Молекулярная диффузия в плазматических мембранах первичных лимфоцитах Измеренные с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии

Краткое содержание

Описан метод измерения диффузии белка в мембранах первичных иммунных клеток с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). В данной работе проиллюстрировано использование антител для флуоресцентного мечения.

Аннотация

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) является мощным средством для изучения диффузии молекул в биологических мембранах с высоким пространственным и временным разрешением. FCS может количественно концентрации молекул и коэффициент диффузии флуоресцентно меченных молекул в клеточной мембране. Этот метод имеет возможность исследовать молекулярные характеристики диффузии молекул в плазматической мембране клеток иммунной системы в устойчивом состоянии (т.е. без процессов , влияющих на результат в течение фактического времени измерения). FCS пригоден для изучения диффузии белков, которые экспрессируются на уровнях, характерных для большинства эндогенных белков. Здесь, простой и надежный метод для определения скорости диффузии клеточных мембран белков на первичных лимфоцитов демонстрируется. Эффективный способ для выполнения измерений на антитела окрашенных живых клеток и часто встречающихся наблюдений после приобретения описаны. Последние достиженияв развитии фото- стабильными флуоресцентные красители могут быть использованы сопряжением интерес антител к соответствующим красители, которые не отбеливателем широко во время измерений. Кроме того, это позволяет обнаруживать медленно диффундирующих лиц, что является общим признаком белков, экспрессируемых в клеточных мембранах. Процедура анализа для извлечения параметров концентрации молекул и диффузии из генерируемых кривых автокорреляционных выделена. Таким образом, базовый протокол для измерения FCS предусмотрен; это может сопровождаться иммунологи с пониманием конфокальной микроскопии, но без другого предыдущего опыта измерений динамических параметров, таких как молекулярные скорости диффузии.

Введение

Многие иммунные клетки функции зависят от молекулярной диффузии и взаимодействий внутри мембран. Биологические мембраны являются сложными, и многие факторы , которые могут быть важны для функционирования иммунных клеток может влиять на скорость трансляционной диффузии белков внутри клеточных мембран ^1. Недавно мы показали , что естественные киллеры (NK) клетки, лимфоциты , принадлежащие к врожденной иммунной системе, обнаруживают дифференциальную диффузии двух исследуемых белков на клеточной мембране в зависимости от состояния активации NK - клеток ^2.

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), представляет собой метод, который способен количественной оценки молекулярных скоростей диффузии в биологических мембранах. Он сообщает, средняя скорость диффузии флуоресцентно меченных молекул в фиксированном объеме, как правило, в центре внимания конфокальной микроскопии. Он основан на измерении колебаний флуоресценции, которые возникают при движении в молекулярномсистема в стационарном состоянии. FCS, широко используется для изучения диффузии флуоресцентных красителей и белков, как в растворе, и в липидных мембранах. Другие выходные параметры , влияющие на скорость диффузии может быть также косвенным образом изучены таким образом (например, конформационные изменения белков или взаимодействий молекул на клеточных мембран) ^{3, 4.} FCS выделяется по сравнению с другими методами из-за его высокой чувствительности, что позволяет возможность для обнаружения одиночных молекул. Он хорошо работает для молекулярных концентраций в наномолярной в миллимолярной диапазоне, что характерно для эндогенных уровней экспрессии большинства белков ^5. Кроме того, FCS может дать приближение абсолютного количества белков в составе исследуемого объема, в то время как большинство других методов только дают относительную информацию об уровнях экспрессии белка. Другие методы для измерения молекулярных скоростей диффузии внутри мембраны включают Fluoвосстановление ценция после фотообесцвечивания (FRAP), одночастичные слежения (СПТ), множественный обскура FCS, и корреляции изображений методы. FRAP и корреляции изображений методы ансамбля методы, которые обычно не дают информации о абсолютного числа молекул ^10. По сравнению с SPT, пропускная способность FCS выше в отношении характеризующий среднюю численность населения. Анализ также менее требовательны, так как средняя скорость диффузии молекул, присутствующих в фокусе лазера измеряется, а не скорости отдельных молекул. Кроме того , если специализированные микроскопы не доступны ^11, СПТ не может дать никакой информации о концентрациях, так как стандартная маркировка SPT должна быть очень низкой , чтобы для идентификации одиночных молекул. С другой стороны, ССК требует исследуемых молекул, чтобы быть мобильным. Он просто не обнаруживает каких-либо предполагаемых неподвижные фракции или молекулы движутся очень медленно. Скорость диффузии молекул,находиться в центре внимания больше , чем примерно одна десятая часть времени приобретения не будут правильно представлены в измерениях FCS ^{3, 12.} Таким образом, коэффициенты диффузии, записанные FCS, как правило, быстрее, чем скорость диффузии сообщили из таких методов, как FRAP и СПТ, где близкие к неподвижна и очень медленные фракции принимаются во внимание, как хорошо. SPT также дать более подробное описание изменчивости скоростей диффузии в молекулярной населения, чем может FCS.

