Здесь мы представляем протокол нокаутирования интересующего нас гена, участвующего в конъюгации плазмид, и впоследствии анализируем влияние его отсутствия с помощью анализов на спаривание. Функция гена дополнительно исследуется до определенного участка его последовательности с помощью делеции или точечных мутаций.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Перенос генетического материала путем бактериальной конъюгации - это процесс, который происходит с помощью комплексов, образованных специфическими транспортными белками. У Escherichia coli эти транспортные белки составляют механизм переноса ДНК, известный как образование брачных пар или комплекс переноса ДНК, который способствует конъюгативному переносу плазмид. Целью данной статьи является разработка метода, который может быть использован для определения роли специфического транспортного белка, участвующего в конъюгации с использованием серии делеций и/или точечных мутаций в сочетании с анализами спаривания. Ген-мишень нокаутируется на конъюгативной плазмиде и затем вводится в транс с помощью небольшой восстановительной плазмиды, содержащей ген-мишень. Мутации, влияющие на ген-мишень на плазмиде восстановления, могут раскрыть информацию о функциональных аспектах белка-мишени, которые приводят к изменению эффективности спаривания донорских клеток, содержащих мутировавший ген. Изменения в эффективности спаривания дают представление о роли и значении конкретного транспортного белка или его области в облегчении конъюгативного переноса ДНК. Сочетание этого анализа на спаривание с подробными трехмерными структурными исследованиями обеспечит всестороннее понимание функции конъюгативного транспортного белка, а также предоставит средства для идентификации и характеристики областей белок-белкового взаимодействия.
Введение
Перенос генов и белков на микро-организменном уровне играет центральную роль в выживаемости бактерий и эволюции, а также инфекционных процессов. Обмен ДНК между бактериями или между бактерией и клеткой может быть достигнуто с помощью трансформации, конъюгации или вектором трансдукции. 1,2 Сопряжение уникальна по сравнению с трансформацией и трансдукции в том , что при конъюгации между грамотрицательных бактерий , таких как кишечная палочка, перенос ДНК происходит в донорной-контролируемым способом , посредством которого комплекс макромолекулярная система соединяет донора и реципиента клетки. Сопряжение также самый прямой путь, в котором бактериаль....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Получение ДНК-конструктов
- Проектирование олигомеров для гомологичной рекомбинации гена - мишени
- Конструкция одного 55-72 п.н. вперед олигомера следующим образом: (а) получить длинную последовательность нуклеотидов 19-32 п.н., которая является гомологичной последовательности ДНК, в область 10-100 п.н. выше стартового сайта 5'-гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы в коммерческой плазмиды pBAD33, 32 и (б) выбор 36-54 пар оснований нуклеотидов , гомологичную а в области 10-150 пар оснований ниже по течению от сайта инициации 5' - гена - мишени интерес.
- Присоединяйтесь ....
- Конструкция одного 55-72 п.н. вперед олигомера следующим образом: (а) получить длинную последовательность нуклеотидов 19-32 п.н., которая является гомологичной последовательности ДНК, в область 10-100 п.н. выше стартового сайта 5'-гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы в коммерческой плазмиды pBAD33, 32 и (б) выбор 36-54 пар оснований нуклеотидов , гомологичную а в области 10-150 пар оснований ниже по течению от сайта инициации 5' - гена - мишени интерес.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Процесс F плазмиды управляемой бактериальной конъюгации представляет собой скоординированный процесс , который включает в себя белки переноса в тра области F-плазмиды , которая собирает T4SS для облегчения синтеза фимбриевый и конъюгативных перенос ДНК. Белок TRAF (GenBank, # BAA97961; UniProt ID P14497) необходим для формирования конъюгативной F-пилей. 10,14,35 - 37 Белок содержит С-концевой тиоредоксин-подобный домен, хотя он не имеет каталитич.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Бактериальный процесс конъюгации обеспечивает средства, с помощью которых бактерии могут распространяться гены обеспечивая эволюционное преимущество для роста в сложных условиях, таких как распространение маркеров устойчивости к антибиотикам. Поскольку многие из конъюгативных плазмид настолько велики, 12 функциональных исследований по белков , участвующих в сборке передачи аппарата в результате мутации генов - мишеней , на самом конъюгативной плазмиды являются громоздкими. В данном документе подробно описанны.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Discovery Гранта из наук и инженерного совета природного Канады (NSERC).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор для мини-подготовки плазмид GeneJet | Fisher Scientific | K0503 | |
| Набор для экстракции геля GeneJet | Fisher | Scientific K0692 | |
| Набор для очистки ПЦР GeneJet | Fisher | Scientific K0702 | |
| Q5 Набор для сайт-направленного мутагенеза | New England Biolabs | E0554S | |
| Лестница ДНК широкого диапазона Новая | Англия Biolabs | N0303A Чашки | |
| Петри | Электропоратор Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Электропоратор | Eppendorf | 4309000027 | |
| Кюветы для электропорации | Кюветы Fisher Scientific | FB101 | имеют зазор 1 мм. |
| <сильные>ферменты | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 ДНК лигаза | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| <сильно>антибиотики< | >конечные концентрации | ||
| хлорамфеникол (см) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 &микро; г/мл |
| Канамицин (Км) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 &микро; г/мл |
| Налидиксовая кислота (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 &m; г/мл |
| Рифампицин (Риф) | Calbiochem | 557303 | 20 &микро; г/мл |
| тетрациклина (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 &микро; г/мл |
| стрептомицина (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50; г/мл |
Ссылки
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
