Методическая статья

Одноклеточный экспрессии генов с помощью Multiplex RT-КПЦР к характеризации гетерогенности редких популяций лимфоидных

DOI:

10.3791/54858

⸱

19 января 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 2Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как оценить экспрессию большого массива генов на клоновых уровне. Одноклеточный RT-КПЦР производит весьма надежные результаты с сильной чувствительностью для сотен образцов и генов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспрессия генов гетерогенность является интересной особенностью для изучения лимфоидных популяций. экспрессии генов в этих клетках изменяется в процессе активации клеток, стресса или раздражения. Выражение мультиплекс ген Одноклеточный позволяет одновременно оценку десятков генов 1, 2, 3. На уровне одноклеточных, мультиплекс экспрессия генов определяет население гетерогенность 4, 5. Это позволяет проводить различия неоднородности населения путем определения как вероятное сочетание различных стадий предшественников среди зрелых клеток, а также разнообразие ответов клетки на раздражители.

Врожденные лимфоидных клеток (ILC) были недавно описаны как совокупность врожденных эффекторы иммунного ответа 6, 7. В этом протоколе клетка гетерогенность ILC онpatic отсек исследуется в течение гомеостаза.

В настоящее время наиболее широко используемый метод для оценки экспрессии гена RT-КПЦР. Это выражение гена измеряет метод только один ген, в то время. Кроме того, этот метод не может оценить гетерогенность экспрессии генов, так как множественные клетки необходимы для одного теста. Это приводит к измерению средней экспрессии генов популяции. При оценке большого количества генов, RT-КПЦР становится по времени, reagent-, и образец затрат метод. Следовательно, компромиссы ограничить число генов или клеточных популяций, которые могут быть оценены, увеличивая риск упустить глобальную картину.

Эта рукопись описывает, как одноклеточные мультиплексной ОТ-КПЦР может быть использован для преодоления этих ограничений. Этот метод извлек выгоду из недавней микрофлюидики технологических достижений 1, 2. Реакции, происходящие в мультиплекс RT-КПЦР чипы не отлEed на nanoliter уровне. Следовательно, экспрессия генов одноклеточных, а также одновременное выражение множественный ген, может быть выполнена в reagent-, ственном образце, и экономически эффективным образом. Можно протестировать ген клеток подписи гетерогенность на клонального уровне между клеточными подмножествах в популяции на разных стадиях развития или в разных условиях , 4, 5. не Работая на редких популяций с большим числом условий на уровне одной клетки больше не является ограничением.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние несколько лет, врожденные лимфоидные клетки (КМО), так как все больше и больше исследованы. Несмотря на отсутствие антиген-специфических рецепторов, они принадлежат к лимфоидного и представляют собой важные сторожей для гомеостаза тканей и воспаления. КМО в настоящее время разделены на три группы в зависимости от их экспрессии специфических комбинаций факторов транскрипции и на их способности продуцировать цитокины , 6, 7.

КМО способствуют многочисленные гомеостаза и патофизиологических ситуаций в различных органах через конкретного производства цитокина 8, 9. Для того, чтобы быть в состоянии понять роль этих клеток, важно, чтобы определить различные ILC субпопуляции за орган и определить их отношения в области развития. Кроме того, явления пластичности между различными подмножествами были связаны между собой. Изучая гетерогенностьиз клеток, присутствующих в одном органе, можно разграничить стадии их созревания и различать их специфические функции.

Чтобы проиллюстрировать технику одноклеточного мультиплексной ОТ-кПЦР, печеночные КМО были выбраны, с особым акцентом на их неоднородности в пределах одной группы ILC (тип 1 ILC) 10. Во-первых, за счет использования проточной цитометрии, три различных ILC популяции характеризуются в печени. Группа 1 МКТ представляет около 80% врожденных эффекторов, в то время как две другие группы населения являются редкими печеночные ILC популяции (менее 5% от всех врожденных эффекторов). Эти группы населения были отсортированный с использованием широко экспрессируется клетками поверхностных маркеров ILC популяций. В результате, отсортированный ILC популяции в печени широко смотреть похожи одна на другую.

Одноклеточный мультиплекс RT-КПЦР стала одним из лучших методов , чтобы оперативно расследовать разнородность этих групп населения 11 . Две основные характеристики определяются воспользовавшись одноклеточного мультиплекс техники RT-КПЦР. Во-первых, глядя на клонального уровне, то можно восстановить экспрессию генов клеточного специфичные для сравнения между клетками, которые, по-видимому выглядеть примерно стадии развития. Затем, посмотрев на заранее выбранной комбинации экспрессии генов, мы будем определять новые сигнатуры генов на основе одновременных паттернов экспрессии генов в один момент времени. Эти аспекты позволить сбор широкого спектра данных выражение для большого количества клеток, даже в редких популяций, так как этот метод выполняется на клонального уровне. Таким образом, МКТ гетерогенность в печени может быть адекватно оценена.

