Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО метилированных

5.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54838

⸱

21 декабря 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, 3Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 4Indiana Biosciences Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Гибель островков β клеток предшествует развитию диабета 1 типа, и обнаружение этого процесса может позволить провести раннее терапевтическое вмешательство. В этой статье мы подробно описываем, как измерять дифференциально метилированные виды ДНК INS в сыворотке крови человека в качестве биомаркера гибели β клеток.

Аннотация

Считается, что гибель островковых β клеток лежит в основе патогенеза практически всех форм диабета и предшествует развитию выраженной гипергликемии, особенно при диабете 1 типа. Разработка чувствительных и надежных биомаркеров гибели β клеток может позволить провести раннее терапевтическое вмешательство для предотвращения или отсрочки развития диабета. В последнее время несколько групп, включая нашу, сообщили, что внеклеточное, дифференциально метилированное ДНК, кодирующее препроинсулин (INS) в кровотоке, коррелирует с β гибелью клеток при преддиабете 1 типа и впервые возникшем диабете 1 типа. Здесь мы представляем пошаговый протокол с использованием цифровой ПЦР для измерения внеклеточной ДНК INS, которая дифференциально метилирована в цитозине в положении -69.о. (относительно сайта начала транскрипции). Мы демонстрируем, что анализ может различать метилированный и неметилированный цитозин в положении -69.о., является линейным на несколько порядков, обеспечивает абсолютное количественное определение числа копий ДНК и может быть применен к образцам сыворотки крови человека от лиц с впервые возникшим диабетом 1 типа и контрольной группы без заболевания. Описанный здесь протокол может быть адаптирован к любым видам ДНК, для которых требуется обнаружение дифференциально метилированных цитозинов, будь то из циркуляции или из изолированных клеток и тканей, и может обеспечить абсолютное количественное определение фрагментов ДНК.

Введение

Сахарный диабет 1 типа (СД1) является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуется разрушением инсулин-продуцирующих бета - клеток островка с помощью аутореактивных Т - клеток 1. Диагноз СД1, как правило, производится при измерении (глюкозы в крови> 200 мг / дл) гипергликемия в обедненной, молодого человека, который мог бы представить с кетоацидозом как свидетельство дефицита инсулина. На момент постановки диагноза СД1, имеются данные о существенной потере функции β клеток и массы (от 50 - 90%) 2. В клинических исследованиях, несколько иммунных модулирующих препаратов, которые были возбуждены в момент постановки диагноза привело к стабилизации функции β клеток (и, предположительно массы), но ни привели к клинической ремиссии заболевания, один важный вывод, поднял призыв к развитию биомаркеров для ранней диагностики заболевания и для продольного отслеживания эффективности комбинированной терапии 3,4. Усилия международных консорциумов, такаяS Человек Островок Исследовательская сеть Консорциума в национальных институтах Heath 5, подчеркнули необходимость разработки биомаркеров , которые сосредоточены на бета стресса и гибели клеток в СД1.

В соответствии с этими усилиями, наша группа и другие недавно разработали биомаркеров анализы на котором эта мера циркуляционные, эпигенетически модифицированные фрагменты ДНК , которые возникают в основном из умирающих -клеток 6 - 9. Во всех опубликованных анализов на сегодняшний день, внимание было сосредоточено на количественному кодирующего гена препроинсулин человека (INS), который демонстрирует большую степень неметилированных сайтов CpG в кодировании и промоторной области по сравнению с другими типами клеток. Освобождение неметилированных фрагментов ДНК ИНС была выдвинута гипотеза , как возникающие главным образом от смерти (некротические, апоптозе) -клеток. Наши недавние исследования показали , что в молодости, возвышенностей в обоих неметилированной и метилированной ДНК INS в положении -69 б.п. ( по отношению к тон сайт начала транскрипции) наблюдались в впервые выявленного СД1, и вместе служили в качестве специфических биомаркеров для этой группы населения 6. Эти биомаркеры анализы включают изоляцию бесклеточной ДНК из сыворотки или плазмы с использованием коммерческих наборов спин, с последующим превращением бисульфита выделенной ДНК (чтобы преобразовать без метилируется цитозина в урацила, оставляя метилированных цитозина нетронутыми).

В этом докладе мы опишем технические аспекты сбора образцов сыворотки, выделения бесклеточной ДНК из сыворотки, бисульфита преобразования, и производительность капельным цифровой ПЦР (далее, цифровой ПЦР) для дифференциально метилированной INS ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление об этике: Протоколы были одобрены Советом по институциональному обзору Университета Индианы. Родители испытуемых давали письменное информированное согласие, а дети старше 7 лет давали согласие на их участие.

1. Обработка сыворотки

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный анализ был тщательно протестирован с использованием сыворотки крови, выделенной следующим образом.

  1. Соберите кровь в одну пробирку для сбора крови с красной крышкой (без добавок; без оболочки).
  2. Дайте постоять при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы образовался сгусток.
  3. Пробирка центрифуги при плотности 2 000 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Перенесите надосадочную жидкость (сыворотку) в новую пробирку, предназначенную для хранения сыворотки (полипропиленовые пробирки с завинчивающейся крышкой, размер которых зависит от образцов).
  4. Храните образцы при температуре -80 ºC до тех пор, пока они не будут готовы к выделению ДНК.

2. Экстракция сывороточной ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК экстрагируется с помощью набора для экстракции ДНК с использованием 50 μл сыворотки (рекомендуется), в соответствии с протоколом производителя с некоторыми изменениями.

  1. Приготовьте 200 мкл буфера для лизиса + 1 мкл поли(А) (5 мкг) на образец в микроцентрифужной пробирке. Вихрь на 15 сек. Отложите до шага 2.3.
  2. Возьмите образцы сыворотки из морозильной камеры при температуре -80 ºC и разморозьте при комнатной температуре. Доведите общий объем образца сыворотки до 200 мкл с помощью фосфатно-солевого буфера (PBS, с хлоридом кальция и хлоридом магния).
  3. Лизируйте образец, добавив в образец 20 мкл протеазы (1,4 единицы Ансона/мл), затем 200 мкл лизисного буфера/полиА смеси (начиная с шага 2.2) и ввергните в вихрь в течение 8 с. Инкубируйте образец при 56 °C в течение 10 мин, затем кратковременно центрифугируйте в течение 7 сек на максимальной скорости в микроцентрифуге (>10 000 x г).
  4. Осадите ДНК, добавив 230 μл 100% этанола в образец, и сделайте вихрь в течение 8 секунд. Кратковременно центрифугируйте в течение 7 секунд на максимальной скорости (>10 000 x g).
  5. Нанесите ДНК на спиновую колонку, добавив 600 мкл смеси образцов в мини-спиновую колонку. Центрифугируйте при 6 000 x g в течение 1 мин. Выбросьте проточный поток и поместите колонку в чистую пробирку.
  6. Промойте ДНК, добавив в колонку 500 мкл буфера для промывки 1. Центрифугируйте при 6 000 x g в течение 1 мин. Выбросьте проточный поток и поместите колонку в чистую пробирку. Добавьте 500 мкл промывочного буфера 2 в колонку и центрифугируйте на максимальной скорости (>10 000 x г) в течение 3 минут. Поместите колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и снова центрифугируйте на максимальной скорости в течение 1 минуты.
  7. Элюируйте ДНК, поместив колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и добавив 60 мкл элюирующего буфера непосредственно на фильтр. Важно переключать наконечники между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, затем центрифугировать при 6000 x g в течение 1 минуты. Добавьте еще 60 мкл элюирующего буфера и центрифугируйте при 6 000 x g в течение 1 минуты.
  8. Храните ДНК при температуре -20 ºC для последующего использования, или сразу приступайте к преобразованию бисульфита.

3. Преобразование бисульфита

ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразование бисульфита выполняется с использованием комплекта для преобразования бисульфита в соответствии с протоколом производителя с некоторыми изменениями.

  1. Чтобы превратить неметилированные цитозины в урацилы, добавьте 130 мкл бисульфитного конверсионного реагента к 20 мкл ДНК с шага 2,7 в ПЦР-пробирку (одиночную ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл или 8-полосную ПЦР-пробирку). Оставшиеся 40 мкл ДНК сохраните впрок, или используйте в реакциях репликации. Перемешайте 20 раз, пипетируя вверх и вниз, и кратковременно центрифугируйте, чтобы убедиться, что капли не попали на бока или крышку. Инкубировать на водяной бане или в термоамплификаторе следующим образом: 98 °C в течение 8 мин, 54 °C в течение 60 мин, 4 °C в течение 5 мин.
    1. Перейдите к шагу 3.2 или храните при температуре 4 °C до 20 часов.
  2. Добавьте 600 мкл связующего буфера в спиновую колонку и поместите колонку в прилагаемую пробирку для сбора. Нанесите бисульфитированную ДНК на колонку и перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз. Центрифуга работает на максимальной скорости (>10 000 x g) в течение 30 сек.
  3. Промойте ДНК, добавив 100 μл буфера для промывки в колонку и центрифугу на максимальной скорости (>10 000 x g) в течение 30 секунд.
  4. Проводят десульфонирование для удаления сульфонатной группы для завершения превращения неметилированных цитозинов в урацил путем добавления в колонку 200 мкл буфера для десульфонирования. Дайте постоять при комнатной температуре в течение 20 минут, затем центрифугируйте на максимальной скорости (>10 000 x g) в течение 30 секунд.
  5. Промойте ДНК, добавив 200 μл буфера для промывки в колонку, и центрифугируйте на полной скорости в течение 30 сек. Отбросьте проточный поток и повторите этот этап промывки.
  6. Поместите колонку в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Элюирование ДНК путем добавления 10 мкл элюирующего буфера непосредственно в фильтр колонок. Инкубировать в течение 1 минуты. Центрифуга в течение 30 с на полной скорости для элюирования ДНК. Количественная оценка восстановленной ДНК с помощью спектрофотометрии в A260.
    ДНК, обнаруженная с помощью спектрофотометрии, представляет собой в первую очередь ДНК-носитель polyA, которая была добавлена на шаге 2.3 выше. Как правило, рекуперация полиА составляет ≥85% от входящего (>4,25 мкг).
  7. Храните ДНК при температуре -20 °C до тех пор, пока не будете готовы к цифровой ПЦР.

4. Мультиплексная цифровая ПЦР

  1. Сделайте мастер-микс с достаточным количеством раствора для каждого образца и контролируйте. Включите по меньшей мере один образец, содержащий воду (отрицательный контроль), один образец плазмиды, содержащей неметилированные ИНС (1 пг, положительный контроль), один образец плазмиды, содержащей метилированные ИНС (1 пг, положительный контроль), и один образец, содержащий смесь плазмид в соотношении 1:1.
    1. Чтобы приготовить мастер-смесь для ПЦР, добавьте 12,5 мкл на реакцию ПЦР-буфера (например, 125 мкл на 10 образцов), 1,25 мкл на реакционную смесь праймер/зонд (например, 12,5 мкл на 10 образцов), 8,25 мкл на реакционную воду (например, 82,5 мкл на 10 образцов), 0,5 мкл на реакцию фермента EcoR1 (например, 5 мкл на 10 образцов).<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются следующие капсюли и щупы: Прямая грунтовка: 5'-GGAAATTGTAGTTTTTTTTTTTTATTATTTGT-3'; Грунтовка реверсивная: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; ФАМ-зонд: FAM-5'-ACCCCTACCTAAC-3'-MGB; Зонд ВИК: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
  2. Настройте мультиплексную ПЦР-реакцию в 96-луночном планшете. Добавьте в каждую лунку по 19,5 мкл мастер-смеси. Добавьте 2,5 мкл образца бисульфит-преобразованной ДНК в каждую соответствующую лунку (сохраните оставшиеся 7,5 мкл бисульфит-преобразованной ДНК или используйте в реакциях репликации). Перемешайте пипеткой вверх и вниз несколько раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все 8 лунок подряд должны содержать пробу или буфер управления.
  3. Уплотнить пломбой из фольги с помощью плоского запайщика и центрифуги в пластинчатом спиннере до тех пор, пока на стенках лунок не останется жидкости.
  4. Настройте автоматический генератор капель на сенсорном экране.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все 8 лунок в картридже должны содержать пробу или буфер для контроля пробы.
    1. Установите количество используемых строк, коснувшись строк, в которые загружаются образцы, на 96-луночном планшете из шага 4.2 и выделите строку синим цветом, чтобы обозначить активную строку.
    2. Загружайте расходные материалы сзади вперед, чтобы избежать загрязнения. Для начала добавьте картриджи вдоль заднего ряда прибора. Установите наконечники в центральный ряд прибора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Картриджи могут вставляться в держатели только в правильной ориентации.
    3. Поместите в инструмент 96-луночную пластину. Извлеките холодный блок из морозильной камеры с температурой -20 °C и поместите в него новую 96-луночную пластину с юбкой. Поместите его внутрь прибора рядом с образцом загруженного 96-луночного планшета.
    4. Добавьте масло в дозатор в передней части прибора. Выберите тип масла на сенсорном экране.
    5. Нажмите на синюю кнопку запуска, чтобы начать пробежку. Подтвердите настройку пластины и нажмите кнопку запуска для начала.
  5. После этого снимите 96-луночный планшет, содержащий вновь образовавшиеся капли, и запечатайте пломбой из фольги с помощью герметика для планшетов.
  6. Проводят ПЦР10 на термоамплификаторе по следующей программе: 95 °C в течение 10:00 мин; 40 циклов при температуре: 94 °C в течение 00:30 мин, 57,5 °C в течение 01:00 мин; 98 °C в течение 10:00 мин; 12 °C в течение 10 мин или до 24 ч.
  7. Поместите пластину на считыватель капель и установите считыватель.
    1. Перейдите на вкладку настройки. Откройте новый шаблон, нажав на шаблон > новый. Введите имя файла.
    2. Используйте редактор скважин для установки параметров для каждой пробы. Присвойте каждому образцу уникальное имя, установите для параметра experiment значение Rare Event Detection (R-RED) и установите для мастер-микса микс, используемый на шаге 4.1.
    3. Дайте Мишени 1 имя (т.е. неметилированную) и установите Мишень 1 как неизвестную (U). Дайте Мишени 2 имя (т.е. метилированную) и установите Мишень 2 в качестве эталона (R).
    4. Перейдите на вкладку Выполнить, чтобы начать прогон. В окне параметров запуска выберите химический состав обнаружения (FAM/VIC).

5. Анализ данных

  1. Откройте результаты на вкладке «Анализ» и проанализируйте с помощью 2-D графика на основе положительных элементов управления (см. рис. 1).
  2. Экспортируйте CSV-файл, сгенерированный считывателем капель, в программу для работы с электронными таблицами для анализа данных.
  3. Чтобы получить «копии на мкл» сыворотки, используйте формулу: (концентрация*250)/(объем сыворотки, используемой для выделения ДНК, в мкл). 6<чел. /> ПРИМЕЧАНИЕ: Данные обычно преобразуются в log10 при получении из сыворотки крови человека для обеспечения нормального распределения. В качестве альтернативы данные могут быть построены в масштабе log10 и проанализированы с помощью непараметрической статистики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того, чтобы интерпретировать данные надлежащим образом , мы используем плазмиды управления для обоих неметилированной и денатурированного ДНК - мишени INS в каждом цифровом PCR перспективе. Эти элементы управления убедитесь, что сигналы, соответствующие денатурированного и неметилированной ДНК четко различимы. На рисунке 1 показаны диаграммы рассеяния 2-D , соответствующие капель плазмиды управления , содержащих бисульфит преобразованного неметилированную

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метилирование цитозина по метилтрансферазам ДНК позволяет эпигенетического контроля транскрипции у многих генов. Ген INS у человека почти исключительно выражается в островок бета клеток, и, как представляется, корреляция между частотой метилирования цитозина в гене INS , чтобы заставить замолчать его транскрипции 11. Таким образом , большинство типов клеток показывают значительно более высокие частоты метилирования гена INS при различных цитозина по сравнению с бета - клеток 11...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения UC4 DK104166 (для RGM). Мы хотели бы выразить признательность за помощь Центру перевода Исследовательского центра диабета Индианы при поддержке гранта Национальных институтов здравоохранения P30 DK097512.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Красный топ Vacutainer Beckon Dickinson366441без добавок, внутренняя часть без покрытия, 10 мл
Криовиальная пробиркаSimportT310-3Aполипропилен, пробирка с завинчивающейся крышкой, любой размер
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51106
Poly(A)SigmaP9403нелюбимый в TE буфере (10 мМ Tris-Cl pH 8,0 + 1 мМ ЭДТА) до 5 & микро; g/µ l 
Абсолютный этанол (200 пруф)Fisher ScientificBP2818-500
DPBS (с CaCl2 и MgCl2)SigmaD8662
0,2 мл PCR 8-полосковые пробиркиMidSciAVST
8-полосные колпачки, куполMidSciAVSTC-N
EZ DNA Метилирование-молния ZymoD5031
ddPCR Supermix для зондов (без dUTP)Biorad1863024
Буферный контроль для зондовBiorad1863052
человека Неметилированный/метилированный праймер/смесь зондовLife TechnologiesAH21BH1
EcoR1New England BiolabsR0101L
twin.tec PCR Plate 96, полуодетыйEppendorf951020346
Термосвариватель из прокалываемой фольгиBiorad1814040
PX1 PCR Plate SealerBiorad1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR SystemBiorad 1864101
Масло для автоматизированной генерации капель Biorad186-4110
DG32 Картридж для автоматического генератора капельBiorad186-4108
Наконечники для пипеток для автоматического генератора капельBiorad186-4120
Бункеры для наконечников пипеток для автоматического генератора капельBiorad186-4125
C1000 Сенсорный термоамплификаторBiorad1851197
QX200 Считыватель капельBiorad186-4003
ddPCR Считыватель капель МаслоBiorad186-3004

Ссылки

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778(2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953(2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942(2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Дифференциально метилированная ДНКцифровая ПЦРгибель бета-клетокбисульфитная конверсияДНК препроинсулинасахарный диабет 1 типаабсолютный количественный анализвнеклеточная ДНКметилированная неметилированная
Измерение ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО метилированных
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.