Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Платформа анти-биопленки Assays Подходят к исследованию природных библиотек Compound

17.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54829

⸱

27 декабря 2016 г.

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

В этой статье

Краткое содержание

Биопленочные инфекции демонстрируют высокую толерантность к химиотерапии. Ни один анализ не отражает всю сложность биопленок. Вместо этого необходимы дополнительные анализы. Мы представляем скрининговую платформу (разработанную для S. aureus), которая сочетает в себе анализы жизнеспособности, биомассы и биопленочной матрицы. Это позволяет открывать антибиопленочные препараты, включая оценку долгосрочных химиотерапевтических эффектов.

Аннотация

Биоплёнки считаются одним из самых сложных тем современной биомедицины, и они потенциально ответственны за более чем 80% к антибиотикам терпимы инфекций. Биоплёнки проявили исключительно высокую толерантность к химиотерапии, который, как считается многофакторным. Например, матрица обеспечивает физический барьер, который уменьшает проникновение антибиотиков в биопленку. Кроме того, клетки внутри биопленки фенотипически разнообразны. Вероятно, биопленки устойчивость возникает из сочетания этих и других, еще неизвестных, механизмов. Все из ныне существующих антибиотиков были разработаны против одноядерные клетки (планктонных) бактерий. Таким образом, до сих пор, очень ограниченный репертуар молекул существует, которые могут избирательно воздействовать на зрелых биопленок. Эта ситуация привела прогрессивный сдвиг парадигмы в обнаружении наркотиков, в котором поиск по анти-биопленки было призвано занять более видное место. Дополнительной проблемой является то, что естьочень ограниченное число стандартизованных методов исследования биопленок, особенно те, которые могут быть использованы для большого скрининга химических библиотек. Здесь, экспериментальный анти-биопленки платформа для химического скрининга представлена. Он использует три пробы для определения жизнеспособности биопленки (с резазурин окрашивания), общая биомасса (с кристаллическим фиолетовым окрашиванием) и биопленки матрицу ( с использованием зародышей пшеницы агглютинин, WGA-флуоресценция на основе окрашивание поли N -он-глюкозамина, PNAG , доля). Все анализы были разработаны с использованием золотистого стафилококка в качестве модельных бактерий. Примеры того, как платформа может быть использована для первичного скрининга, а также для функциональной характеристике выявленных анти-биопленки попаданий представлены. Эта экспериментальная последовательность дополнительно позволяет классификации обращений на основе измеренных конечных точек. Она также предоставляет информацию об их способе действия, особенно на долгосрочной перспективе по сравнению с краткосрочным химиотерапевтических эффектов. Таким образом, это очень Advantageous для быстрой идентификации высококачественных хитовых соединений, которые могут служить в качестве отправной точки для различных биомедицинских применений.

Введение

Бактерии могут переключаться между двумя очень разными образа жизни, планктонных и сидячие, из которых биопленки является наиболее распространенным примером. В биопленок, бактерии образуют структурированные сообщества , внедренные в собственного производства матрицы 1. Это собственного производства матрица представляет собой барьер между бактериями и их внешней среды, и он защищает микробные клетки, держа их в непосредственной близости. Состав матрицы биопленки изменяется между и даже в пределах вида, но он в основном состоит из тугой сети липополисахаридов, внеклеточную ДНК и белков. Матрица служит в качестве физического барьера , ингибирующего вход вредных агентов, но оно также защищает биопленки от обезвоживания и предотвращает питательные вещества от выхода из клетки 2.

