Высокопроизводительный роботизированная Изоляция термочувствительных Смертельное Мутанты в Chlamydomonas reinhardtii

Summary

Чувствительные к температуре (ts) летальные мутанты являются ценными инструментами для идентификации и анализа основных функций. Здесь мы описываем методы генерации и классификации летальных мутантов с высокой пропускной способностью.

Abstract

Систематическая идентификация и характеристика генетических возмущений оказались полезными для расшифровки функций генов и клеточных путей. Тем не менее, традиционные подходы к постоянной делеции генов не могут быть применены к основным генам. Мы первыми создали уникальную коллекцию из ~70 чувствительных к температуре (ts) летальных мутантов для изучения регуляции клеточного цикла в одноклеточных зеленых водорослях Chlamydomonas reinhardtii¹. Эти мутации идентифицируют основные гены, а аллели ts могут быть условно инактивированы при изменении температуры, предоставляя ценные инструменты для идентификации и анализа основных функций. Коллекции мутантов гораздо ценнее, если они близки к исчерпывающим, так как разрозненные коллекции могут упустить важные компоненты. Однако для этого требуется эффективный сбор большого количества мутантов, особенно в широкоцелевом экране. В этой статье мы опишем основанный на робототехнике конвейер для создания летальных мутантов и анализа их фенотипа у Chlamydomonas. Эту методику можно применять к любому микроорганизму, который растет на агаре. Мы собрали более 3000 тс-мутантов, вероятно, включая мутации в большинстве или во всех важных для клетки путях, включая около 200 новых мутаций клеточного цикла-кандидата. Последующая молекулярная и клеточная характеристика этих мутантов должна дать новое понимание биологии растительных клеток; Всеобъемлющая коллекция мутантов является важным необходимым условием для обеспечения охвата широкого спектра биологических путей. Эти методы интегрированы с последующими генетическими и биоинформационными процедурами для эффективного картирования и идентификации причинных мутаций, которые выходят за рамки данной рукописи.

Introduction

Фенотипическая характеристика систематических коллекций мутантных модельных организмов является проверенным подход к рассечения сотовой сложности. Гаплоидный одноклеточные зеленые водоросли Chlamydomonas reinhardtii имеет набор генов растений, как, но он отклонился от наземных растений перед несколькими дупликации генома в земли растений линии ^2. В принципе, отсутствие дублирования генов и в основном гаплоидных жизненного цикла значительно облегчает пропадание функции генетических подходов. Тем не менее, Целенаправленное разрушение интерес генов практически невозможно из-за отсутствия эффективной гомологичной геномной интеграции. Случайное инсерционный библиотека нарушения находится в стадии разработки, в сочетании с идентификацией нарушенного участка, до сих пор приносит упорядоченную совокупность 1,935 отображенных сбоев , представляющих 1562 генов ^3. Тем не менее, этот подход (ожидается в целом производить нуль-мутации) не применяется к основным генов. Чувствительных к температуре (TS) мутации могут быть recovered в важных генов, а также современные методы позволяют эффективно идентифицировать мутантного гена и причинного поражения. Фенотипические анализ при высокой температуре, затем обеспечивает немедленную информацию о функции мутантного гена. Мы сообщили о выделении и характеристике Т.С. летальных мутаций в ~ 70 важных генов в хламидомонады, обращая особое внимание на генах , участвующих в прогрессии клеточного цикла и контроля ^1,4.

Ц. летальные экраны были основой генетического анализа микроорганизмов в течение десятилетий ^5,6. В принципе, желательно особенностью является подход "насыщение", что означает, что все гены, способные мутировать к т.с. летальность идентифицируются по меньшей мере, одного мутанта, что позволяет провести полный анализ. Тем не менее, на практике, некоторые факторы ограничивают подход к насыщению. Во-первых, в то время как почти все гены могут мутировать к потере активности при высокой температуре, эффективность извлечения таких мутантов изменяется по крайней мере,порядок ^7,8. Таким образом, случайный экран начинает подбирать хиты рецидивирующие в "часто летающих пассажиров" задолго до того, на насыщение. Во-вторых, в то время как Т.С. мутации обычно приводят к снижению функции, они не могут быть истинными обнуляет при ограничительной температуре (и наоборот, часто не полностью функциональны при разрешающей температуре). Эта проблема может быть решена в некоторой степени путем сравнения нескольких аллели; если все они имеют общий фенотип, это, скорее всего, отражают результат простого инактивации гена. Множественные аллели также очень полезны для окончательной молекулярной идентификации возбудителя поражения ^1. Тем не менее, проблема "часто летающих пассажиров" означает, что несколько аллелей генов редко пострадавших может быть трудно восстановить.

