Методическая статья

Использование фильтра картриджа для фильтрации проб воды и экстракции ДНК окружающей среды

25.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54741

⸱

25 ноября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол фильтрации проб воды с помощью фильтрующего картриджа и извлечения ДНК из окружающей среды (eDNA) без необходимости вскрывать корпус для снятия фильтра. Этот протокол разработан для метабаркодирования эДНК рыб, но также применим к эДНК других организмов.

Аннотация

Недавние исследования показали, что использование экологической ДНК (eDNA) рыб является подходящим в качестве неинвазивного инструмента мониторинга. В большинстве этих исследований использовались фильтры с дисковым волокном для сбора эДНК из проб воды, хотя в ряде микробиологических исследований в водной среде использовались фильтрующие картриджи, поскольку картридж имеет преимущество в том, что он вмещает большие объемы воды и в целом прост в использовании. Здесь мы предоставляем протокол фильтрации проб воды с помощью фильтрующего картриджа и извлечения eDNA из фильтра без необходимости вскрывать корпус. Основные части этого протокола состоят из: 1) фильтрации проб воды (объемы воды ≤4 л или >4 л); (2) экстракция ДНК на фильтре с помощью роликового шейкера, помещенного в предварительно нагретый инкубатор; и (3) очистка ДНК с помощью коммерческого набора. Используя этот и ранее использовавшиеся протоколы, мы проводим анализ метабаркодирования eDNA, взятой из огромного аквариумного аквариума (7 500м3) с известным видовым составом, и показываем количество обнаруженных видов в библиотеке из двух протоколов в качестве репрезентативных результатов. Этот протокол был разработан для метабаркодирования eDNA от рыб, но также применим к eDNA от других организмов.

Введение

Экологическая ДНК (Эдна) в водной среде относится к генетическому материалу, найденной в толще воды. Недавние исследования показали полезность Эдна для обнаружения рыбы из различных водных средах, в том числе прудов, рек 1-3 4-8, потоки 9 и морской воды 10-14. Большинство этих исследований сосредоточено на выявлении одного или нескольких инвазивных 1,4-6,8,14 и редких или исчезающих видов 3,9, в то время как некоторые недавние исследования попытались одновременное обнаружение нескольких видов в местных сообществах рыб 7,9, 12,13,15 и мезокосмах 11,12.

Последний подход называется "metabarcoding" и Эдна metabarcoding использует один или несколько наборов праймеров ПЦР для coamplify область гена через таксономически различных образцов. За этим следует библиотекой препарата с индексацией и адаптером Кроме того, и индексированного библиотеки анализируют с помощью высокопроизводительного параллельного секвенированияПлатформа. Недавно Мия и др. 12 разработали универсальные ПЦР - праймеров для metabarcoding Эдна из рыб ( так называемые "MiFish"). В MiFish праймеры целевой гипервариабельной области митохондриального гена 12S рРНК (163-185 п.н.), который содержит информацию, достаточную для идентификации рыб к таксономической семьи, рода и вида для некоторых близких сородичей за исключением. С использованием этих праймеров в Эдна metabarcoding, Мия и др. 12 было обнаружено более 230 видов субтропических морских из аквариумов с известными видовой состав и коралловых рифов вблизи аквариума.

При оптимизации протокола metabarcoding для размещения естественной морской воды с различными уровнями концентрации Эдна от рыб, мы заметили, что MiFish праймеры иногда не в состоянии усилить целевой регион для последующей подготовки библиотеки. Одной из наиболее вероятных причин этого неудачного ПЦР-амплификации является отсутствие достаточного количества ТЕmplate ДНК , содержащаяся в небольших объемах воды фильтруются (т.е. 1-2 л). Хотя концентрация Эдна из определенной таксономической группы непознаваема до усиления, фильтрации больших объемов воды (> 1-2 л) будет простым и эффективным средством, чтобы собрать больше Эдна из водной среды с дефицитного обилием рыбы и биомассы, таких как открытого океана и глубоководных экосистем.

