. На рисунке 1А и 1В изображают P-квадрат калибровки изображения и вычисление P-квадрат длины в пикселях. ССС определяет концентрацию клеток в заданном объеме по формуле:

Discussion

Критические шаги, устранение неполадок и ограничения

Сама природа автоматизированных вычислительных методов, в частности, те из анализа частиц, требует математические способности определять эти частицы. Следовательно, точность обеих клеточных концентрационного Калькулятор и анализа миграции счетчика главно зависит от верности изображения, то есть, насколько близко захваченное изображение напоминает образец клеток или анализа миграции мембраны. Поэтому в первостепенное значение для последующего .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Классические жидкие среды HyClone: RPMI 1640 - с L-глутамином	Fisher Scientific	SH3002702	Среды для культивирования клеток
Фетальная кровяная сыворотка крови (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Медиа-плющение
HTR8/SVneo трофобласт клеточной линии	Клетки были получены от доктора Чарльза Грэма (Queen'		Программное обеспечение разработано для работы с любыми линиями ячеек.
Трипсин	GIBCO	BRL 27250-018	приготовлен в виде 0,20% (мас./об.) в 10 & микро; M EDTA 1x
PBS Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 см Пластины для клеточных культур	SARSTEDT	833902	Для любых обработанных культур тканей планшетов будут подойти
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0  &микро; m Размер пор	Costar 3422 заказан в Fisher Scientific	7200150	Для 24-луночных планшетов; Размер пор: 8,0 & микро; m; диаметр 6,5 мм; 0,33 см2 зона роста
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore и заказаны в VWR	65044A, B, & C	Набор для морилки Hemacolor состоит из трех полиэтиленовых флаконов объемом 500 мл (16,9 унции) и включает в себя фиксатор метанола (раствор 1), эозин или кислотный краситель (раствор 2) и метиленовый синий или основной морилку (раствор 3)
Аппликатор с ватным наконечником	Puritan Medical	806-WC
Однолезвийные промышленные бритвенные лезвия	VWR	55411 - 055	Толщина: 0,30 мм (0,012 дюйма)
Предметные стекла для микроскопа - предварительно очищенные/простые	Fisher Scientific	12550A3	Размеры: 25 мм x 75 мм x 1,0 мм
Чехлы Fisherbrand - Прямоугольники No 1	Fisher Scientific	12-545E	Толщина: от 0,13 до 0,17 мм; Размер: 50 мм x 22 мм
Fisher Chemical Permount Монтаж Средний	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo препарирующий микроскоп	Leica Microsystems		Микроскоп оснащен камерой для микроскопа Leica модели MC170 HD и программным обеспечением камеры Leica App. Suite (LAS E2) Версия 3.1.1 [Сборка: 490]. Запчасти для микроскопа:  LED3000 Модель освещения прожектором: MEB126, оптический носитель Leica M80 модели M80, объектив ахромат 1.0X, WD=90  мм Модель: MOB306 & Объективный ахромат 0,32X, WD=303  мм Модель: MOB315, Видеообъектив 0,5X Модель: MTU-293
гемацитометра	Германия		0,100 мм Глубина - 0,0025 мм2
Olympus микроскоп с инвертированным светом Olympus	Corporation	CKX41SF	Микроскоп оснащен Lumenera Infinity 1-2 2,0 мегапикселя CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Модель: 1375	Подойдет любой ламинарный шкаф для работы с клеточными культурами
Инкубатор для клеточных культур	Thermo Scientific	Модель: 370	Подойдет любой инкубатор для клеточных культур - Клетки культивировались в увлажненной среде, 5% CO2, 37° С
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Минимальная требуемая версия
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Минимальная требуемая версия