По этим причинам, мы разрабатываем усовершенствованный трубопровод для изоляции и фенотипически характеризуют Т.С. мутантов. Мы собрали более 3000 тс мутанты до сих пор, язажимные около 200 новых мутаций кандидат клеточного цикла. Молекулярный и фенотипический анализ этой коллекции, которая уже, вероятно, включает в себя мутации в большинстве или во всех клеточных путей, существенным должны обеспечить новые идеи и гипотезы в растительной клеточной биологии. Важно отметить, что этот трубопровод может быть применен к любому микроорганизму, который растет на агаре, чтобы эффективно построить Т.С. мутантных коллекций.

Замечание об оборудовании: два робота очень важны для эффективности этой процедуры (трепальную колонии и сочетание реплики Plater / вишневого сборщика). Сборщики обычно имеют металлические штифты. Поднято колонии проводятся в воздухе на этих выводах в течение некоторого периода времени (от секунд до минут, в зависимости от модели). СЫатуйотопаз умирает примерно 20 секунд на металлический штырь в воздухе. Это ограничивает выбор модели для организма. вопросы точности. Наша подборщика колония достаточно точна; Тем не менее, она несколько жестоким в своем действии и имеет некоторую возможность для распыления на основе перекрестного загрязнения. Он не используется при высокойэ-э, чем 384 плотности (4,5 мм Расстояние между центр-центр); при этой плотности, точность вполне приемлемо. Собирание робот реплики металлизированный / вишня (различные принадлежности, используемые для этих приложений) намного медленнее при собирании, но достаточно точна для 1536 плотности (6144 является непростой задачей, даже для этого очень точного робота, мы оценивали эту плотность, но не избран использовать его из-за его различных трудностей). Робот не будет хорошо работать , если плиты будут загружены неравномерно, и т.д.. Важно выборочную проверку, чтобы убедиться, что правильные вещи происходят; Конечно, робот будет работать без присмотра и вообще, все будет хорошо, если первые несколько пластин были правильными.

Protocol

1. УФ-мутагенеза

1. Подготовьте партию из 100 - 200 прямоугольных пластин агара с Трис-ацетатфосфатного (TAP) средних ^9,10. Подготовьте эти пластины на несколько дней вперед и держать их на скамейку, чтобы высохнуть, чтобы обеспечить быстрое поглощение взвешенных клеток в следующих шагах.
2. Культура СЫатуйотопаз клетки до 0,2 - 0,5 оптической плотности (OD _750; ~ 2 дней) в 100 мл жидкого TAP под действием света, при температуре 25 ° С и встряхивании при 100 оборотах в минуту.
   Примечание: УФ - мутагенеза осуществляется независимо друг от друга в двух генетических фонов: Матвеевич Hygro ^г (придает устойчивость к гигромицину B) и Мат + Паро ^г (придает устойчивость к Паромомицин). Антибиотик выбор произвольно, при условии, что два типа спаривания имеют дополнительные сопротивления наркотиков.
3. Проверьте образец каждой из культур под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки являются жизнеспособными, здоровыми (плавание и нетронутыми), так и без загрязнения.
   Примечание: Переросшие культуры "аварии" итеряют жизнеспособность, появляются как "призраки" в фазово-контрастной микроскопии. Не держать шейкер культур происходит, как только они достигают насыщения. "Призрак" явление можно было легко обнаружить на этапе 1.3.
4. Разбавляют культуры до 0,003 OD _750. Заверните бутылку с алюминиевой фольгой, чтобы обеспечить однородную плотность, так как штамм подвижна и проплывает направленно в ответ на свет.
   1. Регулировка плотности суспензии на основе планируемой дозы ультрафиолета, так что учет гибели клеток, 200 - 600 выживший колонии образуют на пластинах (рисунок 1). Таблицу 1 для получения информации о времени УФ - облучения.
5. Прикрепите кассету малой трубы, которая подходит жидкий распылитель и выполнить серию промываний для стерилизации, в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы предотвратить загрязнение.
6. Использование 8 х 12 дозатора жидкости, отказаться от 4 х 96 капель 2 мкл каждого на прямоугольных пластин (рис 1 ). Нажмите слегка на краю пластины, чтобы обеспечить сращивание всех капель в тонкий лист жидкости и немедленно покрывал пластины для предотвращения воздействия света.
   1. Для того, чтобы обеспечить очень даже одного рассеивание клеток, используют сухие пластины, как упоминалось выше, и быстро покрывал пластины, чтобы предотвратить клетки от плавания в ответ на свет. Держите покрытые уровень тарелки и в темноте, пока вся жидкость не впитается.
7. Место пластин под бактерицидной УФ-лампой (30 Вт бактерицидная УФ трубка) в течение периода времени, определенного опытным путем, чтобы дать оптимальный выход ts- мутантов среди выживших. При этом использовать времена 0,5 - 1,5 мин на расстоянии 40 - 50 см, чтобы привести к 90 - 99,9% убийств. Выжившие содержат 100 - 1000 УФ-индуцированных точечных мутаций, из которых 10% ~ изменения последовательности, кодирующие.
   1. Для того , чтобы обеспечить максимальную эффективность УФ - облучения с не реверсии в связи с светозависимое ДНК ремонт ^11,12, работа в темноте на этом шаге и сразу упаковатьПланшеты в темном поле после облучения.
8. Держите пластины в темноте в течение 8 - 24 ч при комнатной температуре.
9. Поместите пластины в инкубаторе C 21 ° с подсветкой для образования колоний. Образование колоний занимает ~ 10 дней. Убедитесь в том, чтобы обернуть пластины с полиэтиленовыми пакетами и добавьте абсорбирующей бумаги внутрь, чтобы промокнуть до жидкого конденсата. Испарения и конденсации циклов в противном случае может обеспечить жидкие маршруты пленки для загрязняющих веществ для ввода пластин.
10. Загрузите листы в соответствующих стеки в качестве источников для роботизированного сбора колонии (рис 2). Выберите колонии для 384-массивов на прямоугольных пластин, и выращивать их при температуре 21 ° C с подсветкой (~ 1 неделя).
11. Конденсировать 384-массивы в 1536-массивов (4: 1) с использованием реплики-металлизированный робота (рисунок 3), и позволяют пластины расти в течение ~ 3 дней в 21 ° C инкубатора.
12. Реплицируйте 1536-массивы двух пластин каждый и поместите один в 21 ° C инкубаторе (разрешительныйтемпература), а другой в 33 ° С инкубатор (ограничительными температуры а). После 24 ч, повторить пластины в 33 ° С до нового набора предварительно нагретом пластин, и поместите их в 33 ° C инкубатора.
    Примечание: Причиной этого вторичного покрытия является то, что т.с. летальные мутанты в некоторых случаях могут аккумулировать значительную биомассу, даже если клетки арестованы в первом клеточном цикле после посева. Вторичная реплика устраняет этот сигнал и значительно увеличивает чувствительность.
13. Сфотографировать пластины с цифровой камерой следующим 3-х дней роста при 33 ° С и 5 дней роста при 21 ° С. Держа пластины в неподвижной системе координат. Используйте "сетку-пластину" с обозначением девяти показателей выравнивания , что фотографируется вместе с культурой пластин (рисунок 4). Фотограф культуральные планшеты в виде чередующихся в паре 21 ° C и 33 ° C (21/33) изображения.
    Примечание: Различные периоды инкубации используются для выравнивания роста, так как дикого типа значительно возрастаетбыстрее при 33 ° C, чем при 21 ° С.