Далее, путем перебора всех клеток с глобальной ILC фенотипа, широкий обзор экспрессии нескольких генов печени ILC популяций получается, несмотря на то, что они представляют собой крайне редкие популяции. Чип Микрожидкостных на основе позволяет экспериментировать даже снебольшое количество клеточного материала. Как следствие, могут быть получены профили экспрессии генов в популяциях редких клеток. С помощью онлайн программного обеспечения для анализа генов подписи, кластеры клеточной популяции и потенциальные отношения клеток могут быть исследованы. Следовательно, функциональные тесты могут быть выполнены для проверки данных кластеризации на уровне в естественных условиях.

Десятки экспрессии генов могут быть оценены одновременно на сотни или более отдельных клеток на том же чипе 3, 11, 12. Дизайн анализа является самой длинной и самой важной частью эксперимента. Определение генов, имеющих отношение к проверяемой гипотезы имеет первостепенное значение для получения соответствующих результатов. Во-вторых, необходимы внутреннего контроля (например, известных поверхностных маркеров, используемых для сортировки) и конкретные меры контроля. Это очень важно, чтобы проверить праймера амплификации специфичность, эффективность амплификации, а Тон отсутствие конкуренции праймера. Таким образом, работа с одноклеточной мультиплексной ОТ-кПЦР является экономия времени методика, как и выражение нескольких генов клетки оценивается в то же время.

Используя тот же чип и смесь реагентов для всех ячеек ограничивает возможные ошибки манипуляций и позволяет воспроизводимости между образцами. В целом, различные аспекты одноклеточного мультиплексной ОТ-кПЦР позволяет производить высоконадежных результатов на клонального уровне, с большим уровнем чувствительности для широкого спектра образцов и генов. Полученные результаты предлагают мощные и надежные данные для биостатистических испытаний.

Это может быть достигнуто за счет микрожидком аспекте способа, который позволяет для работы на очень малых количеств материала и приводит к исчерпывающих результатов. И, наконец, с помощью онлайн программного обеспечения, можно сравнить желательные популяции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом Института Пастера вопросам безопасности в соответствии с французским министерством сельского хозяйства и руководства ЕС.

1. Подготовить 96-луночного одноклеточные Сортировка плиты

  1. Подготовка предварительной амплификации смеси в 1,5 мл пробирку добавлением 5,0 мкл соответствующего буфера ретро-транскрипции, 1,3 мкл низкой этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) TE буфера (10 мМ раствора ТЕ, рН 8, и раствора 0,1 мМ ЭДТА; 0,2 мкМ фильтровали ), и 0,2 мкл Taq - ДНК - полимеразы на лунку (рисунок 1а).
  2. На 96-луночного планшета, распределить 6,5 мкл предварительно амплификации смеси в каждую лунку (до 48 скважин). Эта пластина является сортировкой пластина одноклеточного 96-луночного.
    Примечание: Использование электронной пипетки рекомендуется для этого протокола. Это позволяет точные и воспроизводимые измерения объема и экономит время.

figure-protocol-1
(А) На 96-луночного одноклеточных сортировочного пластину, смесь предварительной амплификации распределяется во- первых, с последующим 0.2x анализа смеси. (Б) отчет о каждой позиции одноклеточного должны храниться в электронной таблице. Хорошо без сотового называется "нет ввода" хорошо и могут быть использованы в качестве контроля. Два ряда могут быть избавлены для контроля эффективности праймера с кДНК разбавления (последовательные разведений один из десяти из эквивалента 10 5 клеток на одну ячейку). (С) на планшете для анализа 96-луночный, реагент для анализа нагрузка распределяется во- первых, с последующим добавлением праймеров. Не забудьте сохранить макет каждого праймера позиции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. а>

  1. Приготовьте 0.2x анализа смеси в 1,5 мл пробирку, добавляя 1,4 мкл каждого праймера (праймеры 20x, до 48 различных зондов, таблица 1). Отрегулируйте конечный объем до 140 мкл с низким буфера ЭДТА TE.
  2. Распределить 2,5 мкл 0.2x анализа смеси до 48 лунок в 96-луночного сортировочного пластины одноклеточных, содержащей смесь предварительной амплификации.
    Примечание: Конечный объем в каждую лунку для образца 96-луночного планшета должно быть 9 мкл.
  3. Уплотнение пластины с крышкой пленки. Vortex пластины и вращать его вниз при 280 мкг в течение 45 сек. Хранить 96-луночных сортировки пластины одноклеточного при -20 ° С или использовать его немедленно.