Биоплёнки считаются одним из самых сложных тем современной биомедицины, и они якобы ответственны за более чем 80% к антибиотикам терпимы инфекций 3. Они Индик.точкилежал по своей природе высокую устойчивость от внешних угроз: влажности, осмотическое давление, механическое напряжение 4, тепла, УФ - излучения 5, дезинфицирующие средства, антимикробные агенты, и иммунная система 1 хозяин. Например, требуемая концентрация противомикробного агента требуется, чтобы убить биопленку было показано, что в 1000 раз выше по сравнению с, что требуется, чтобы убить бактерии планктонные. Объяснение этому более высокой толерантности, кажется, многофакторный. Матрица представляет собой физический барьер, который уменьшает проникновение антибиотиков в биопленку. Кроме того, клетки внутри биопленки фенотипически разнообразны; они переходят между различными метаболическими состояниями из - за существующего градиента кислорода, питательных веществ и метаболитов между внутренней и наружной частями биопленки 6. Следовательно, в некоторых биопленки регионах, таких как ядро, бактерии лишены кислорода и питательных веществ, и живут в метаболически менее активными или полностью неактивном состоянии 7. Полностью покоящихся упоминаются как стойкая бактерия клеток, и они не восприимчивы к традиционным антимикробным лечения 8. Таким образом, вполне вероятно, что биопленка устойчивость возникает из комбинации в настоящее время предложены и другие, еще не известные механизмы. Staphylococcus SPP. прежнему относятся к числу наиболее проблемных грамположительных бактерий, вызывая серьезные, часто биопленки , связанные с инфекциями, 4. Предполагается , что до 99% всех бактерий связаны внутри биопленок, что делает его преобладающим бактериальный образ жизни 3. Тем не менее, все из ныне существующих антибиотиков были разработаны против одноклеточных (планктонных) бактерий. До сих пор очень ограниченный репертуар молекул существует, которые могут избирательно воздействовать на зрелых биопленок. Эта ситуация привела прогрессивный сдвиг парадигмы в обнаружении наркотиков, в котором поиск по анти-биопленки было призвано занять более видное место.

Из methodologскую перспективу, существуют дополнительные проблемы, так как только ограниченное число методов биопленки были разработаны организациями по установлению стандартов, особенно те, которые применяются к высокопроизводительного скрининга химических библиотек. Все стандартные анализы (с одним лишь исключением) основаны на биопленки реакторов, и эти методы требуют больших рабочих объемов и большое количество соединений, подлежащих испытанию, которые, как правило недоступны на ранней стадии исследуемым 9-12. Единственный существующий стандартизированный скрининг-тест применяется является так называемый Калгари биопленки устройств, из которых коммерчески доступные системы минимальной биопленки устранения концентрации (MBEC) была разработана 13-15. Однако ограничение этого анализа является то, что биопленки выращивают на колышками, а не все виды бактерий или даже штаммы в пределах одного вида, способны образовывать биопленки на этом устройстве. Кроме того, методы, которые могут быть особенно применительно к исследованию природных соединенийнеобходимо. Натуральные продукты были основным источником инноваций в области антимикробной обнаружения наркотиков в течение прошлого столетия 16. Они могут предложить новые анти-биопленки соединений с уникальными механизмами действия, которые также могут быть эффективными против стойкая бактерия клеток. Таким образом, исследование природных и, естественно, вдохновленных библиотек имеет высокие шансы на производство перспективных и уникальных анти-биопленки ведет.

Здесь мы представляем экспериментальные детали платформы анализов , который был разработан для химического скрининга анти-биопленки соединений с использованием трех анализов для измерения влияния на жизнеспособность, общей биомассы, а также матрицы золотистого стафилококка биопленок. Первый тест измеряет жизнеспособность биопленки, и она основана на резазурин окрашивания. Ресазурина является окислительно-восстановительный краситель, который является синим и нефлуоресцирующего в окисленном состоянии и превращается в розовый, сильно флуоресцирующего ресоруфина когда уменьшается на метаболическую активность бактерий. Это очень простой и быстрый меню подходит для первичного скрининга 17-20. Второй анализ, основанный на кристаллическим фиолетовым окрашиванием, измеряет суммарную массу биопленки. Кристаллвиолетом является широко используемым пятном для изучения бактерий и бактерий в биопленки 19,21-23. Анализ основан на недорогих реагентов и имеет простую измеряющий оптическую плотность конечной точки. И, наконец, третий анализ нацелен на внеклеточный полимерное вещество (EPS) -матрица биопленки через агглютинина зародышей пшеницы (WGA), который специфически связывается с поли N - Ацетил-глюкозамин остатков (PNAG) , присутствующие в матрице стафилококковых биопленок 24. WGA конъюгирован с флуорофором , которые могут быть обнаружены с помощью читателей интенсивности флуоресценции 25. Мы приведем здесь обоснование и детали платформы мы разработали, включая примеры приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Рост бактерий

  1. Предварительная культура бактерий в течение ночи в трипсинизированном соевый бульон (ТСБ) при 37 ° С с 220 оборотов в минуту встряхивании (16-18 ч).
  2. Развести предварительной культуры 100-1000 раз ( в зависимости от скорости роста бактерий, здесь, в 1000 раз используется для золотистого стафилококка) в свежем TSB и пусть растут при температуре 37 ° C и 200 оборотов в минуту , чтобы достичь экспоненциального роста (оптическая плотность при длине волны 595 нм (OD 595) от 0,2 до 0,6).
    Примечание: Этот шаг требует штаммоспецифической оптимизации.

2. биопленки: до и после воздействия

  1. Развести экспоненциально выросшую культуру 100 раз (это соответствует примерно 10 6 колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ / мл)).
  2. Протокол предэкспозиционной
    1. Для необработанных контрольных проб, добавляют 200 мкл разведенного бактериальной культуры на лунку стерильной 96-планшете.
    2. Добавить 4 мкл тестируемого соединения или контроляантибиотик (50x маточного раствора) и 196 мкл разведенной бактериальной культуры в каждую лунку.
    3. Инкубируйте при 37 ° С на шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 18 часов.
      Примечание: При этом мы используем шейкер с 2 мм орбите.
  3. Протокол Постэкспозиционное
    1. Для всех образцов, добавьте 200 мкл разведенных бактериальной культуры на лунку стерильной 96-планшете.
    2. Инкубируйте при 37 ° С на шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 18 часов.
      Примечание: При этом мы используем шейкер с 2 мм орбите.
    3. Удалить весь раствор планктонные осторожно, не касаясь биопленки, используя многоканальную пипетку.
    4. Добавляют 4 мкл тестируемого соединения или контрольного антибиотика (50х исходный раствор) и 196 мкл на лунку TSB.
    5. Инкубируйте при 37 ° С на шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту в течение еще 24 ч.
      Примечание: При этом мы используем шейкер с 2 мм орбите.

3. ресазурин Окрашивание Protocoл для Жизнеспособность оценки биопленки

  1. Подготовка исходного раствора 0,1 мг / мл ресазурина (0,4 мМ) в стерильном PBS. Держите этот запас стерильной, защищенном от воздействия света, и при 4 ° С.
  2. Развести резазурин запас 1:50 в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS), чтобы достичь конечной концентрации 20 мкМ.
  3. Перенесите весь планктонные раствор (оставляя биопленки в лунках), осторожно, не касаясь биопленки или создания пузырьков воздуха, в отдельный, чистый 96-луночного планшета с использованием многоканальной пипетки.
  4. Промыть биопленки один раз стерильной PBS добавлением 200 мкл на лунку, и аккуратно удалите его с помощью многоканальной пипетки.
  5. Добавьте 200 мкл разведенных резазурин на лунку планшета с использованием биопленки многоканальную пипетку.
  6. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре (RT) и 200 оборотов в минуту, встряхивая в течение приблизительно 20 мин до тех пор, необработанных контрольных биопленка не будут равномерно розового цвета.
  7. Измеряют флуоресценциюλ возб = 560 нм и λ = 590 EM нм с помощью ридера (сверху чтение).