По сравнению с фильтрами дисковых волокна , обычно используемые в количестве рыбы Едне исследований 16, фильтровальные патроны имеют преимущество размещения больших объемов воды до забивания 17. На самом деле, недавнее исследование показало , большой объем (> 20 л) фильтрации проб морской воды с использованием береговых картриджей фильтра 18. Кроме того, они индивидуально упакованы и стерильны, и несколько шагов экспериментального процесса может быть выполнена в корпусе фильтра, таким образом , снижая вероятность загрязнения из лаборатории 19. Последнийфункция имеет решающее значение для Эдна metabarcoding, в которых риск заражения остается одной из крупнейших экспериментальная проблемы 20,21. Несмотря на эти технические преимущества фильтровальных патронов, он не был использован в исследованиях Эдна рыб с двумя исключениями 8,15.

Здесь мы предлагаем протокол для фильтрации проб воды с фильтром и патроном извлечения Эдна из его фильтра без необходимости разрезать корпус. Мы также предлагаем две альтернативные системы фильтрации воды в зависимости от объемов воды (≤4 л или> 4 л). Для сравнения эффективности вновь разработанного протокола и ранее используемый протокол , используя фильтр из стекловолокна в нашей исследовательской группе 12,14,22,23, мы выполняем Эдна metabarcoding анализ морской воды из огромного аквариума бака (7,500 м 3 ) с известной видовой состав, и показывают количество обнаруженных видов, полученных из двух протоколов в качестве представителя результатов. Этот протокол ч, как были разработаны для metabarcoding Эдна от рыб, но также применимо к Эдна из других организмов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Этот протокол не касается отбора проб воды и metabarcoding методами. Вода может быть выбраны по - разному в зависимости от целей исследования 16 и увидеть Мия и др. 12 Подробную информацию о методах metabarcoding с использованием MiFish праймеров. Обратите внимание, что пробы воды должна быть очень холодной и фильтруют в течение нескольких часов, чтобы избежать деградации Эдна. Кроме того, обратите внимание, что этот протокол включает в себя использование ротационном шейкере и инкубатор, и последний должен быть достаточно большим, чтобы вместить прежний. Кроме того, центрифуга, который может вместить и 15 мл и 50 мл конические пробирки незаменима для удаления оставшейся жидкости из фильтра после фильтрации и для сбора ДНК, извлеченной в картридже, соответственно.

1. Обработка винтовую крышку и 1 L Полиэтиленовый пакет

Примечание: Пропустите этот шаг, если объем фильтрации> 4 L.

  1. Просверлите отверстие через центр винтового Cар (прилагается к одноразовому 1 л пластиковый пакет) с таким же диаметром (4,8 мм) в качестве трубы, выступающей из разъема Луера мужского. Используя диагональные плоскогубцы, укоротить трубку разъема Луера мужской до соответствующей длины (ок. 3 мм) во избежание образования комков небольшого количества воды внутри колпачка после фильтрации.
  2. Нанесите клей клей специализированный для полиэтилена (ПЭ) и полипропилена (PP) и к нижней поверхности и штыревой контакт Луера и винтовой крышкой, соответственно. Подождите несколько минут для хорошего склеивания (обратитесь к инструкциям производителя).
  3. Вставьте разъем Луера мужской в ​​отверстие крышки винта. Подождите до полного склеивания двух частей (обычно> 24 ч). Стерилизовать винтовую крышку с штыревым разъемом Луер-Лок с 10% коммерческого отбеливателя (ок. 0,6% гипохлорита натрия) перед использованием.
  4. Удар два отверстия в двух нижних углах 1 л пластиковый пакет, чтобы повесить ее от тезч панели (этап 3). Убедитесь, что диаметр отверстий больше, чем у штырьками панели сетки.