2. Single Cell диссоциация

  1. Используя систему доставки CO 2, эвтаназии мышь гипоксией. Закрепите мышь на рассечение пластине и откройте брюшную полость в продольном направлении с помощью ножниц.
  2. Восстановление КМО из печени.
    1. До выделения печени, промойте Livэр-циркулирующих клеток.
      1. Для того, чтобы вывести воротной вены, переместите маленький и толстый кишечник на левой стороне мыши; воротной вены появляется как самый большой вены в брюшную полость.
      2. С 10 мл шприца и 0,45 мм иглой, промывать печень с фосфатным буфером солевой среде (PBS) через воротную вену. Для облегчения гиперемию печени, перерезал желудка артерии с помощью ножниц.
      3. Для удаления желчного пузыря, зажать базу желчного пузыря с пинцетом и отделить его от печени с помощью ножниц.
      4. Чтобы изолировать печень, зажать основание печени с пинцета, и с помощью ножниц, отделить печень от остальной части брюшной полости.
      5. Перенести печень в гончарном пробирку с 5 мл среды института Roswell Park Memorial (RPMI) 2% телячьей эмбриональной сыворотки (FCS).
  3. Диссоциируют печени с механической диссоциации с помощью пестика. Переносят среду в 15 мл пробирку. Доводя общий объемдо 14 мл с помощью RPMI 2% FCS. Оставьте клеточной суспензии на льду в течение 15-20 мин, чтобы переливать гепатоцитов.
  4. Извлечения супернатанта (без гепатоцитов) в новой 15 мл пробирку с использованием 1 мл пипетки (можно ожидать, 12 мл надосадочной жидкости). Спин вниз при 120 мкг в течение 7 мин при 10 ° С. Жидкость над осадком сливают после центрифугирования.
  5. Ресуспендируют осадок , полученный на стадии 2.4 , в 14 мл градиента средней плотности (например, Перколла 40%). Спин вниз при 600 х г в течение 20 мин при температуре 20 ° С. Удалить супернатант аспирацией.
  6. Ресуспендируют осадок в 1 мл ацетата калия (ACK). Оставить при комнатной температуре в течение 1 мин. Через 1 мин, довести общий объем до 14 мл с помощью сбалансированной Соленым раствор Хенкса (HBSS) 2% FCS. Спин вниз при 120 мкг в течение 7 мин при 10 ° С. Удалите супернатант.
  7. Пятно клетки.
    1. Ресуспендируют осадок в 300 мкл биотинилированного смеси антител (см Материалы таблицу, добавить все биотинилированные антитела упоминаютред) и перенести клетки в 1,5 мл пробирку. Оставьте его в темноте в течение 20 мин при 4 ° С.
    2. Довести общий объем до 1 мл HBSS, 2% FCS. Спин вниз при 120 мкг в течение 7 мин при 10 ° С. Ресуспендируют осадок в 300 мкл флуорохромом в сочетании смеси антител и флуорохрома-конъюгированного стрептавидина (см Материалы таблицу, добавить все Флуорохром-связанных антител упоминается). Оставьте его в темноте в течение 20 мин при 4 ° С.
  8. Довести общий объем до 1 мл HBSS, 2% FCS. Спин вниз при 120 мкг в течение 7 мин при 10 ° С. Удалить супернатант, используя 1 мл пипетки. Ресуспендируют осадок в 1 мл HBSS и пропидиума йодида (Pi; 1: 4000).
    Примечание: При использовании широко экспрессируется ILC маркеров клеточной поверхности, 3 группы населения определяются: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + и NKp46 - IL-7Rα +. Все популяции сортируются родословие - CD3 - CD4 - CD45.2 +.

3. Одноклеточный флуоресценция активированных сортировки клеток (FACS)

  1. Используйте FACS для сортировки отдельных клеток 13.
    Примечание: Различные типы клеток могут быть отсортированы по той же 96-луночный планшет сортировочного одноклеточного (рисунок 2).
    1. С помощью FACS для сортировки одну ячейку в каждую лунку, содержащую смесь 0.2x анализа и предварительной амплификации смесь на 96-луночного планшета сортировочного одноклеточного. Используйте свежеприготовленный 96-луночного сортировки пластины одноклеточного или разморозить ее при хранении при температуре -20 ° C.
      1. Поместите запечатанную 96-луночный планшет на держателе FACS пластины. Используйте пустую тарелку 96-а в качестве теста. Поместите пластину с А1-а слева и к экспериментатору.
      2. Установите держатель пластин, чтобы получить падение в центре А1-луночных с верификацией бусинок.
      3. Повторите шаг 3.1.1.2 со всеми скважинами в линии A.
      4. Удалите уплотнение из 96-луночного планшета и сортировать 100 бусин проверки на лунку. Проверьте гформирование ROP в центре лунки.
      5. При правильной настройке, поместите одноклеточного сортировки 96-луночный планшет на держателе. Нарисуйте расположение плиты и сортировки 1 клетка на лунку.
        Примечание: правильное расположение каждой клетки на пластине сортируют 96-луночного одноклеточного имеет важное значение. Компоновка плиты должны храниться на программном обеспечении с электронными таблицами. Компоновка пластина будет использоваться в течение следующих нескольких этапов (рис 1b) 14. Оставьте одну лунку, содержащую 0.2x анализа смеси и предварительной амплификации смеси на образце 96-луночного планшета без клеток. Это хорошо используется в качестве контроля не входами. Оставьте два ряда 6 лунок для кДНК разведения. Эти скважины используются в качестве контроля для эффективности праймера (Рис 1b).
      6. Хранить 96-луночных сортировки пластины одноклеточного при -20 ° С или использовать его немедленно.