2. Идентификация Т.С. мутантных кандидатов: Первый экран

1. Процесс спаренные 21/33 пластины изображения с помощью пользовательского Matlab программного обеспечения для анализа изображений для устранения фона и приводит к сегментации изображений в 1536-массива. Программа определит обнаруженную биомассы (суммарная интенсивность пикселей) в каждой позиции (рисунок 5).
   Примечание: Программное обеспечение (при условии, в SI вместе с инструкциями) будет использовать сетки пластины изображение, чтобы определить расположение ячеек (отдельных записей) в в 1536-массиве на выравнивание увеличения и пластины, используемой и вычислить суммарную интенсивность пикселей в каждой ячейке , Эти значения для каждого мутанта, затем сравниваются с регулируемыми параметрами для определения требуемого роста при 21 ° С по отношению к Ts + стандартных и степень температурной чувствительности, определяется следующим образом: S (Mut ₃₃₎ / S (WT ₃₃₎ / S (Мут ₂₁₎ / S (WT _21), где S является сигнал (пиксельсивность после вычитания фона), Мут является индивидуальным мутант, и "WT" является случайным образом выбирается без термочувствительных колонии (мутагенезу штамм, который имел Ts + фенотип). Рост при 21 ° С определяется как S (Mut ₂₁₎ / S (WT _21). В этом первом экране, применить расслабленные критерии отбора (с учетом относительно низких темпов роста при 21 ° С и относительно низкую степень чувствительности к температуре), чтобы сохранить ложный отрицательный результат низкого курса.
2. Загрузите список отобранных колоний, полученных с помощью программного обеспечения в качестве файла инструкции для одиночной колонии собирание робототехники (как правило, в 384-массив). Подготовьте пластины источника и цели в соответствии с инструкциями робототехники и выбрать колонии массива (рисунок 6).
   Примечание: Обычные сборщики требуют файл инструкции в каком-то формате, например, .csv, .txt или .xls. Все сборщики будут иметь возможность быть файл приводом; различных форматов потребуется незначительное редактирование кода MATLAB (исходный код прилагается).
3. Поместите мишень пластины в 21 ° C инкубаторе в течение ~ 5 дней, чтобы вырастить запаса пластины.

3. Определение тс Мутанты: Второй экран

1. Повторите шаг 2.1 для повторного тестирования отобранных колоний. Как правило, 30 - 50% колоний будет повторное тестирование, как ясно тс леталей, для выхода 2% - 5% Т.С. леталей относительно первоначальных колоний выживающих УФ-мутагенеза.
2. Повторите шаг 2,2 для выбора в два раза экранированными тс леталей, но с измененным файлом инструкции, предназначенная для колоний массива на блоки из 100 колоний на прямоугольных пластин при 384 плотности. Это для удобного микроскопического исследования на следующей стадии. Формат файла инструкции указывается во время выполнения кода MATLAB.
3. Убедитесь в том, чтобы включить несколько колоний WT в качестве контроля и поместите пластины при температуре 21 ° С в течение ~ 5 дней.