2. Сборка Система фильтрации

  1. Прикрепите высокий вакуумный шланг к входному разъему аспиратором насоса и прикрепите другой конец трубки к коллектору. Убедитесь , что три красные футболки клапаны коллектора находятся в "выключенном положении" (т.е. по горизонтали).
  2. Ношение чистый комплект перчаток, вставьте женскую Луер установку и вакуумный разъем на верхней и нижней концах вакуумной резиновой трубки для фильтрации, соответственно.
  3. Осторожно прикрепить женскую Люэровский соединитель к выходному отверстию картриджа фильтра и прикрепить вакуумный разъем к силиконовой пробкой.

3. Фильтрация проб воды (≤4 L) с использованием фильтровального картриджа

Примечание: Пропустите этот шаг, если объем фильтрации> 4 L. Эта система фильтрации требует самостоятельный Панель Fили висит полиэтиленовый пакет, заполненный 1 л воды. Панель сетки, несколько зубцов, и стенд для панели, все это доступно в интернет-магазинах, было бы полезно для сборки данного устройства. Автоклава впускных и выпускных Luer колпачки для картриджа фильтра перед использованием.

  1. Залить 1 л воды отобранной в пластиковый пакет и закройте винтовую крышку с разъемом Луер-Лок мужской.
  2. Осторожно подсоединить впускное отверстие собранного патрона фильтра с мужской Луера разъем пластикового пакета. Не затягивайте разъем Luer-замок; В противном случае устройство будет течь, как только начинается откачка. Убедитесь, что все соединения надежно закреплены, прежде чем повесить пластиковый пакет с панели сетки.
  3. Аккуратно повесьте пластиковый пакет с картриджем фильтра с двумя зубцами на панели сетки и вставить силиконовую пробку во входное отверстие коллектора.
  4. Включите аспиратором. Открыть красные футболки с клапанами для фильтрации. Запустите коллектор, пока картридж фильтра не высохнет, ткурица повернуть красный Т-образный клапан в нерабочее положение.
  5. Повторите шаги 3.1-3.4, пока желаемое количество воды не будет отфильтрован.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения 1 л воды, взятой из субтропических коралловых рифов, она занимает около трех минут для фильтрации.
  6. Осторожно вынуть патрон фильтра из пластикового пакета и вакуумный разъем.
  7. Закрывают оба конца картриджа с входным и выходным Luer крышками.
  8. Этикетка картриджа и входное отверстие Люэра колпачок надлежащим образом с помощью пера растворителя доказательство для быстрой сушки и без размазывания маркировки.
  9. Храните картридж фильтра при -20 ° С до экстракции ДНК.

4. Фильтрация воды (> 4 л) образцов с использованием картриджа фильтра

Примечание: Пропустите этот шаг, если объем фильтрации воды ≤4 L. Эта система фильтрации требует книга бутылки емкостью 10 л, снабженный клапаном и одноразового 10 мл кончика пипетки. Внутренний диаметр 10 мл пипетку (15,0 мм) и конусность наконечникаконец должен соответствовать к внешнему диаметру клапана (15,0 мм) и впускным отверстием фильтрующего патрона, соответственно. Оба соединения удерживаются надежно во время фильтрации в порыве трения. Стерилизовать кончик пипетки с 10% коммерческого отбеливателя (около 0,6% гипохлорита натрия) перед использованием.

  1. Подготовьте соответствующее количество отобранного воды в книжном бутылке. Плотно вставьте наконечник пипетки 10 мл в клапан 10 л книжной бутылки.
  2. Плотно вставьте выпускное отверстие картриджа фильтра в конце наконечника пипетки и вставить силиконовую пробку во входное отверстие коллектора. Включите аспиратором. Открыть красные футболки с клапанами для фильтрации. Запустите коллектор, пока картридж фильтра не высохнет, затем поверните красный Т-образный клапан в нерабочее положение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения 10 л морской воды, взятой из субтропических внешних коралловых рифов, она занимает около 30-40 мин для фильтрации.
  3. Осторожно вынуть патрон фильтра из пластикового пакета и вакуумный разъем. Cap какконцы картриджа с входным и выходным Luer крышками. Этикетка картриджа и входное отверстие Люэра колпачок надлежащим образом с помощью пера растворителя доказательство для быстрой сушки и без размазывания маркировки. Храните картридж фильтра при температуре от -20 ° C до экстракции ДНК.