4. Кристалл Фиолетовый Окрашивание Протокол Биомасса Количественное биопленок Используя ту же пластинку, как и в шаге 3

  1. Удалите резазурин пятно тщательно из лунок с помощью многоканальной пипетки.
  2. Закрепить биопленок с 200 мкл метанола в течение 15 мин.
  3. Пусть воздух сухой пластины в течение 10 мин.
  4. Добавить 190 мкл 0,02% (об / об, разбавленного в деионизированной воде) раствора кристаллического фиолетового, осторожно с помощью многоканальной пипетки. Не прикасайтесь к сторонам лунок с пятном в то время как пипеткой и предотвратить образование пузырьков воздуха, не нажимая пипетку, чтобы завершить выдув.
  5. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Удалить пятно осторожно, используя многоканальную пипетку.
  7. Промыть его дважды деионизованной водой (200 мкл каждый раз).
  8. Пусть лунки высохнуть в течение 5 мин при комнатной температуре и растворять остальные пятнав 96% -ном этаноле или 33% -ной уксусной кислоты.
  9. Инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре и читать оптическую плотность при длине волны 595 нм.

5. Оценка бактерицидного эффекта на планктонных бактерий Используя тот же образец пластины, как для биопленок

  1. Измерьте мутность при длине волны 595 нм пластины с планктонных раствора от 3,3.
  2. Пятно планктонных бактерий с резазурин путем добавления 10 мкл резазурин запаса на лунку. Хорошо перемешать с помощью пипетки.
  3. Выдержите его в темноте при комнатной температуре в течение примерно 5 минут, пока необработанные контрольные не равномерно розового цвета.
  4. Измерьте флуоресценции при длине волны отл = 560 нм и λ = 590 EM нм.

6. Зародыши пшеницы Agglutinin Окрашивание для матричных Количественное и флуоресцентной микроскопии изображений биопленок

  1. Матрица количественное
    1. Приготовьте 5 мкг раствора / мл зонда WGA в стерильном PBS.
    2. Используйте параллельный образец плат.е для этого окрашивания. Удалить планктонных раствор из лунок и промыть один раз стерильной PBS (200 мкл на лунку), осторожно с помощью многоканальной пипетки, не касаясь биопленки.
    3. Добавить 200 мкл раствора WGA на лунку, чтобы быть окрашены.
    4. Инкубируйте в темноте при температуре 4 ° С в течение 2 часов.
    5. Удаления несвязанного красителя промывки лунок с 200 мкл PBS, в три раза.
    6. Пусть пластины высыхать в течение 15 мин при комнатной температуре.
    7. Растворить связанный пятно в 33% -ной уксусной кислоты, с использованием 200 мкл на лунку.
    8. Уплотнение колодцы с крышками стрип и разрушать ультразвуком их с помощью водяной бани в течение 30 ультразвукового сек при комнатной температуре и 40 кГц.
    9. Инкубируйте планшет в течение 1 ч при комнатной температуре.
    10. Повторите шаг обработки ультразвуком. Скважины могут оставаться запечатанными между стадиями обработки ультразвуком.
    11. Измерьте флуоресценции при длине волны ех = 495 нм и λ = 520 EM нм с помощью ридера (сверху чтение).
  2. Визуализируя матрица сфлуоресцентной микроскопии
    1. Используйте тот же протокол, что и выше до стадии 6.1.6.
    2. После того, как на стадии сушки, визуализировать образцы с помощью флуоресцентного микроскопа, используя FITC фильтр (или другой подходящий зеленый фильтр возбуждения).

7. Окрашивание жизнеспособные и мертвые клетки внутри биопленки для визуализации с флуоресцентной микроскопией и количественному сигнала для Green-к-красно-отношение (G / R)

  1. Формирование изображений с помощью флуоресцентной микроскопии
    1. Приготовьте раствор каждого зонда (один окрашивания жизнеспособных клеток, а другой окрашивания мертвых клеток), в соответствии с рекомендациями производителя.
    2. Удалить планктонных раствор из лунок и промыть один раз стерильной PBS (200 мкл на лунку) с помощью многоканальной пипетки.
    3. Добавить 6 мкл окрашивающего раствора на лунку.
    4. Инкубируйте планшет в темноте в течение 15 мин.
    5. Перед микроскопией, удалить избыток жидкости мanually с помощью многоканальной пипетки.
    6. Захват изображений с помощью флуоресцентного микроскопа, используя, например, с FITC фильтра (для зеленой флуоресценции, жизнеспособных клеток) или TRITC фильтр (красная флуоресценция, мертвые клетки).
  2. Количественное сигнала в виде зеленого к красно-флуоресцентного отношения (G / R)
    1. Следуйте за один и тот же протокол, как на этапах 7.1.1 и 7.1.2.
    2. Добавьте 200 мкл окрашивающего раствора на лунку и инкубировать их в течение 15 мин в темноте.
    3. Измерьте флуоресценцию с ридере при длинах волн возбуждения / эмиссии 485/535 нм и 485/635 для зеленого и красной флуоресценции, соответственно (верхняя чтение).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В предлагаемой платформы, воздействие на жизнеспособность, биомассы и биопленки матрицы количественно. В рабочей последовательности (рисунок 1), один образец пластины окрашивали резазурин , а затем с кристаллическим фиолетовым , чтобы одновременно оценить воздействие на жизнеспособность бактерий биопленки и на общей биомассы биопленки. Оба анализа могут быть выполнены последовательно в той же пластине , так как было показано ранее , что первое окрашивание с резазурин не ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Там нет ни одного метода, который может одновременно измерить эффект соединения на жизнеспособность, биомассы и биопленки матрицы. Таким образом, существует необходимость для объединения анализов с целью выявления эффекта на трех конечных точек, предпочтительно на стадии первичного скрининга.

Ресазурина является очень простой протокол окрашивания, состоящий только из добавления окислительно-восстановительного зонда. Тем не менее, установление оптимального времени инкубации биопленок с резазу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы благодарят профессора Пола Cos и LMPH, Университет Антверпена, Бельгия за его поддержку во время съемочного процесса в своей лаборатории. Эта работа была профинансирована Академии проектов Финляндии (проекты 272266 и 282981) и Svenska Tekniska Vetenskapsakademien я Финляндия. Технические вклады MSc Джанни Kujala признаны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
РезазуринСигма ОлдричR7017
Кристалл фиолетовыйСигма ОлдричHT90132 
Агглютинин зародышей пшеницы, Alexa Fluor 488 ConjugateThermo Fisher ScientificW11261
ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ BacLight Молекулярные зондыL7012SYTO 9 для окрашивания жизнеспособных клеток зеленым и йодидом пропидия для окрашивания мертвых клеток красный
Фосфат Буферизированный физиологический триптон
соевый агарLab M, NeogenLAB011
Триптин соевый бульонLab M, NeogenLAB004
F96 Луночная пластина Полистирол стерильный прозрачный плоский дноThermo Fisher Scientific161093
БРЕНД колпачки, полоски 8Sigma AldrichBR781413-300EA
Branson CPX серия ультразвуковая ваннаSigma AldrichZ769428-1EA
MultipipetteThermo Fisher Scientific
Multidrop диспенсерThermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Coulter
Многопланшетный считыватель Varioskan FlashThermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC No 25923

Ссылки

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
  3. Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
  4. Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
  5. Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
  6. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
  7. Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
  8. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
  9. Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
  10. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
  11. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
  12. Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
  13. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  14. Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
  15. Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663(2016).
  16. Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
  17. Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
  18. Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
  19. Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
  20. Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
  21. Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
  22. Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
  23. Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
  24. Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
  25. Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
  26. Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
  27. Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
  28. Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
  29. Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
  30. Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
  31. Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
  32. Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
  33. Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
  34. Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
  35. Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
  36. Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
  37. Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Жизнеспособность биопленококрашивание кристаллическим фиолетовымокрашивание резазуриномфлуоресцентное окрашивание WGAStaphylococcus aureusскрининг природных соединенийанализ матрикса биопленокскрининг химических библиотекфлуоресцентная микроскопия
Платформа анти-биопленки Assays Подходят к исследованию природных библиотек Compound
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.