4. Определение Первоначальное Фенотип

1. Реплицируйте 100-блочные плиты выстроенных на шаге 3.2 и поместите их в 21 ° C INCUБатор для ~ 2 дней, чтобы получить свеже растущие колонии.
2. Репликация свежую копию 100-блок пластин (4.1) в трех экземплярах. Положите одну копию в 21 ° C инкубатора и один в 33 ° C инкубаторе в качестве контрольной группы.
3. Поместите третий экземпляр ( "экранирующих пластин") в роботизированной установки, а также обнаружить колонии с длинными штырьки прикоснулся стерилизованной водой.
   Примечание: СЫатуйотопаз клетки прижат к агара роботизированного, как правило, первоначально землю как довольно плотного пятна клеток, с небольшим количеством одиночных клеток, доступных для микроскопического обследования. Для оптимизации колонии для микроскопического осмотра, обнаружить первоначально переданные клетки с каплей воды (объем воды, переносимой роботизированных длинными штырями ~ 100 нл). Это приводит к дисперсии клеток в небольшом радиусе (~ 1 мм) о начальной пиннинга, с большим количеством изолированных одиночных клеток.
4. Возьмите микрофотографии области каждого пятна из экранирующих пластин во время 0 (пока еще холост, неразделенные клетки) (На рисунке 7) и поместите пластины при температуре 33 ° С в течение инкубации. Определить местоположение изображения с помощью ручного управления стадии модифицированного тетрадный рассечение микроскопа, установленного, чтобы дать остановки в 4,5-мм Расстояние между центра до центра массива 384 плотности.
5. Удалите скрининговые пластины от 33 ° C инкубаторе и принимать микрофотографии, как в шаге 4.4, при различных временных точках (10 ч, 20 ч, 48 ч). Убедитесь, что на сцену, держатель пластины и контроллер ступени точно откалиброван, чтобы получить изображения одних и тех же клеток в каждый момент времени. Выполните быстрое приобретение микрофотография (~ 10 мин).
6. Используйте вторую копию в 33 ° C инкубатор для проверки фенотипа TS и убедиться в том, что колебания температуры во время получения изображения не имеют значительного влияния на Ts фенотип.
   1. Анализ микроскопических изображений и отбора мутантов на основе желаемых критериев (рисунок 8). Пятно окончательный выбранный набор в 96-доченной агаром. Убедитесь, что каждыйПластина содержит мутанты одного и того же типа спаривания и лекарственной устойчивости.
   2. Для каждой пластины, включают последние две колонки, положительный (мутации) запроса и контроль отрицательный (WT) для анализа комплементационной.

5. Комплементация и рычажный механизм тестирования новых мутантов "Частые Флайерз"

1. Передача больших количеств выстроенных колоний к безазотистой гамет-индукционной среде ¹⁰ в 96-луночных микропланшетов (плотность каждой колонии должна быть около 0,2 OD). Инкубируйте пластин под действием света (13 - 20 Вт ртутной лампочки) в течение ~ 5 часов, чтобы позволить гаметогенез.
   Примечание: Этот шаг может быть проведена либо с реплицирующуюся роботизированной установки или вручную с помощью простого гальванического устройства.
2. Приостановка запросов с противоположных типов спаривания , несущих альтернативные кассеты сопротивления в пробирки с безазотистой гамет-индукционной среде ¹⁰ для гаметогенеза.
3. Смешайте образцы в целевой пластине в матовую MIXTОбъем Юр 20 мкл (рисунок 9). После ~ 10 мин под светом, SPOT 5 мкл из каждой лунки дважды: один раз на TAP пластине для тестирования сцепления и один раз на TAP + 5 мкМ Паро + 9 мкМ Hygro для тестирования комплементационной.
4. Выдержите рычажной пластины в 21 ° C инкубаторе в течение ночи, а затем завернуть их в фольгу. Храните их в темноте в течение 5 дней, чтобы позволить образование зигоспора.
5. Выдержите комплементационная-тестирования пластины для ~ 10 дней на свету при 21 ° C.
   Примечание: Суммы наркотиков откалиброваны, чтобы позволить выживание дважды гетерозиготных диплоидами, но они все еще достаточно, чтобы устранить сопрягаемые гаплоидов. Эти суммы были откалиброваны для стандартных кассет интеграций сопротивления, используемых в данном конкретном проекте; с новыми интеграций, дозы должны быть откалиброван. Большинство биомассы проверяется , чтобы быть Диплоиды методом проточной цитометрии (рисунок 9), хотя с переменным уровнем гаплоидов (вероятно , от мейоза и роста вдвойне устойчивысегреганты), как правило, наблюдается также.
6. Репликация комплементации-тестирования пластин в двух экземплярах для ts- идентификации фенотипа. Положите одну копию при температуре 21 ° C и одну копию при температуре 33 ° С в течение ~ 5 дней.
7. Контрольные колонии для ts- фенотип, как описано в разделе 2.1 (рисунок 5). Колонии, которые не дополняющие с запросом, вероятно, представляют собой аллели одного и того же гена, как запрос (диплоидами гетеро-аллельные мутации в том же гене).
8. Для тестирования сцепления, следующим шагом 5.4, смещение пластин к свету, чтобы позволить мейоза и разрастание гаплоидных сегрегантов за ~ 7 дней.
9. Повторные испытания сцепления пластины к TAP + 10 мкМ Паро и 10 мкМ Hygro, чтобы выбрать для двойных устойчивых потомств (согласно прогнозам, составит 25% от гаплоидного потомства, так как кассеты несвязанными) и инкубировать при температуре 21 ° С в течение недели.
   Примечание: Увеличение дозы препарата для вдвойне резистентных гаплоидов.
10. Контрольные колонии для ts- фенотипа, как яп шаг 2.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ts- фенотип ожидается (и наблюдается) для мутантов в той же группе комплементационной в качестве запроса. Кроме того, ts- фенотип в анализе связей, для мутантного, который дополняет запрос, может отражать тесную связь между запросом и новой мутации. Мутанты, которые дополняют проверенные запросы вероятные новые гены, которые войдут в трубопровод для биоинформатики идентификации поражения причинного, и в конечном счете для дальнейшего фенотипического анализа.

Results

Мы покажем ускоренный трубопровод для выделения мутантов тс в хламидомонады. Клетки распределяли на чашках, и вскоре после быстрой проверки под микроскопом для плотности одноклеточных, пластины УФ - облученного (Рисунок 1). Типичные облученные колонии идентифицировали и выбрали в упорядоченную формате через 10 дней роста при разрешающей температуре (рисунок 2). Полученные пластины в формате 384 объединены в 1536-массива (рисунок 3). Из этих первых шагов сбора облучены колоний, мы одел ~ 200000 колоний до сих пор. Плотность суспензии устанавливают на основании планового дозы ультрафиолета, так что, что составляет смерть, 200 - 600 оставшийся в живых колоний сформируется на пластинах. Три УФ Время экспозиции (1,5 мин, 1 мин и 0,5 мин) и три плотности были испытаны соответственно (таблица 1). Эмпирически, 1,5 мин Время экспозиции дало большинство Т.С.- мутанты (~ 50%); Тем не менее, на сегодняшний день, 1 мин дали большинство кандидатов клеточного цикла. Таким образом, будущие раунды УФ-мутагенеза были сделаны только с 1 мин. Важным фактором является разбрызгивание во время первоначального сбора и перекрестного загрязнения (особенно в форматах высокой плотности). Это может привести к дублированию и дальнейшей фенотипирования того же мутанта дважды. Для того, чтобы минимизировать вероятность такого сценария, позаботиться, чтобы собрать колонии в оптимальном размере, и убедитесь в том, что соседние колонии не выбрали в первоначальном анализе.

Далее, два последовательных ts- фенотип анализы (Рисунок 5) были выполнены, и около 3000 ts- мутанты были выделены и фенотипически характеризуются покадровой микроскопии (рисунок 8). Благодаря биологической направленности в изучении клеточного цикла интереса к фенотипов, которые отвечают определенным критериям, мы не заинтересованы в сборе более двух аллелей в каждой мишени гене. Поэтому мы провели комплементации и тестирование навески с уже характеризуемых генов с более чем двумя аллелями (запрос) в отношении вновь собранных кандидатов для удаления высоко повторяющихся генов из нижнего трубопровода (рисунок 9).

Рисунок 1: Равномерное Распространение мутагенезу клеток и УФ - мутагенеза. (а) 384 х 2 мкл капли дозируются на агаровой пластине , с помощью дозатора реагента. (б) Случайные пластины тестируются под микроскопом , чтобы проверить плотность одноклеточных и УФ - облученные с 1-минутное воздействие. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. УФ-мутагенезу Колонии поднято для 384-массивов. (а) УФ-облученной отдельные клетки выращивают в течение ~ 10 дней в видимые колонии. Шкала бар = 2 см. (б) программа анализа изображений распознает разделяемые колонии в соответствии с определенными параметрами и роботизированной массивы их в 384 пластин. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Слияние с 1536-массива. Четыре 384-формата пластины объединены в одну 1536-пластины; когда-то выросли, они реплицируются снова испытать для ts- фенотипа. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотраБольшая версия этой фигуры.

Рисунок 4. Визуализация для количественной оценки. (а) Пластины удерживаются в раме под документом фотографии стоять так , чтобы все пластины в серии фотографируют при одинаковом увеличении и позиционирования. (б) Первое изображение имеет 1536-луночный планшет для микротитрования с красными точками , размещенных в углах и серединах. Эта "сетка-пластина" изображение определяет положение массива. (с) Пример 1536-массива после инкубации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Определение ts- фенотипа по полу-automated анализ изображений. Пластинчатые изображения анализируются с помощью специального программного обеспечения MATLAB (при условии, в СИ). Изображение автоматически сегментирован на клеточные массивы (96, 384, или 1536), и сигнал в каждой ячейке количественно. Рост при 21 ° С отмечен синим цветом, а рост при 33 ° C отмечен желтым цветом. Колонии, проявляющие значительно более высокие темпы роста при 21 ° C по сравнению с 33 ° C (стандартизован до Ts +) выбираются и выделенные черные квадраты с зеленой точкой. Эти выборы можно редактировать вручную. Окончательные выборы переносятся в файл, используемый колониестимулирующий собирание робота. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. Роботизированная Комплектование из первого раунда Т.С. Lethal кандидатов. Вишнево-pickiнг робот следующим инструкциям из файла, созданного, как описано в шаге 2.1, чтобы выбрать кандидатов на новый массив. Верхняя панель показывает загрузку стерилизованную штифта. Нижняя панель показывает точный выбор из определенной колонии в исходной пластине. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7. Покадровый Скрининг для начальной сортировки TS Lethal фенотипов. Клоны , которые прошли два раунда протокола скрининга , показанного на рисунке 5, реплицируются на планшеты при плотности клеток таким образом, что отдельные клетки могут быть разрешены микроскопически. Модифицированный тетрадный рассечение микроскоп используется для определения положения, в которых представлены микрофотографии принимались после 0 ч, 10 ч и 20 ч инкубирования в т 33 ° C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: СЫатуйотопаз клеточного цикла Мутанты Выявленные с помощью Time-Lapse микроскопией. (а) Иллюстрация Chlamydomonas уникального клеточного цикла описывает длинную G1 фазу характеризуется клеточного роста, а затем деления циклов СМ, которые в конечном итоге с вылупления новорожденных дочерних клеток. (б) Микроскопические изображения демонстрируют клетки WT в течение клеточного цикла и идентификации типичных мутантов клеточного цикла , которые не могут завершить митоз. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

лор "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 ">
Рисунок 9: Комплементация и рычажный механизм испытаний. (а) устойчивый к антибиотику (например, Гигро) запрос с часто неоднократного мутировавший ген пересечена в 96-луночный планшет с набором мутантов противоположного типа спаривания , которые укрывают второй антибиотик кассеты сопротивления (например, Paro). Комплементационной пластины дают высокую долю диплоидами, как показано с помощью окрашивания нуклеиновой кислоты и анализа в проточной цитометрии (нижней левой части панели а). (б) спаривание смесь испытывается как для комплементации в диплоидами и для связи в среде с двойной устойчивостью мейотического потомстве. Положительный контроль является сам запрос в противоположном типа спаривания, и, как и ожидалось, показывает ts- фенотип при 33 ° С, в то время как отрицательный контроль WT и показывает Ts + фенотип. Обведенных колонии не показывают комплементации запроса и, следовательно, NРЭБ ts- аллеля гена запроса. Они, как правило, исключаются из дальнейшего исследования, так как только "часто летающих пассажиров" находятся в тестовом наборе комплементационная. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <тд RowSpan = "2"> 0.5 '

Время	OD	Колонии выбрал (#)	ts- фенотип	Кандидаты клеточного цикла
1.5 '	0.012	6000 (Avg = ~ 200)	200 (3,3%)	7 (3,5%)
1 '	0.003	11 000	131 (1,19%)	15 (11,4%)
		(Avg = ~ 360)
6E-04	9000	40 (0,45%)	1 (2,5%)
	(Avg = ~ 300)

Таблица 1: Калибровка облучения Таймс максимизировать выход клеточного цикла мутантных кандидатов. Три раза облучения были испытаны (30 пластин в каждой) с соответствующими ODS для обеспечения уцелевших числа колоний (200 - 600).

Discussion

Трубопровод, описанный здесь для изоляции с высоким выходом TS летальных мутантов гарантирует, что предположительно все клеточные заменимых пути генома Chlamydomonas представлены. Два наиболее важных шагов для эффективного сбора генов потенциальных клеточного цикла и для устранения повторяющихся "часто летающих пассажиров" аллели являются: 1) когерентное определение арестных характеристик фенотипа для неполных клеточных циклов и 2) параллельного анализа комплементационной против уже определены запросить гены, чтобы увеличить коллекцию вновь выделенных из них.

При синхронизации с помощью светло-темного цикла, СЫатуйотопаз растет фотосинтетически в дневное время и увеличивается в размерах клеток> 10x без репликации ДНК или клеточного деления ^13. Примерно совпадает с наступлением ночи, затем клетки проходят несколько циклов переменного репликации ДНК, митоз и деление клеток (рисунок 8). Нормативный счеме обеспечивает естественное различие между генами в первую очередь необходимы для роста клеток и целостности и генов, необходимых специально для цикла клеточного деления. Мы обнаружили , что 10-часовой и 20-часовой моменты времени очень информативны для начального грубого фенотипический вырезать ^1. Широкие классы Т.С. летальных мутантов , которые мы признаем в настоящее время, на основе этих изображений (см SI в Тулина и Креста, 2014) ^1, являются: Notch, попкорн, круглые, малый, средний, ранний лизис, и многократный цикл (рис 8 ).

Три наиболее соответствующие категории мы ориентируемся на являются Notch, попкорн, и круглый. В и фенотип «зарубка» "Попкорн" были показаны ранее, что характерно для большинства клеточного цикла специфических поражений (например, митотический циклин-зависимой киназы, механизмом репликации ДНК и топоизомеразы II) ^1. Появление одного (Notch) или несколько (попкорн) кажущиеся плоскости начинающегося, но безуспешных деления клеток является удобным morphological индикатор инициации клеточного цикла. Эти мутанты обычно имеют мало или нет дефектов роста, с увеличением объема клеток, аналогичной WT на отметке 10 ч. Фенотипы Notch и попкорн очевидны в 10 ч и полностью развиты (часто ассоциируется с лизиса клеток) на 20 ч. "Круглые" клетки растут так же, как WT, но с большим сниженным уровнем производства очевидных зарождающихся плоскостей разделения, получая таким образом большие, круглые арестованные клетки. Предыдущие мутанты в этой категории попали в компонент анафазных-продвижение комплексных ¹⁴ или в генах , необходимых для функции микротрубочек (тубулина раскладывающейся кофакторов, гамма-тубулина кольцо комплекс) ^1. В более поздние времена, эти клетки часто демонстрируют выраженный лизис клеток.

"Малый" и клетки "Medium" растут либо пренебрежимо (Small), либо значительно меньше, чем WT (Medium). Многие из этих мутантов, выявленных на сегодняшний день имеют повреждения в генах, чьи аннотаций предложить роли в основной cellulaпроцессы роста г (перевод или мембранного биогенеза). Основная микроскопическая дискриминация между средней и раунда основывается на сумме прироста в 10 ч (Round: как WT, средние: снижение). Поскольку Малые и средние категории достаточно велики, и, вероятно, отражают поражения в большом диапазоне клеточных путей, мы не пытаемся насытить эти категории; Тем не менее, мы хотим определить представителей на молекулярном уровне класса, чтобы понять фенотипы потери в различных путей. Две изученные категории: 1) ранний-лизировать мутанты, которые теряют целостность (потеря зеленого цвета, потеря refractility) на отметке 10-ч, с небольшим свидетельством роста уровня клеток и 2) нескольких циклов. Клетки размножаются так же, как WT в 10 и 20 часов, хотя они демонстрируют полную неспособность осуществлять долгосрочную пролиферацию.

Мы в основном характеризующие "ступеньку", "попкорн" и "круглый" и исключить малые и средние круглые клетки, а такжекак негерметичных мутанты, которые завершают несколько клеточных делений. Это, главным образом, чтобы гарантировать, что основные клеточные функции, такие как рост и целостности мембраны, являются функциональными и обогащают вероятность генов деления, связанных с. Такой подход оказывается эффективным эмпирически; Тем не менее, это может быть, что ген, клеточный цикл плейотропно и имеет дополнительные роли ранее в G1, до фактического разделения. Такие случаи, которые мы ожидаем быть редкими, пропущены. В более общем плане, мы стремимся к гомогенным арест, который в высокой вероятности связано с одной причинным мутация, которая является полностью дисфункциональным белок. Тем не менее, по той же причине, как только что описано, может быть несколько точек на арест и, следовательно, некоторая гибкость желательно при выборе кандидатов.

Для того, чтобы обогатить коллекцию с недавно идентифицированных генов, выбранные кандидаты анализировали на комплементарности. Мы требуем ts- в положительном контроле (запрос к мутации запросов) и Ts + в отрицательном контроле (Querг против WT). Новые мутанты в той же группе, что комплементационной запроса являются ts-. Членство в той же самой группе комплементационной почти всегда отражает молекулярную повреждение в том же гене (это имело место для каждого такого гена мы проверили). Поэтому для "часто летающих пассажиров" этот критерий исключающий для дальнейшей характеристики. Мутанты, которые не были в одних и тех же групп, как комплементационных тестируемых запросов являются кандидатами для новых генов и дополнительно характеризуются биоинформатики и экспериментальных средств. Высокая переменная восстановление ts- аллели в различные группы комплементации является хорошо известное явление, то есть изменчивость заметно больше, чем Пуассона шума, благодаря большой внутренней изменчивости переменчивости к ts- между различными генами. Причины могут включать в себя внутренние различия Термолабильность; различных размеров белка; наличие белка в качестве мономера в сравнении, как большой, стабилизированный комплекс; и мутагенные горячих точках. Это почти чистый nuisaсть. Тем не менее, один в результате благоприятный исход является то, что список "часто летающих пассажиров" не долго (всего несколько целей, занимающих большую часть списка), поэтому тестирование комплементационная трудоемкая не массивное обязательство до поздних стадий проекта.

В качестве дополнительного подхода, мы провели анализ сцепления. В этом анализе, двойной устойчивостью потомства отбирают и тестируют на ts- фенотипа. Ts- фенотип, как ожидается (и наблюдается) для мутантов в той же самой группе комплементационной в качестве запроса или тесно связанных мутаций. Для каждого из тестируемых генов, БТ Потомство ожидается появление (Ts + фенотип) в некоторой вероятностью, зависящей от генетического расстояния. По нашим оценкам, существует около 100 Зигоспоры для каждого спаривания в этих точках. Предполагая, что 100% мейотическую эффективность, это приведет около 100 двойной лекарственной устойчивостью потомстве от несвязанных кассет устойчивости к лекарственным средствам (25% от мейоза потомства, четыре в мейозе, в связи с Мendelian наследование). Это также будет иметь место для ts- мутаций, где 25% потомстве будет двойной мутант, и 25% будет WT, если запрос и тест-мутации являются несвязанными. Таким образом, из двойной лекарственной устойчивостью потомства, 25% будет WT (около 25 клеток). Это тот случай, для полностью несвязанных мутаций; Тем не менее, умеренная связь ( в пределах ~ 20 см, около 2 Мб, или 2% генома ¹¹⁵⁾ будет сильно уменьшить или устранить Ts + сигнал. В случае связывания испытываемого мутации к кассете антибиотика, Ts + гаплоидов, которые имеют двойной лекарственной устойчивостью присутствуют в очень малых количествах. Это проявляется в виде явной неспособности рекомбинируют со всеми мутантами тестируемых, несмотря на все мутанты дополняя испытания, аберрантный результат, нетрудно заметить; в таких случаях возвратное скрещивание решит проблему.

Оба из предшествующего уровня знаний и от анализа последовательности, мы ожидаем , что гены клеточного цикла в хламидомонады быть около 500 генов , ^2, хотя мой, но, вероятно, не все, имеют важное значение. Мы будем оценивать необходимость дополнительных раундов мутагенеза, как собраны все больше мутантов и уровень насыщения повышается.

Эта процедура однозначно предназначен для изучения существенных биологических процессов и гены и белки, которые осуществляют их. Другие методологии для создания возмущения важных генов существуют (например, трансформация случайным образом мутагенезу аллели ^16, условно расшифрованных аллели ^17, или гипоморфных аллели ^18). Тем не менее, все они требуют гомологичной рекомбинации, которая сильно подавлена ​​в вегетативном хламидомонады. Кластерный, регулярно interspaced короткий палиндромным повтор (CRISPR) / система cas9 была создана в качестве мощного инструмента для модификации гена ^19; Тем не менее, он все же эффективно работать в Chlamydomonas ^20. Чрезвычайно важно, все эти методы требуют предварительного знания цели. Это серьезное ограничениеесли кто-то хочет, чтобы иметь возможность узнать что-то новое! Наш подход даст мутации генов, идентифицирующие существенные, независимо от каких-либо предварительных знаний. Таким образом, на современном уровне техники, выделение случайных мутаций Т.С. с последующей идентификации генов с помощью глубокого секвенирования может быть наиболее эффективным способом получения быстрого вступления в микробной клеточной биологии в надцарства растений.

Идентификация причинных мутаций (из числа ~ 100 кодирования последовательности меняющихся мутаций в каждом клоне) выходит за рамки данной статьи. Глубокое секвенирование наливных сегрегант бассейнов ¹ является эффективным , но трудоемкое. Комбинаторный стратегия пул для определения всех мутаций в большом количестве штаммов, после секвенирования небольшого количества бассейнов, является очень экономичным и эффективным труда. Новая стратегия для комбинаторной наливных сегрегант секвенирования находится в стадии разработки, что позволит выявить причинные мутации в десятках мутантов SIM-картыultaneously в один прогон секвенирования (в процессе подготовки). Эти эффективности очень важны, чтобы позволить важным шагом идентификации гена, чтобы идти в ногу с очень быстрым накоплением мутантов, что стало возможным с помощью процедур, описанных здесь.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment:
Hudson RapidPick колонии	Hudson Robotics
MultiDrop Combi Дозатор реагентов	Thermo Scientific	5840300
Маленькая трубка с металлическим наконечником кассета	Thermo Scientific	24073295
Singer RotoR Робот для нанесения покрытий	Singer Instruments		Очень важно для процесса. Для отсева в меньшем масштабе вы можете использовать собственный ручной инструмент
Singer для сбора урожая с одной колонией (' Стингер»)	Инструменты		можно подобрать вручную, однако для больших гамм это практически невозможно<
>Name	Company	>Номер в каталоге	Комментарии
Материалы:
SYTOX Окрашиватель зеленых нуклеиновых кислот	ThermoFisher Научный	S7020