Инъекционный метод Альтернативный и Validated для доступа субретинальной пространства с помощью Подход склеру Задней

Summary

Субретинальные инъекции являются наиболее распространенным методом доставки крупных терапевтических агентов, таких как белки и вирусные векторы, к фоторецепторам и пигментному эпителию сетчатки. Здесь описан альтернативный метод на мышах, который успешно воздействует на субретинальное пространство с минимальным сопутствующим ущербом и быстрым временем восстановления.

Abstract

Субретинальной инъекции были успешно использованы в обоих людей и грызунов для доставки терапевтических вмешательств белков, вирусные агенты и клетки к interphotoreceptor / субретинальном отсек, который имеет прямой контакт с фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (RPE). Субретинальной инъекции плазминогена, а также недавние доклинические и клинические испытания продемонстрировали безопасность и / или эффективность доставки вирусных векторов и стволовых клеток для лиц с прогрессирующим заболеванием сетчатки глаза. Мышиные модели заболевания сетчатки, особенно наследственной дистрофии сетчатки глаза, имеют важное значение для тестирования этих методов лечения. Наиболее распространенной процедурой инъекции у грызунов является использование небольшой транскорнеальной или склеру надрезы с передним подходом к сетчатке. При таком подходе, инъекционная игла проникает в нейросенсорной сетчатки, срывающее лежащую в основе ПЭС и при вставке может легко ник объектив, в результате чего объектив помутнение и ухудшение неинвазивной томографовнг. Доступ к субретинальной пространство через склеру, задний подход позволяет избежать этих проблем: игла пересекает склеры примерно 0,5 мм от зрительного нерва, без проникновения сетчатки и позволяет избежать разрушения стекловидного. Сопутствующий ущерб ограничен, что связано с фокальной склеротомия и последствия переходного процесса, серозной отслойки сетчатки. Простота метода минимизирует глазное травмы, обеспечивает быстрое воссоединении и восстановление сетчатки глаза, и имеет низкий процент отказов. Минимальное повреждение сетчатки и ПЭС позволяет четкой оценки эффективности и непосредственного воздействия самих терапевтических агентов. Эта рукопись описывает новый субретинальной технику инъекции, которая может быть использована для целевых вирусных векторов, фармакологические препараты, стволовые клетки или индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клетки в субретинальной пространство у мышей с высокой эффективностью, минимальным повреждением, и быстрое восстановление.

Introduction

Субретинальной инъекции являются основным средством доставки клеточных и вирусных агентов в сетчатке мышей , чтобы изучить их влияние на фоторецепторы и лежащей в основе ПЭС ^1,2. Большинство субретинальном протоколов инъекций у мышей используют транскорнеальной или склеру месте инъекции кпереди от экватора (рис 1). Такой подход может привести к присущего сопутствующий ущерб , который включает зазубрин и результирующая помутнение хрусталика, нарушение целостности стекловидное, проникновение нейросенсорной сетчатки и радужной оболочки глаза, кровоизлияние в сетчатку глаза, значительные отслоения сетчатки и прочного субретинальном отека ^3-9. Экспериментальные манипуляции должны преодолеть эти эффекты, чтобы оценить эффект терапевтических вмешательств ^3,7,10,11. Данное исследование содержит подробное описание и проверку на задней склеру инъекционным методом, который позволяет избежать этих осложнений, сводит к минимуму травмы и имеет высокий уровень успеха таргетинга субпространство сетчатки глаза.

Инъекции таргетингом субретинальной пространство у мышей часто очень трудно выполнить , и большинство исследователей сталкиваются с высокой частотой неудачных попыток , в которых вектор доставляется на неверное место или где существует значительный ущерб сетчатки, например , в полной отслойке сетчатки ^6. Число глаз исключены из анализа из-за инъекций осложнений, как правило, не сообщается в исследованиях на мышах, но в нашем собственном опыте и в дискуссии с другими исследователями, число неудачных инъекций может достигать 50% и варьируются в зависимости от опыта и возможности исследователя, выполняющего инъекции. Успех инъекции , как правило , оценивается путем непосредственного глазного визуализации и / или оптической когерентной томографии (OCT) ^7,9. Легко освоен метод с высокими показателями успеха для субретинальной инъекций у мышей может ускорить экспериментирование и снизить стоимость доклинических исследований Треatments для заболеваний сетчатки, которые являются основными причинами слепоты в Соединенных Штатах.