5. Извлечение Эдна из фильтра

Примечание: В пунктах 4 и 5, мы используем коммерческий набор, в основном в соответствии с протоколом для "зародышевого крови", представленной в комплекте. Для простоты мы опишем процедуру обработки отдельного картриджа. На практике мы рекомендуем обработку 8 (или максимальное количество центрифуге) или меньшее количество фильтров одновременно.

  1. Разогреть инкубатор до 56 ° C.
  2. Приготовьте 2,0 мл трубки, разрезав шарнирный колпачок из трубки. Выбросите колпачок.
    Примечание: Эта трубка используется в качестве коллекторной трубки для оставшейся жидкости в фильтре.
  3. Снимите впускной канал (НЕ на выходе) Люэра колпачок с картриджа фильтра и вставьте I входное отверстиеNto пробирку. Плотно запечатать соединение между картриджем и коллекторной трубки, используя самогерметизирующегося пленку.
  4. Вставьте комбинированное устройство в адаптер центрифуг для 15-мл коническую трубку. Центрифуга картридж при 5000 х г в течение 1 мин для удаления оставшейся жидкости в фильтре.
  5. Снимите трубку сбора из картриджа фильтра и удалите трубку. Повторно колпачок впускное отверстие картриджа.
  6. Приготовить смесь из 20 мкл раствора протеиназы-К, 220 мкл PBS (фосфатный солевой буфер, не обеспечиваются комплектом) и 200 мкл буфера AL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрующий вмещает до четырех раз объемов смеси (. Ок 1,8 мл).
  7. Снимите впускной колпачок и добавьте смесь (440 мкл) в картридж фильтра с помощью пипетки. Вставьте пипетку полностью во входное отверстие так, чтобы кончик пипетки виден внутри картриджа непосредственно над мембраной.
  8. Re-колпачком впускное отверстие и поместить фильтр автомобиляTridge на роторной качалке.
  9. Поместите ротационного шейкера в предварительно разогретой инкубаторе при 56 ° С и включите шейкере со скоростью 20 оборотов в минуту в течение 20 мин.
  10. Во время инкубации, подготовить новый 2,0 мл трубки, маркировать трубку надлежащим образом с использованием растворителя доказательства ручку и поместить его в 50-мл коническую трубку.
    Примечание: Прежние (2,0 мл) и последние пробирки (50 мл) используются для сбора извлеченной ДНК и для удержания 2,0 мл трубки, соответственно.
  11. После инкубации, снимите впускной колпачок и вставьте входное отверстие (не выпускной) порт картриджа в 2,0 мл трубки в 50 мл коническую трубку. Закройте коническую трубку объемом 50 мл с завинчивающейся крышкой.
  12. Центрифуга 50-мл коническую трубку при 5000 х г в течение 1 мин, чтобы собрать экстрагированной ДНК из картриджа. Извлеките картридж фильтра и 2,0 мл пробирку с помощью стерилизованных щипцов и колпачок трубки. Откажитесь картридж фильтра.

6. Очистка экстрагированной ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы вымывается Эдна с 100 мкл буфера АЕ вместо 200 мкл, указанных в руководстве по эксплуатации коммерческого набора.

