Инъекционный метод Альтернативный и Validated для доступа субретинальной пространства с помощью Подход склеру Задней

Summary

Субретинальные инъекции являются наиболее распространенным методом доставки крупных терапевтических агентов, таких как белки и вирусные векторы, к фоторецепторам и пигментному эпителию сетчатки. Здесь описан альтернативный метод на мышах, который успешно воздействует на субретинальное пространство с минимальным сопутствующим ущербом и быстрым временем восстановления.

Abstract

Субретинальной инъекции были успешно использованы в обоих людей и грызунов для доставки терапевтических вмешательств белков, вирусные агенты и клетки к interphotoreceptor / субретинальном отсек, который имеет прямой контакт с фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (RPE). Субретинальной инъекции плазминогена, а также недавние доклинические и клинические испытания продемонстрировали безопасность и / или эффективность доставки вирусных векторов и стволовых клеток для лиц с прогрессирующим заболеванием сетчатки глаза. Мышиные модели заболевания сетчатки, особенно наследственной дистрофии сетчатки глаза, имеют важное значение для тестирования этих методов лечения. Наиболее распространенной процедурой инъекции у грызунов является использование небольшой транскорнеальной или склеру надрезы с передним подходом к сетчатке. При таком подходе, инъекционная игла проникает в нейросенсорной сетчатки, срывающее лежащую в основе ПЭС и при вставке может легко ник объектив, в результате чего объектив помутнение и ухудшение неинвазивной томографовнг. Доступ к субретинальной пространство через склеру, задний подход позволяет избежать этих проблем: игла пересекает склеры примерно 0,5 мм от зрительного нерва, без проникновения сетчатки и позволяет избежать разрушения стекловидного. Сопутствующий ущерб ограничен, что связано с фокальной склеротомия и последствия переходного процесса, серозной отслойки сетчатки. Простота метода минимизирует глазное травмы, обеспечивает быстрое воссоединении и восстановление сетчатки глаза, и имеет низкий процент отказов. Минимальное повреждение сетчатки и ПЭС позволяет четкой оценки эффективности и непосредственного воздействия самих терапевтических агентов. Эта рукопись описывает новый субретинальной технику инъекции, которая может быть использована для целевых вирусных векторов, фармакологические препараты, стволовые клетки или индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клетки в субретинальной пространство у мышей с высокой эффективностью, минимальным повреждением, и быстрое восстановление.

Introduction

Субретинальной инъекции являются основным средством доставки клеточных и вирусных агентов в сетчатке мышей , чтобы изучить их влияние на фоторецепторы и лежащей в основе ПЭС ^1,2. Большинство субретинальном протоколов инъекций у мышей используют транскорнеальной или склеру месте инъекции кпереди от экватора (рис 1). Такой подход может привести к присущего сопутствующий ущерб , который включает зазубрин и результирующая помутнение хрусталика, нарушение целостности стекловидное, проникновение нейросенсорной сетчатки и радужной оболочки глаза, кровоизлияние в сетчатку глаза, значительные отслоения сетчатки и прочного субретинальном отека ^....

Protocol

Животные: дикого типа C57BL / 6J мышей разводят в Университете Калифорнии в Лос-Анджелесе (UCLA). Все животные были в возрасте от 11 - 17 недель, а также включены мужские и женские мышей. Все мыши были размещены-группы, поддерживали в 12:12 цикле свет / темнота с пищей и водой вволю. Все эксперименты проводились в соответствии с ведомственным руководящим принципам Калифорнийского университета и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии Заявление по использованию животных в офтальмологических и Vision Research.

Примечание: Все препараты и инъекционные агенты Фармакопеи США (USP) класса.

1. Хирургическая подготовка

1. Обе....

Results

Подход склеру кзади субретинальной инъекции проводили на 31 здоровых глаз от 16 мышей дикого типа с инъекциями 0,3 мкл (n = 18), 0,5 мкл (n = 8) и 1,0 мкл (n = 5) 0,01% флуоресцеина. Один глаз был исключен из инъекции из-за уже существующей помутнение роговицы, которая препятствовала структурно-функционального анализа. Каждый впрыскивается глаз включены в этот отчет. Нет непреднамеренные отслойки сетчатки, проколы нейросенсорной сетчатки, или утечки в стекловидное тело не было обнаружено.......

Discussion

Субретинальной инъекции являются методом выбора для доставки вирусных векторов и стволовых клеток, полученных терапии для манипулирования фоторецепторов и ПЭС в обоих фундаментальных исследований и клинического лечения. У пациентов, субретинальной инъекции, как правило, осуществляется с передней склеротомия на Парс Plana, а задняя ядро ​​витрэктомии и проникновение сетчатки иглой с прямой визуализации. Как и в большинстве процедур витрэктомии, он является общим для образование катаракты, происходит преждевременно, если .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Шприц x 1
Игла Hamilton 33 G, 1.0", 20 DEG, острие 3 (нержавеющая сталь 304)	Hamilton	7803-05	Иглы x 6
изогнутых ножниц Vannas	Ted Pella, INC.	1347	Лезвие 5 мм
22,5 градуса Нож для микрохирургии	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Кетаект	Phoenix	NDC 57319-609-02	Кетамин
анас	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Ксилазин
флуоресцеин 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 мг/мл
0,9% физиологический раствор USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Антибиотическая мазь	Akorn	NDC 17478-235-35	Офтальмологическая
вода Циркуляционный насос	Gaymar	TP-500 T/Pump	Артикул 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Коммерческая
фундус Камера	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Пинцет тип 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5% фенилэфрин	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Офтальмологический
IMARIS8	Bitplane		Версия 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  2,5%	Goniovisc	AX0401	Метилцеллюлоза
Глазные капли (ополаскиватель)	Bausch & Солевой раствор Ломба
Микроскоп	Zeiss	Stemi 2000	Микроскоп
Источник света	Fostec	P/N 20520	Источник света