Задняя, склеру техника субретинальной инъекции , описанный здесь является адаптацией из клинических и доклинических протоколов ^9,12. Неинвазивной диагностики оценки, выполненные в мышах демонстрируют инжектированных мягкий и очень локализованное повреждение и отсутствие дополнительного залога объектива, сетчатки и RPE травмы. Кроме того, при относительно небольшой практики, экспериментатор может достичь этих результатов с высокой вероятностью успеха (80 - 90% или выше), тем самым снижая затраты, связанные с такими исследованиями. Эта процедура может быть использована для доставки сотовых, вирусные или фармакологические терапевтические вмешательства в фоторецепторов и / или ПЭС в доклинических исследованиях и легко оценить экспериментальные вмешательства.

Protocol

Животные: дикого типа C57BL / 6J мышей разводят в Университете Калифорнии в Лос-Анджелесе (UCLA). Все животные были в возрасте от 11 - 17 недель, а также включены мужские и женские мышей. Все мыши были размещены-группы, поддерживали в 12:12 цикле свет / темнота с пищей и водой вволю. Все эксперименты проводились в соответствии с ведомственным руководящим принципам Калифорнийского университета и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии Заявление по использованию животных в офтальмологических и Vision Research.

Примечание: Все препараты и инъекционные агенты Фармакопеи США (USP) класса.

1. Хирургическая подготовка

1. Обезболить мышь с внутрибрюшинного введения 100 мг / кг кетамина и 8 мг / кг ксилазина в солевом смеси. Администрирование анестезии на глубину таким образом, что мышь не имеет ног щепотку или роговичных сенсорные рефлексы.
2. Поддержание температуры тела при 37,0 ° C с циркулирующей водой площадку.
3. Разбавить учеников с 2,5% фенилэфрина глаз дROPS и отделка усов для облегчения визуализации. Нитевидные кристаллы обеспечивают существенную сенсорную информацию для мыши, поэтому, нитевидные кристаллы обрезки следует удалить только ту часть, которая блокирует свободного доступа к глазу, а не к основанию усов. В нашем опыте, мышей показывают нормальное восстановление после этой процедуры. Применение метилцеллюлозы глазные капли для предотвращения сухости и свести к минимуму обезболивающий индуцированные переходных катаракту ^13.
4. Стерилизовать инструменты перед операцией (т.е. бетадин и этанола или горячих шариков).
5. Готовят разбавленный флуоресцеин (0,01% с использованием 0,9% солевой раствор) в стерильной среде (то есть, шкаф биологической безопасности) , если визуализация будет выполнена (см раздел 3 ниже).

2. Инъекции Подготовка сайта

1. Подготовьте шприц (например, 5 мкл шприц) с соответствующим объемом впрыска (например, от 0,3 до 1,0 мкл).
2. Поместите мышь так глаз вверх и хорошо видны в диssecting микроскоп.
3. Осторожно зажать временную конъюнктиву с тонкими щипцами с наконечниками. Делают окружную надрез приблизительно 90 градусов, используя изогнутые ножницы Vannas.
4. Повторите шаг 2.3 с капсулой, лежащих в основе теноново.
5. Резекцию окружающую соединительную ткань с тонкими щипцами с наконечниками, вращая глобус интраназально. Работа в направлении места инъекции приблизительно 0,5 мм височной зрительного нерва. Используйте большую осторожность, чтобы избежать нарушения ретро-орбитальной пазухи.

3. склеротомия и субретинальном Инъекции

Примечание: Рекомендуется, чтобы инъекция 0,01% флуоресцеина в 0,9% солевой раствор можно использовать для оказания помощи визуализации во время обучения этой процедуры. Топографическая распределение флуоресцеина может быть эффективно документирован с фундус томографии (смотри раздел 4 ниже).

1. Сделайте небольшой надрез склеры в месте инъекции, осторожно царапая окуляр с 22,5 градусов офтальмологической лезвия. Разрез ShouЛД быть только достаточно большим, чтобы позволить кончик иглы, чтобы пройти через склеру.
2. Вставьте скошенную 33 G иглу (угловая 5 -. 10 ° в склеротомия с скос лицом и под углом параллельно сетчатке Вводят желаемого объема (например, от 0,3 до 1,0 мкл 0,01% флуоресцеина для целей обучения).
   Примечание: сохранения стерильности шприца путем тщательной очистки с последовательными промывками подходящего растворителя и деионизированной водой перед каждой инъекцией.
3. Выжмите поршень медленно (в течение ~ 3 сек) без перемещения иглы и с равномерным давлением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда игла находится в субретинальной пространстве, небольшое сопротивление будет ощущаться во время нажатия на поршень. не Там будет не к минимальным сопротивлением, если игла протыкает сетчатку, и высокое сопротивление, если игла не проникает через склеру или ППД.
4. Подождите несколько секунд до снятия иглы, чтобы минимизировать обратный поток.
5. Промыть глаза стерильным солевым буфером и обеспечить зрительный часпри вращении назад в нормальное положение.

4. Оценка Отслойка ОКТ и Fundus изображений

1. Выполните визуализацию OCT сразу после инъекции, чтобы оценить качество инъекции и в соответствующее время указывает после инъекции по мере необходимости для оценки структуры сетчатки глаза.
   Примечание: Примеры использования ОКТ в аналогичных исследованиях было описано ранее ^7,14.
   1. Настройка и выравнивания изображения ОКТ целевой сайт инъекции. Место инъекции должно быть по средней линии и 0,5 мм височной к головке зрительного нерва. Повторите по мере необходимости, если отряд находится вне кадра или не оптимально по центру.
2. Визуализируйте отслоение сетчатки и красителя инъекции площадь с ванной лица фундус визуализации ^7,14.
   Примечание: Если система формирования изображения ОКТ отсутствует, инъекция небольшого количества флуоресцеина с вектором для практики позволит визуализации с любой фундус-камеры, которая выполняет флуоресцеина ангиографии с использованием тех же длинах волн возбуждения и задерживающие фильтры. Локализованные участки гипер-флюоресценции появится под сосудистую и сосудистую сеть будет иметь острые и четкие границы, если субретинальной пространство правильно ориентированы. Край пузырьке из нагнетательной будет разграничена переходом от гипер- к гипо- флуоресценции. Несколько приборов обеспечивают эту возможность для мыши; измерительные приборы используются здесь описано в другом месте ^14.

5. Послеоперационный уход

1. Нанесите толстый слой тройного антибиотика офтальмологической крема на поверхности роговицы, закачиваемой глаза.
2. Место мышей в чистых одиночных клеток для восстановления. Не совмещайте мышей, которые подверглись операции, пока они не будут полностью восстановлены.
3. Монитор дыхания и температуры во время наркоза. Монитор животных, пока они не могут поддерживать грудины лежачее.
4. Выполните соответствующие дополнительные послеоперационный мониторинги лечение, в том числе подкожной инъекции карпрофена (5 мг / кг) для послеоперационной боли.

6. Оценка Ретинального функции по электроретинография (ЭРГ)

1. Выполнить анализ ERG предварительного впрыска и в соответствующие моменты времени после инъекции по мере необходимости для оценки функции сетчатки глаза. Если инъекция была сделана в субретинальной пространстве, отслойка сетчатки должны решить в течение 72 часов.
   1. С помощью стандартных методов ЭРГ для оценки функции сетчатки глаза до и после инъекции , как описано выше ^14,15.

7. Реконструкция и 3D пузырьке Том Количественное

Примечание: сканирование с октября высококонтрастный охватывающий весь отряд в кадре зрения являются оптимальными для использования. ImageJ / Фиджи ^17,18 и Imaris были использованы, но другое программное обеспечение может быть использовано.

1. Экспорт-скан интерес, импорт в ImageJ / Фиджи и культур (Изображение> Crop) в части SC ОКТАн быть смоделированы с помощью прямоугольного выбора инструмента.
   1. Регулировка контрастности (Image> Adjust> Brightness / Contrast) и разграничить недостающие границы путем соединения двух секций с линией.
   2. Нарисуйте прямую линию с линией инструмента (холдинг сдвига), который охватывает ППД к фоторецепторов слоя. Мера (Анализ> Мера) длина линии, чтобы получить размер максимального отрыва на этапе 7.8.
2. Импорт обрезанные кадры в программное обеспечение 3D-реконструкции (см Таблицу материалов) с помощью "RGB к серому" плагин и MATLAB Compiler время выполнения.
3. Установить размер воксела (под Свойства изображения), используя параметры калибровки из сканирования ОКТ (х, у, г).
4. Выполнить "RGB к серому" плагин (в разделе Свойства изображения), с равным взвешиванием для каждого канала, чтобы создать четвертый канал. Удалить оригинальный красный-зеленый-синий каналы.
5. Обратить серый канал с помощью изменения контрастности. Хранить изображение.
6. Нажмите кнопку "добавьтеРЭБ поверхность "Кнопка на вкладке 3D-View, и начать руководствоваться 4 шага процесса создания поверхности.
   1. Установите детали на уровне поверхности (шаг 1 из 4).
      Примечание: В нашем опыте 8.0 до 12.0 был наиболее эффективный диапазон.
   2. Установите максимальный размер сферы (под выбора фона) чуть-чуть меньше, чем максимальный размер отряда, измеренной в 7.1.2. Создайте поверхность и отвернуть серого канала инверсии (шаг 2 из 4).
   3. Установите порог до максимального значения, так что поверхность отрицательного пространства за пределами сетчатки и отслойки не вступают в контакт (шаг 3 из 4).
   4. Установите тип фильтра к числу вокселов и изолировать отрицательное пространство в отряде месте по размеру. Закончите поверхность (шаг 4 из 4).
      Примечание: Объем отряда поверхности находится под объем на вкладке статистики.

Results

Подход склеру кзади субретинальной инъекции проводили на 31 здоровых глаз от 16 мышей дикого типа с инъекциями 0,3 мкл (n = 18), 0,5 мкл (n = 8) и 1,0 мкл (n = 5) 0,01% флуоресцеина. Один глаз был исключен из инъекции из-за уже существующей помутнение роговицы, которая препятствовала структурно-функционального анализа. Каждый впрыскивается глаз включены в этот отчет. Нет непреднамеренные отслойки сетчатки, проколы нейросенсорной сетчатки, или утечки в стекловидное тело не было обнаружено...

Discussion

Субретинальной инъекции являются методом выбора для доставки вирусных векторов и стволовых клеток, полученных терапии для манипулирования фоторецепторов и ПЭС в обоих фундаментальных исследований и клинического лечения. У пациентов, субретинальной инъекции, как правило, осуществляется с передней склеротомия на Парс Plana, а задняя ядро ​​витрэктомии и проникновение сетчатки иглой с прямой визуализации. Как и в большинстве процедур витрэктомии, он является общим для образование катаракты, происходит преждевременно, если ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Шприц x 1
Игла Hamilton 33 G, 1.0", 20 DEG, острие 3 (нержавеющая сталь 304)	Hamilton	7803-05	Иглы x 6
изогнутых ножниц Vannas	Ted Pella, INC.	1347	Лезвие 5 мм
22,5 градуса Нож для микрохирургии	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Кетаект	Phoenix	NDC 57319-609-02	Кетамин
анас	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Ксилазин
флуоресцеин 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 мг/мл
0,9% физиологический раствор USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Антибиотическая мазь	Akorn	NDC 17478-235-35	Офтальмологическая
вода Циркуляционный насос	Gaymar	TP-500 T/Pump	Артикул 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Коммерческая
фундус Камера	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Пинцет тип 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5% фенилэфрин	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Офтальмологический
IMARIS8	Bitplane		Версия 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  2,5%	Goniovisc	AX0401	Метилцеллюлоза
Глазные капли (ополаскиватель)	Bausch & Солевой раствор Ломба
Микроскоп	Zeiss	Stemi 2000	Микроскоп
Источник света	Fostec	P/N 20520	Источник света