FCS квантифицирует колебания интенсивности флуоресценции с течением времени в пределах возбужденного объема. В случае мембранных измерений, это приводит к освещаемой площади мембраны. В данной работе мы используем тот факт, что такие колебания индуцированный молекулами, проявляющих броуновской диффузии и, таким образом, движется в и из объема возбуждения. Есть также несколько других возможных источников для Колебанияции в сигнале флуоресценции, такие как моргание или присутствии триплетного состояния в флуорофоров, воздействие на окружающую среду, связывающий необязывающий лиганда, или перемещение всей клеточной мембраны. Эти мнимые источники ошибок должны быть приняты во внимание при разработке эксперимента FCS для того , чтобы точно интерпретировать результаты ^{12, 13.} Как правило, боковые скорости диффузии в биологических мембранах невелик из-за скученности и взаимодействий, как между мембранными белками и между белками и цитоскелетом. Исторически сложилось, что использование FCS в мембранах Таким образом , было затруднено из - за отсутствия фото стабильных флуорофоров, которые необходимы , чтобы избежать отбеливания во время длительного времени прохождения через фокус ¹⁴ возбуждения. Тем не менее, на сегодняшний день, существует множество вариантов подходящих фото устойчивых красителей. Значительное улучшение детекторов и другого оборудования также позволяют обнаруживать флуоресцентного защмодули и красители более низкой яркости. Здесь, основной протокол для применения FCS с использованием мышиных первичных лимфоцитов, где представляющий интерес белок, меченный флуоресцентно меченого антитела, описывается. Подход, чтобы соответствовать кривые автокорреляции для того, чтобы извлечь коэффициент диффузии и плотность молекул также показана. Протокол направлен на быть легко следуют иммунологи без предыдущего опыта методов для изучения диффузии молекул. Тем не менее, основное понимание конфокальной микроскопии , как ожидается , (чтобы получить это базовое понимание, см ссылку ^15). Этот протокол может быть относительно легко адаптированы к другим суспензии клеток, как клеточные линии и первичные клетки. Для более опытных пользователей FCS, существуют более тонкие методы анализа, некоторые из которых описаны в обсуждении.

Протокол

1. Окрашивание для FCS

1. Изолировать мышиные клетки NK из лимфоцитов селезенки с использованием магнитной маркировки шарика, в соответствии с протоколом производителя ^16. Используйте 2-3 × 10 ⁵ клеток на образец для следующих шагов.
   Примечание: С помощью негативной селекции для обогащения популяции клеток-мишеней, оставляя его нетронутым, так что клетки могут быть помечены с использованием первичных антител в одиночку. См ссылку ² для получения более подробной информации о изоляции клеток от мышей ^2.
2. Для мышиных клеток, экспрессирующих рецепторы Fc, блокируют рецепторы Fc с антителом клона 2.4G2 при 5 мкг / мкл в 25 мкл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и 1% фетальной телячьей сыворотки (FBS) на образец. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
3. Приготовление смеси антител.
   1. Использование антител непосредственно конъюгирован с фотографического стабильной флуорофора. Если два антитела против двух различных белковиспользуются, используют флуорофоры , которые имеют хорошо отделенного спектры излучения , чтобы минимизировать перекрестные помехи (например, возбуждаются 488 и 633 лазеров ^2, а затем в протоколе упоминается как "зеленых" и "красных" лазеров и флуорофоров, соответственно ).
      Примечание: Если коммерческие антитела, меченные с фото-стабильными флуорофоров недоступны для выбранных биомаркеров, сопряженными немаркированные антитела к флуорофоров в соответствии с инструкциями изготовителя. См Материалы таблицу для антител , используемых в данном исследовании.
   2. Готовят смесь антител путем разбавления флуоресцентно меченые антитела против белка или белков, представляющих интерес в PBS + 1% FBS. Добавляют смесь антител к каждому образцу до конечного объема 50 мкл на пробу. Инкубируют на льду в течение 45 мин в темноте.
      Примечание: Оптимизация концентрации антител заранее, чтобы убедиться, что антитело используют в концентрации насыщающей, как правило,1-10 мкг / мл.
4. После инкубации промыть клетки путем добавления 250 мкл PBS и центрифугировать их при 150 х г в течение 3 мин. Удалите супернатант.
5. Повторите шаг 1.4.
6. Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS + 1% FBS. Держите на льду и в темноте до приобретения.
   Примечание: клетки мышиной NK могут быть сохранены на льду в течение до 10 часов.