  1. Добавить 200 мкл этанола (96-100%) с экстрагированной ДНК в 2,0-мл пробирку с описанной выше стадии (приблизительно 440 мкл), и тщательно перемешать встряхиванием.
  2. Пипеткой смесь в ротационную колонку, помещенного в пробирку для сбора 2 мл. Центрифуга при 5000 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от проточных и пробирку для сбора.
  3. Поместите колонку отжиму в новой коллекции трубки 2 мл, добавляют 500 мкл буфера для AW1 и центрифугу в течение 1 мин при 5000 х г. Откажитесь от проточных и пробирку для сбора.
  4. Поместите колонку отжиму в новой коллекции трубки 2 мл, добавляют 500 мкл буфера для Aw2 и центрифугу в течение 3 мин при 20000 х г. Откажитесь от проточных и пробирку для сбора.
  5. Подготовьте новый 1,5 мл трубки (не входит в комплект) и маркировать трубку надлежащим образом с использованием водонепроницаемого ручка для быстрой сушки и без размазывания маркировки. Перенести спин колонки тO в 1,5 мл трубки.
  6. Элюции ДНК путем добавления 100 мкл буфера AE в центре мембраны ротационную колонку. Инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре, а затем центрифуге при 6000 х г в течение 1 мин.
  7. Выбросите колонку спиновый и колпачок трубки. Хранить очищенной ДНК при -20 ° С.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Это технически трудно выделить и количественно только рыбу Эдна из извлеченной объемной Эдна, поскольку MiFish праймеры coamplify целевой регион от некоторых нерыбных позвоночных животных, таких как птицы и млекопитающие, с PCR продуктами одного и того же размера (ок. 170 б.п. ) 12. Вместо того, чтобы количественной оценки рыбы Эдна, мы выполняем MiFish metabarcoding анализ Эдна из аквариума бака с известным составом пород с использованием двух различных методов фильт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Во многих исследованиях metabarcoding с использованием проб окружающей среды , такие как вода и почва, лечение после фильтрации картриджа фильтра , как правило , следующим образом 24,25: 1) разрезав или растрескиванию корпус с ручным инструментом (резцом насосно - компрессорных труб или плоскогубцами); 2) удаление фильтра из картриджа; и 3) разрезание фильтра на мелкие кусочки с лезвием бритвы для экстракции ДНК. Чтобы избежать таких громоздкой и отнимает много времени процедуры, которые склонны к загрязнению...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано в качестве фундаментального исследования CREST от Японского агентства по науке и технике (JST) и грантами от JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) и Canon Foundation для M.M. Спонсоры не играли никакой роли в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сетчатая панельIris OhyamaMPP-3060-BE
Металлический зубецIris OhyamaMR12F
Подставка для сетчатой панелиNoмарки 4184-9507доступен на Amazon
Japan Пластиковый пакет 1 л с завинчивающейся крышкойYanagiDP16-TN1000
Male luer-lock connectorISIS11620
10 мл наконечник для пипеткиEppendorf0030 000.765
10 л бутылка для книги с клапаномКак один1-2169-01
Фильтр Sterivex-HVMilliporeSVHVL10RCобозначается как «картридж фильтра» на протяжении всего мс и используется в протоколе
Фитинг люэра с наружной резьбойКак один1-7379-04
Фитинг с внутренней резьбой ЛюэраКак один5-1043-14   
Входной люэровский колпачокISISVRMP6
Выпускной люэровский колпачокISISVRFP6
Высоковакуумная трубкаКак один6-590-01
Вакуумный соединительКак один6-663-02
Силиконовая пробкаКак один1-7650-07
КоллекторКак один2-258-01
Аспиратор-GAS-1как один1-7483-21
DNeasy Blood & Набор для салфеток (250)Qiagen69506
PowerWater Sterivex Набор для изоляции ДНКMO BIO14600-50-NFобозначен как "дополнительный комплект" в MS
Настольная центрифугаKubotaModel 4000Максимальная скорость 6 000 об/мин
Ротор с фиксированным углом наклонаKubotaAT-508C
Адаптер для конической пробирки 15 млKubota055-1280
Стабилизирующий раствор RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7020
ParafilmPM992обозначен как "самогерметизирующаяся пленка"

Ссылки

  1. Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584(2013).
  2. Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868(2012).
  3. Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
  4. Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
  5. Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
  6. Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316(2013).
  7. Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
  8. Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
  9. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520(2013).
  10. Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732(2012).
  11. Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
  12. Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088(2015).
  13. Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
  14. Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786(2016).
  15. Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
  16. Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
  17. Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
  18. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161(2009).
  19. Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
  20. Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
  21. Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383(2015).
  22. Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
  23. Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
  24. Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
  25. Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
  26. Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
  27. Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
  28. Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
  29. Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
  30. Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
  31. Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
  32. Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи