Наблюдение и Количественное брачного поведения в Pinewood нематоды, Bursaphelenchus xylophilus

Summary

Представлен протокол исследования брачного поведения сосновой нематоды, Bursaphelenchus xylophilus. Поведенческие особенности B. xylophilus описаны в процессе спаривания.

Abstract

Способ наблюдения и количественной оценки поведения сопряжении сосновой нематоды, Bursaphelenchus xylophilus, был создан под стереомикроскопа. Для повышения эффективности спаривания B. Xylophilus и увеличить шансы наблюдения спаривания, девственные взрослые культивировали и использовали для исследования. Яйца были получены путем держать нематод в воде и позволяя самки откладывают яйца в течение 10 мин. Молодь второго этапа (J2) были синхронизированы путем инкубирования яиц в течение 24 ч при 25 ° C в темноте, и в начале Д4 были получены культивированием J2 с серой гнили, Botrytis сшегеа, еще 52 ч. В этот момент времени, большинство J4 нематоды может быть четко отличать как мужского или женского пола с использованием их половых морфологии. Мужского и женского пола J4 собирали и культивировали отдельно в двух разных чашках Петри в течение 24 ч, чтобы получить девственные взрослых нематод. Девственница самец и самка девственницей были соединены в капле очистэр в скважине вогнутого ползуна. Брачное поведение было снято с видеомагнитофоном под стереомикроскопа. Весь период процесса спаривания был 82,8 ± 3,91 мин (среднее значение ± SE) и может быть разделен на 4 этапа: поиск, контактирующих, совокупляющихся и сохраняющиеся. Средние минуты продолжительности были 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 и 7,2 ± 0,5, соответственно. Одиннадцать суб-модели поведения были описаны: крейсерская, приближаясь, сталкиваясь, прикасаясь, Hooping, размещение, установка, эякуляцию, отделяя успокоенность, и роуминг. Интересно, что наблюдалось очевидное внутри половой конкуренции, когда одна женщина была сгруппирована с 3-х самцов или одного самца с 3-х самок. Этот протокол является полезным и ценным, а не только при исследовании брачного поведения Б. xylophilus, но и выступает в качестве эталона для этологических исследований других нематод.

Introduction

Сосновая нематода, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, является одним из самых разрушительных инвазивных видов, вызывающих увядание и возможную гибель сосен. Считается, что эта патогенная нематода родом из США, но она была завезена в несколько стран, включая Китай, Японию, Южную Корею и Португалию. Недавно сообщалось о нем и в Испании, в результате которого погибли миллионы сосен, что привело к огромным экономическим потерям и поставило под угрозу производство лесов и экологическую стабильность^.

Как только сосна-хозяин заражается сосновыми нематодами, тысячи миллионов потомков быстро размножаются внутри ствола. Это вызывает дисфункцию ксилемы, приводящую к увяданию и, в конечном итоге, к гибели дерева-хозяина⁶. Однако в настоящее время не существует эффективного способа борьбы с этим заболеванием. Брачное поведение может играть важную роль в высокой плодовитости этой нематоды⁷. Поэтому мы исследовали брачное поведение B. xylophilus в лаборатории, пытаясь найти эффективный способ нарушить его спаривание и снизить его плодовитость.

Этот протокол предназначен для представления подробных методов получения девственных взрослых особей B. xylophilus, а также наблюдения и анализа брачного поведения с помощью видеорегистратора и стереомикроскопа. Этот протокол также может быть использован в качестве эталона для поведенческих исследований других нематод.

Protocol

1. Приобретение Virgin взрослых нематод

1. Pinewood нематода изолят и условия культивирования
   Примечание: В B. xylophilus изолировать Nxy61 первоначально был извлечен из пораженной Pinus massoniana в районе Нинбо провинции Чжэцзян в Китае.
   1. Приготовьте картофельный агар с декстрозой (PDA, приведены в таблице материалов) пластин для выращивания ботритис серый.
   2. Для получения прививки, перфоратор кусок грибковой мата с диаметром 10 мм от B. стегеа мата и положить его в середину нового КПК пластины. Культура B. стегеа в течение 5 дней при 25 ° С в темноте.
   3. Культура сосняк нематоды в подготовленную чашку Петри , содержащую B. стегеа при 25 ° С в темноте.
2. Приобретение B. xylophilus яиц
   1. Поместите зажат резиновую трубку ниже воронки и удерживать подготовленную воронку в стойку, чтобы собратьBaermann воронку аппарата. Поместите два слоя фильтровальной бумаги вместо марли во рту воронки.
   2. Передача грибковые культуры к установке воронки и добавьте воду до тех пор, пока грибковая коврик погружен. Подождите 2 ч, а нематоды выйдет из грибковой культуры, пересекают фильтровальную бумагу, и осесть в самой нижней части воронки Baermann.
   3. Собирают первую пару капель воды из нижней части трубы в 15 мл пробирку и собирают с нематодами, медленно открывая зажим на трубке.
   4. Центрифуга выше коллекций при 3000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
   5. Удалите верхний слой воды с помощью пипетки и ресуспендирования его с 1 мл стерильной бидистиллированной (дд) H ₂ O.
   6. С помощью пипетки, передать выше взмучивания к новой стеклянной чашке Петри (диаметром 6 см). Добавьте 3 мл стерильного дд H ₂ O в чашке Петри , чтобы гарантировать , что нематоды могут свободно плавать.
   7. Держите нематод в GlasS Петри в течение 10 мин при 25 ° С в темноте. Яйца будут заложены беременных самок. Из-за их гликопротеин поверхности, яйца прилипают к нижней части стеклянной чашке Петри.
   8. Удалите воду и червей осторожно, не нарушая яйца. Добавьте 3 мл стерильного дд H ₂ O в стеклянную чашку Петри немедленно , чтобы предотвратить яйца от высыхания.
   9. Повторите шаг 1.2.8 3x, чтобы удалить все личинки и взрослые, и получить чистые яйца. Добавить дополнительные 2 мл (5 мл в общей сложности) стерильного дд H ₂ O в чашке Петри.
3. Приобретение четвертого ювенильной стадии (личинки J4)
   1. Hatch собранные яйца в течение 24 ч в темноте при 25 ° С для получения личинок J2.
   2. Переносят личинки J2 с пипеткой в ​​15 мл пробирку, центрифугируют при 3000 х г в течение 2 мин, и снять верхний слой воды.
   3. Ресуспендируют личинки J2 200 мкл стерильного дд H ₂ O, а затем передавать их вКПК пластина , содержащая B. стегеа.
   4. Культура личинки J2 в течение 52 часов при 25 ° С в темноте. В этот момент времени, большинство личинок J2 не развились в ранней стадии личинок J4.
4. Приобретение целинных взрослых нематод
   1. Подготовьте иглу для получения нематод, нарисовав стеклянный капилляр после нагревания его над горелкой спирта.
      Примечание: Кончик этой капиллярной иглы обычно должна быть 50 мкм в диаметре, примерно ширина тела взрослого нематоды, так что он может быть использован в качестве инструмента для получения одного нематоде.
   2. Соберите воронку Baermann и извлечения нематод из грибковых культур в течение 2 ч, как описано в пунктах 1.2.1 - 1.2.3.
   3. Перенести J4 с водой в чистую чашку Петри.
   4. Обратите внимание на нематод под стереомикроскопа и различать самцов и самок по генитальной морфологии, как описано Mamiya и Kiyohara ⁸ (рис 1 ). Возьмите нематодой желаемого пола с приготовленной капиллярной иглой и передать его в соответствующий грибковое-культуральный планшет для мужчин или женщин.
      Примечание: Есть больше женщин, чем мужчин, с процентом женщин на 60 - 70%. Женская вульва, очевидно, отличается от мужского спикулы. По сравнению с взрослым, спикулы или вульва в ранней стадии J4 меньше, но они все еще можно легко увидеть и отличается. Нематода всегда движется в воде, что иногда увеличивает сложность различения самцов и самок.
   5. Культура личинки Д4 еще в течение 24 часов при 25 ° С в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все нематоды должны развиваться во взрослых, но так как они являются Разъединенные, они считаются девственными взрослых.
   6. Соберите два Baermann воронок и извлечь целинные взрослых от грибковых культур в течение 2 ч, как описано в пунктах 1.2.1 - 1.2.3, а также передавать целинные взрослых самцов и самок на две отдельные, чистые чашки Петри.