2. Подготовка микроскопа камерные покровного стекла Слайды

Примечание: Используйте камерные покровного стекла слайды или посуда с толщиной покровного стекла, что микроскоп был оптимизирован для, либо # 1 или # 1.5. Если микроскоп не выровнены для определенной толщины, или , если оно неизвестно, микроскоп воротник кольцо должно быть оптимизировано для текущей толщины покровного стекла ^17.

1. Развести поли-L-лизина с дистиллированной водой в соотношении 1:10. Добавить 200 мкл разбавленного поли-L-лизин в камеры и инкубировать в течение 20 мин.
2. Удалитьполи-L-лизина с помощью аспирации и дайте высохнуть на воздухе в камере, оставив ее без крышки при комнатной температуре в течение по крайней мере, 20-30 мин.

3. Запуск системы FCS

Примечание: Этот протокол относится к конкретной системе микроскопа и программного обеспечения (см Материалы / Реагенты таблицу), хотя и другие микроскопические настройки и программные пакеты могут быть также использованы.

1. Включите конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с коррелятором FCS. Открытое программное обеспечение в режиме "Эксперт". Выберите 40X воды погружения линз.
2. На вкладке "Приобретать", нажмите кнопку "Config" и кнопки "Scan" , чтобы открыть "Управление конфигурацией" и окна "Контроль Scan" (Windows А и В на рисунке 1, соответственно). На вкладке "Confocor", нажмите кнопку "Мера" , чтобы открыть окно "Измерение" (окно C на рисунке 1).
3. Создайте папку для сохранения FCSизмерения. Начать новую базу данных изображений, нажав кнопку "Создать" на вкладке "Файл".
4. С помощью кнопки "Laser", включите галогенной лампы и соответствующих лазеров для возбуждения флуорофоров (например, 488 нм для «зеленого» лазера возбуждения и 633 нм для возбуждения "красного" лазера возбуждения).
5. Выберите подходящие возбуждения и эмиссии фильтров и активировать соответствующие детекторы.
   1. Укажите настройки для захвата изображения, в том числе лазерного возбуждения, возбуждения и испускания фильтров, пути света и детекторы, которые будут использоваться, в окне "Управление конфигурацией".
   2. Аналогичным образом, указать соответствующие параметры для измерения FCS в окне "Измерение" на вкладке "Конфигурация системы". Использовать как аналогичные параметры, как это возможно для работы с изображениями и FCS.
   3. Активируйте каналы обнаружения для записи FCS, установив флажок "Ch1" для зеленого CHANNEл и "Ch2" для красного канала в окне «Измерение».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки должны быть оптимизированы для флуорофора (ов), как и в стандартном эксперименте конфокальной микроскопии. В последующих экспериментах, одни и те же настройки FCS могут быть использованы повторно, открыв старый FCS файл, используя выпадающее меню "Confocor" в верхней части пользовательского интерфейса, и выбрав пункт "Открыть файл". Нажмите кнопку "Повторное использование" в появившемся окне приобретения. Кроме того, настройки захвата изображений могут быть загружены путем открытия сохраненного изображения и нажав "Повторное использование".
6. Подождите, пока лазер не стабилен перед проведением измерений FCS. Это может занять до 30 минут для газовых лазеров, в то время как диодные лазеры стабилизации быстрее. Отрегулируйте крошечное отверстие во время ожидания.

4. Регулировка обскуры

1. Приготовьте 0,2-0,5 мкМ растворов флуорофоров или флуоресцентных красителей, соответствующих возбуждению и излучения этикетки на антитела.флуорофоры , должно быть , известно , коэффициенты диффузии ^{18, 19.}
2. Нанесите каплю 50 мкл раствора с флуорофором, возбуждаемых зеленым лазером в центре скважины в камерно покровного стекла слайда. Нанесите каплю дистиллированной воды на цели 40X воды и поместите слайд. Нажмите кнопку "ВИС", чтобы начать видимый свет и пользоваться окуляр, чтобы найти и сосредоточиться на капли флуорофора.
   Примечание: Используйте тот же слайд, как и для последующих измерений клеток, так как предполагаемые незначительные отклонения в толщине стекла между слайдами может повлиять на выравнивание микроскопа.
3. Поместите фокус также внутри капли жидкости (10-100 мкм от дна).
4. В окне "Измерение", выберите вкладку "приобретение". Нажмите "Текущее положение" под "позиции" (окно C на рисунке 1).
5. Вернитесь на вкладку "Конфигурация системы" в том же окне. Установите высокое рАуэр для зеленого лазера.
   Примечание: Высокий мощность лазера относится к мощности насыщающего (т.е. флуоресцентный сигнал не возрастает линейно , если мощность лазера дополнительно увеличивается). Около 1 мВт системы настройки мощности, или 5-10% от максимальной мощности лазера, достаточно типично.
6. Проверьте стабильность сигнала, нажав кнопку "Пуск". Откроется отдельное окно, отображающее время след и кривую автокорреляции для измерения тока. Убедитесь, что флуоресцентный сигнал имеет высокий уровень, стабилен в течение долгого времени, и показывающие колебания в кГц, а не в диапазоне Гц.
7. Нажмите кнопку "O Adjust" в окне "Измерение". Проверьте, если выбран правый канал обнаружения (CH1 или CH2). Нажмите "AutoAdjust X." Если полученная кривая не показывает ярко выраженный максимум, или максимум на краю, отметьте опцию "грубой" и нажмите кнопку "AutoAdjust X" снова. Когда в результате экран в направлении х закончена, сделайте самне для Y, нажав кнопку "автокоррекции Y."
8. Де-выберите "грубого" и чередуются между регулировочным X и Y, нажав кнопку "автокоррекции", пока оба не имеют четкие максимумы и значения не изменяются между измерениями.
9. Если клетки помечены двумя различными флуорофоров, двигаться в камеру, где был добавлен красный флуорофор раствор. Выберите высокую мощность лазера для красного лазера и повторите шаги 4,6-4,8 для красного возбуждения и обнаружения канала.
   Примечание: Если значения X и Y отклоняются между каналами в системах, где только один обскуры используется для обоих каналов обнаружения, выберите промежуточные значения и нажмите кнопку OK, чтобы принять изменения. Здесь для 488 нм лазер с максимумами при X = 79 и Y = 189 и 633 нм лазера с максимумами при X = 80 и Y = 188, значения X = 80 и Y = 189 были выбраны. Сочетание 488 нм и 633 нм лазеров для возбуждения двух антител, меченных флуорофоров, возбуждаемых 488 нм или 633 нм является хорошим выбором, посколькуриск перекрестных помех сводится к минимуму , если эмиссионные спектры не перекрываются ^2.

5. Измерьте время транзита Свободного флуорофора

Примечание: При определении времени прохождения через фокус (TAUD) флуорофора с известным коэффициентом диффузии, величина объема обнаружения, и, следовательно, площадь мембраны клетки, которая находится в пределах фокуса, можно рассчитать. Расчет TAUD описано на шаге 7.2.

1. Используя те же решения , используемые для регулировки обскуры, установите время съемки на 30 сек х 2 повтора на вкладке "приобретение" в окне "Измерение" (Рисунок 1, окно C).
2. Начать измерение, нажав на кнопку "Пуск" в окне "Измерение" (Рисунок 1, окно B).
   1. Выполните мощности лазера серии для каждого лазера возбуждения и соответствующего флуорофора в растворе, начиная с или околонасыщающей мощности и уменьшение вдвое для каждого измерения. Изменение мощности лазера на вкладке "Конфигурация системы" окна "Измерение" (Рисунок 1, окно C). Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать измерение.
      Примечание: Включите мощность лазера для измерений наступающих клеток в нижнем диапазоне (например, измерения в 16, 8, 4, 2 и мкВт мощности, до цели) ^20. настройки системы лазерные в целом выше, чем выходное возбуждение и может изменяться в значительной степени в зависимости от микроскопа и качество выравнивания. В этой системе, вышеуказанный диапазон мощности соответствует приблизительно 60-500 мкВт настроек системы власти. Рекомендуется использовать измеритель мощности для измерения выходной мощности до цели в первый раз используется новый микроскоп. В настоящее время максимальная мощность лазера находится под кнопкой "Info" окна "Измерение".
   2. Запишите счетчики на молькула (CPM, единица измерения: кгц) от каждого измерения мощности лазерного излучения.
   3. Если используются два канала обнаружения, проверьте окно, отображающее кривую автокорреляции для перекрестных помех. Используйте раствор, содержащий только зеленые флуорофоры для измерения обнаруженной FCS автокорреляцию в красном канале обнаружения и решение только с красными флуорофоров для оценки обнаружения в канале обнаружения зеленого. Как правило, держать CPM обнаруженный из "неправильного" флуорофора ниже 5% специфического сигнала от правильного флуорофора.
   4. Проверьте, что значения нелинейную мощности лазера используется. Насыщение CPM на самой высокой мощности лазерного излучения (то есть, немного более низкие значения , чем ожидалось от линейной зависимости) является приемлемым.
      Примечание: цена за тысячу показов должна быть значительно выше 10 для самой высокой мощности лазера для почти всех систем микроскопа и общих флуорофоров и может быть значительно выше для чувствительных систем. Первый раз, когда используется недавно конъюгирован иммунофлюоресценции, выполнитьFCS измерение антитела свободно диффундирующих в растворе для количественной оценки ожидаемой CPM. Перед измерением пальто измерительной камеры с 200 мкл поли-L-лизина, привитые с полиэтиленгликолем (разведенного до 0,5 мг / мл в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. Удалите жидкость пипеткой и позволить камере высохнуть на воздухе. Сохраните исходный раствор в холодильнике (до 2-х недель) и порошок запас в морозильной камере. В микроскопе, разбавленные антитела к 1-10 мкг / мл в PBS. Выполните шаги 4.2-4.4 и 6.7 в этом протоколе. Если поверхность не покрыта раствором антипригарным, антитела будут взаимодействовать с поверхностью стекла и быстро истощаются из раствора.

6. Клеточные Измерения

1. Добавьте 125 мкл клеток в PBS + 1% FCS с антителами меченных клеточной суспензии (шаг 1,5) и 150 мкл прозрачной Roswell Park Memorial Institute среды 1640 (RPMI) в одну лунку 8-хорошо патроннике покровного стекла слайда. Leпр клетки в темноте при температуре измерения в течение по крайней мере 20 минут перед началом измерений FCS.
   Примечание: Это позволяет клеткам осесть и прикрепить к нижней части лунки и для уравновешивания клеток и раствора до температуры измерения.
2. В окне "Scan Control" (рисунок 1, окно B), установите масштаб 1 и начать быстрый XY сканирование, нажав на кнопку "Быстрый XY". Изменение мощности лазера так, чтобы она как можно меньше в то время как клетки все еще ясно видны. Центр изображения на круглой клетке средней яркости, где мембрана четко определена и не существует флуоресцентный сигнал в цитоплазме. Увеличение до тех пор, пока ячейка покрывает большую часть изображения.
3. Выберите новую ячейку, если текущая ячейка перемещается или отображает усики, прессованные или очень яркие пятна. Держите один и тот же масштаб и мощность лазера для всех клеток, захваченных во время того же эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: взъерошенные мембрана также может быть признаком предстоящего APOптоз.
4. Фокус на верхней части клеточной мембраны. На вкладке "Приобретение" окна "Измерение" (рисунок 1, окно C), выберите позицию для измерения FCS путем активации "перекрестье" . В качестве альтернативы, выберите вкладку "LSM изображения", отметьте хотел измерения место в LSM изображения и нажмите кнопку "Добавить позицию."
   Примечание: В верхней части мембраны клетки не будут находиться под влиянием флуоресцентными антителами или флуорофоры неспецифически связанных с поли-L-лизин. Тем не менее, важно, чтобы удостовериться, что клетка не перемещаются во время измерения (см результаты).
5. На вкладке "Приобретение" окна "Измерение" (Рисунок 1, окно C), установите количество повторов до 6-10, с "Мера времени" , установленной на 10 секунд при каждом повторе.
6. Вернитесь на вкладку "Конфигурация системы" окна "Измерение". Регулировка мощности лазера для измерения FCS под "LКнопка Aser ". Перед тем как цели, использовать низкую мощность для измерения клеток, в диапазоне от 1 до 10 мкВт ^20.
   Примечание: Рекомендуемые значения компромисс между обнаружением сигнала и фотостарения к клеткам. Смотри шаг 5.2.1 Обратите внимание на процент мощности лазера эти значения соответствуют.
7. Начните измерение FCS, нажав кнопку "Пуск" в "измерения" окна (окна C). Если ячейка отбеливатели существенно в начале измерения, а обнаруженные капли в трассировке интенсивности более чем на 30% в течение первых 10 сек (пример показан на фигуре 3А, нижняя панель), переместить в другую камеру и нижний мощность лазера для будущих измерений.
   1. Если сигнал потерян, настроить фокус в Z-направлении. После завершения измерения, используйте окно "Scan Control" (рисунок 1, окно B) , чтобы проверить , что клетка еще по центру и , что клеточная мембрана была измерена. Если йе клетка переместилась, отбрасывать измерения.
   2. В окне автокорреляционным где отображается измерение, вручную удалить отдельные повторы , которые содержат изменение масштаба маневры, отбеливание, большие кластеры, или другие артефакты (см примеры на рисунке 3). Сделайте это, пометив их, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав пункт "Удалить". Сохраните окончательный файл в формате .fcs. Сохранить по крайней мере, четыре повторения на клетку.
8. При желании получить изображение клетки в средней части (со всей окружности мембраны видимой) с помощью окна "Control Scan". Захват изображения после измерения FCS, чтобы избежать отбеливания. Нажмите кнопку "Single", чтобы начать захват изображения.
9. При использовании "Добавить позицию" для фокусировки позиционирования FCS, нажмите кнопку "Удалить позицию", прежде чем перейти к следующей ячейке.
10. Изменение к новой аликвоты клеточной суспензии максимум после 2 часов измерения, чтобы сохранить клетки жизнеспособного throughouт эксперимент.