   2. Наблюдение и видеозапись брачного поведения

   1. Подготовьте несколько вогнутые слайдов и добавьте 200 мкл стерильного дд H ₂ O к каждому из своих скважин.
   2. Возьмите подготовленный девственную взрослый мужчина или женщина и с капиллярной иглой и поместить только одну нематодой в воду каждого вогнутого слайда.
   3. Держите целинные взрослых внутрь скважины в течение 1 часа, чтобы позволить им адаптироваться к новой водной среде.
   4. Пара девственной мужского и женского пола, передавая один из них из одной ямы в другую с помощью пипетки.
   5. Обратите внимание на поведение сопряжении 1♀ + 1♂ комбинации в вогнутом слайде под стереомикроскопа.
   6. Для анализа эффективности спаривания целинных взрослых, вычислить их скорость спаривание успеха (R) и сравнить ее с случайно выбранных взрослых пар. Вычислить R как процент повторностей, в которых наблюдалось спаривание по сравнению с общим числом повторностей изученных.
   7. Для того, чтобы исследовать выбор спаривание и intrasexual конкуренции, группы и наблюдать девственные нематод из двух разных комбинаций: 1♀ + 3♂ и 3♀ + 1♂.
   8. Для сбора данных для качественного и количественного анализа, снимать брачное поведение с помощью видеомикроскопия. Как правило, весь процесс спаривания, с того времени, когда нематоды помещаются в лунку вогнутой слайд до момента, когда они отходят после совокупления, завершается в течение 2 ч. Таким образом, запись процесса спаривания непрерывно в течение не менее 2 ч, как один повторности. Полное по крайней мере, 30 размножается в общей сложности для каждой комбинации.
      Примечание: Добавить бесплоднее дд H ₂ O (обычно 50 мкл) каждые 0,5 часа в колодец , чтобы компенсировать испарение во время процесса записи.

   3. Сбор данных

   1. Просмотреть все видео внимательно на экране компьютера и охарактеризовать подгруппы поведения качественно.
   2. Измерьте продолжительность спаривания с использованием гое кадр за кадром функция видеомагнитофона. Вручную вычесть начальное время от конечной точки.
   3. Для комбинации 1♀ + 1♂, анализировать каждую запись видео и измерения длительности следующих событий:
      1. Мера продолжительности поиска (то есть время от момента , когда самка и самец, вводят в лунку вогнутой слайд до момента они сталкиваются и соприкасаются друг с другом).
      2. Измерьте продолжительность контактирования (т.е. время от первого контакта до момента , когда мужчина точно расположить на вульву самки для первого совокупления).
      3. Мера продолжительности совокупления (то есть время от момента , когда мужчина точно позиционируется на вульву самки , пока он не скользит вниз от тела самки после эякуляции). Примечание: Некоторые нематоды могут совокупляться несколько раз в 2 часа. В таких случаях, измерять длительность совокупления от первого совокупления до конца Ласт один, включая время между ними.
      4. Измерьте продолжительность протяжные (т.е. период после совокупления до мужского и женского пола уплывают друг от друга и отделены друг от друга на расстоянии больше , чем длина тела нематод ( как правило , 1 мм)).
   4. Подсчитайте частоту совокупления и продолжительность каждого совокупления , а средняя продолжительность всех совокуплений в 2 ч для каждого из различных комбинаций (т.е. 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ и 1♀ + 3♂).
   5. Рассчитать вероятность успешного спаривания для первого контакта (P) для различных комбинаций, как показатель успешности спаривания после первого контакта, который проводится немедленно и без какого-либо перерыва. В контактирующей фазе, несколько контактов могут наблюдаться до фактического совокупления.
      1. Когда расстояние между двумя людьми больше, чем длина тела, рассмотрим один контакт, чтобы быть более. Для одной повторности, запись P в качестве 100%, когда совокупление яs наблюдается сразу же после первого контакта, без перерыва, или 0.00%, если не наблюдалось совокупления или если существует совокупление, но после того, как два или более контактов.
         Примечание: Были 30 повторностях для каждой комбинации, описанной здесь.

Results

Вероятность успешного спаривания (R) целинных взрослых была 86,67% в среднем, что значительно выше , чем у случайно выбранных взрослых: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, ДФ = 1, P = 0,0001) (Рисунок 2). Этот факт позволяет предположить , что легче наблюдать за поведением спаривания B. xylophilus с Богородицей взрослых , чем со случайным образом отобранных взрослых.

Когда один мужчина был в...

Discussion

Поведенческие тесты являются одним из основных аспектов химической экологии, нейробиологии, молекулярной биологии и генетики. Нематоды и , в частности С. Элеганс, широко используются для исследований в этих областях. Поведение спаривание С. Элеганс было исследовано ранее ^10-11. Однако Б. xylophilus является gonochoristic и отличается от гермафродитных C. Элеганс, и процесс его спаривание имеет различные поведенческие особенности ^9. В последнее время поведение спа...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus изолят Nxy61			Экстрагировано из Pinus massoniana в районе Нинбо в Китае
		серой плесени	Получен из Лесной академии Китая
Воронки Baermann	Sengong falcon tubes Sengong
	Sengong Sengong
пипетка	Sengong
стерильная dd H2O			Стерилизуется под высоким давлением пара при 121°°; C в течение 30 мин.
Чашки Петри	Sengong
PDA medium	Huankai Bio.	021050
Инкубатор	Sengong
Ламинарный поток	Sengong
Стереоскоп	Leica	LED5000 RL
инвертированный стереомикроскоп	Zeiss	A1
вогнутые слайды	Sengong