7. Анализ FCS

1. Откройте .fcs файлы в программном обеспечении с возможностью подгонки кривой (см Материалы / Реагенты Стол для программного обеспечения , используемого в данном протоколе).
   Примечание: Программное обеспечение FCS, который поставляется с микроскопом является хорошим местом, чтобы ознакомиться с основными фитинга, но дополнительное программное обеспечение необходимо, чтобы соответствовать двумерную диффузионной мембраны.
2. Во-первых, определить размер тома возбуждения путем анализа свободных измерений флуорофором. Установить 3-мерную свободной диффузии кривую автокорреляции кривых ^21.
   (Уравнение. 1)
   Примечание: Определение параметров: N: среднее количество флуоресцирующих объектов в фокального объема, τ (тау): время корреляции, τ _D (TAUD): среднее время пребывания в фокальный объем, Т 1: вероятность флуорофоров быть в триплетное состояние, τ <к югу> T: время релаксации для переходов состояний синглет-триплетных, S: отношение высоты к ширине диаметра для фокального объема.
   1. Экстракт TAUD, транзитный время для молекулы передачи фокуса.
   2. Используйте наблюдаемые TAUD и опубликованных коэффициентов диффузии (D) флуорофоров , используемых для калибровки ^{18, 19} , чтобы вычислить радиус обскуры (со).
      (Уравнение. 2)
3. Анализ кривых автокорреляции на клеточных мембранах.
   1. Для того, чтобы визуализировать часть кривой , представляющей молекулярную диффузию, выберите временной интервал , начиная до крутого наклона кривой автокорреляционной и заканчивающийся после кривой конвергенциями на 1 (например, от 0,001 до 5 сек для мышиных поверхностных рецепторов, смотри рисунок 4).
   2. Сформировать среднюю кривую автокорреляции отдельных повторов сохраненных Iп шаг 6.7.2.
   3. Установить 2-мерной диффузии через мембрану кривую каждая усредненную автокорреляционную кривую , используя уравнение 3 ^3.
      (Уравнение. 3)
      Примечание: Важные выходные параметры следующим образом: N среднее число молекул, находящихся в возбужденном площади мембраны. Перерасчет для плотности (N / ² мкм). τ _D (TAUD): среднее время пребывания в фокальной области, ограничен двумерности мембраны (ов). Перерасчет среднее время пребывания на коэффициент диффузии (мкм ² / сек) через определенный обскура радиусом (со) и уравнение 2. T1 есть вероятность флуорофоры , чтобы быть в состоянии триплетного. Яркость (СРМ) рассчитывается путем деления средней общей интенсивности измерения на N.
   4. Если хорошо подходят не достигается при первой попытке, изменить исходные значения и / или верхний и нижний пределы для переменных, пока Тхиs достигается.
      Примечание: Типичные верхний нижний пределы скорости диффузии белка в клеточных мембранах первичных являются 10-500 мс для TAUD, 0-100% для T1, и 0,1-5 мс для TauT1. Выберите начальные значения для установки в середине этих интервалов. Часть кривой , представляющей флуктуации флуоресценции , полученных от диффузии , как правило , находится в диапазоне от 1 мс до 1 сек (смотри рисунок 4). В зависимости от флуорофора, там иногда может быть второй процесс присутствует, что приводит к автокорреляции на более коротких временных масштабах, чем параметр диффузии. Это вызвано транзиторной затемненном состоянии (триплет) или миганием (как часто происходят для флуоресцентных белков). Состояние триплет учитывается в уравнении 3, и представленная модель должна, таким образом, также обеспечивают хорошую посадку в таких ситуациях.

Результаты

Типичный результат будет генерировать кривую автокорреляции с временем пролета в диапазоне от 10 мс до 400 мс для мембранных белков. Число молекул может варьироваться в пределах от 0,5 до около 200 мкм ² в течение эндогенно экспрессируемых белков. Тщательно проверьте, что ПСК не ниже, чем ожидалось. Это может означать, что есть влияние фонового сигнала. Как правило, сигнал СРМ на клетках, который принимается для анализа не должно быть ниже, чем 33% от CPM для свободно диффунди...

Обсуждение

Этот протокол для FCS может быть использован для оценки молекулярной динамики поверхностных молекул на всех типах клеток иммунной системы (мышиным, человеческим или других видов). FCS меры пространственно-временные молекулярной динамики с разрешением до одной молекулы в живых клетках. Плотность молекул, а также динамика скорости диффузии и кластеризацию интерес белков, могут быть извлечены из кривых автокорреляции.

Флуоресцентным имеет ключевое значение для успешных экспериментов FCS. Предст...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Отрицательный отбор NK-клеток
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Sigma-Adlrich	F7524	Термоинактивированный
фосфатный буферный раствор	-	-	Сделано в домашних условиях
Мемориальный институт Розуэлл Парк Медиум 1640	PAA Компания по производству клеточных культур	E15-848	Прозрачная среда
Клон антитела 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Для блокирования Fc-рецепторов.
Антитела Anti-Ly49A			Моноклональное антитело, изготовленное в собственном производстве и конъюгированное с антителом Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd	BD Pharmingen	558915	конъюгирован внутри компании с MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Флуоресцентный краситель для конъюгации антител.
Поли-L-лизин	Sigma-Aldrich	P8920	разведенный в дистиллированной воде (1,10)
Поли-L-лизин (20 кДа), привитый полиэтиленгликолем (2 кДа)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3,5]-PEG(2),	разведенный в PBS (pH 7,4) до 0,5 мг/мл.
Родамин 110 хлорид	Сигма-Олдрич	432202	Известный коэффициент диффузии: 3,3 &раз 10− 10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Известный коэффициент диффузии: 4,4 × 10− 10 m2/sec 20
Конфокальный микроскоп	Zeiss	LSM510
Программное обеспечение: Confocor 3	Zeiss
Программное обеспечение: Matlab с набором инструментов для подгонки кривой	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 лунок, 1,0 боросиликатное дно