4. Предварительное усиление

  1. Используйте свежую или талой 96-луночного сортировки одноклеточного пластины ОБТained на этапе 3.1.1.6. Vortex пластины и вращать его вниз (280 мкг в течение 45 секунд).
  2. Поместите одноклеточного сортировки 96-луночного планшета на амплификатора. Выполнение обратной транскрипции и предварительного усиления в соответствии с указанной программы на рисунке 3 и в таблице 2.

figure-protocol-2
Рисунок 3: Программа предварительной амплификации. Для того чтобы иметь достаточное количество материала, предварительной амплификации специфических генов-мишеней, отсортированных одиночных клеток требуется. Сортировочный пластина одноклеточного 96-луночного загружается на амплификатор следовать программе предварительной амплификации. Продукты предварительной амплификации затем разбавляют с низким ЭДТА буфера ТЕ, и может быть использован сразу же или в замороженном состоянии при -20 ° С. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Развести предварительный усилительlified образцы путем добавления 36 мкл буфера низкого ЭДТА TE в каждую лунку.
  2. Уплотнение пластины с крышкой пленки. Vortex пластины и вращать его вниз (280 г в течение 45 секунд). Хранить предварительно усиливается, 96-луночный сортировки пластины одноклеточного при -20 ° С или использовать его немедленно.

5. Подготовить 96-луночного Sample Plate

  1. Подготовьте 191 мкл основной смеси путем добавления 175 мкл КПЦР мастер смеси и 17,5 мкл реагента загрузки образца.
  2. На новой 96-луночного планшета, распределить 3,6 мкл основной смеси в каждую лунку (до 48 лунок). Это 96-луночного образец пластины.
  3. Передача 2,9 мкл предварительно амплифицированный кДНК из образца 96-луночного планшета в новый 96-луночный планшет. Держите ту же позицию для каждого образца между 96-одной пластине сортировки клеток и образца 96-луночного планшета.
  4. Уплотнение пластины с крышкой пленки. Vortex пластины и вращать его вниз (280 мкг в течение 45 секунд). Поместите новый 96-луночный планшет на льду защищенном от света месте. Хранить 96-луночных Sдостаточно пластины при температуре -20 ° C или использовать его немедленно.

6. Подготовить 96-луночный планшет для анализа

  1. На новой 96-луночного планшета, распределить 3 мкл реагента для анализа загрузки в каждую лунку (до 48 лунок). Эта пластинка называется 96-луночный аналитический планшет.
  2. Добавить 3 мкл праймеров в каждую лунку. Хранить макет на программное обеспечение электронной таблицы (рис 1c и в таблице 1, используют все праймеры , перечисленные в таблице 1). Правильное позиционирование каждого праймера на планшете для анализа 96-луночного имеет важное значение для нескольких следующих шагов.
    1. Если число образцов ниже 48, добавить воду вместо праймеров для неиспользуемых скважин.
  3. Уплотнение пластины с крышкой пленки. Vortex пластины и вращать его вниз (280 мкг в течение 45 секунд). Хранить 96-луночный планшет для анализа при -20 ° C или использовать его немедленно.
    Примечание: Для того, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания праймеров, распределяют праймеры для смеси предварительной амплификации и для 96-вэйл планшету в то же время.

7. Одноклеточный экспрессии генов Chip

  1. Поместите интегрированный микрожидкостных контур (МФК) на стенде и проверить клапаны с помощью шприца колпачком. Откройте шприц, поместите его перпендикулярно к клапану, и плотно прижмите. Уплотнительное кольцо должно двигаться. Наполните чип с контрольной линии жидкости (0,3 мл туберкулина).
  2. Повторите шаг 7.1 со вторым клапаном.
    Примечание: Ни одна жидкость не должна быть пролита над чипом.
  3. Удалите синюю пленку с нижней части чипа. Загрузите чип в контроллер IFC. На экране контроллера МФК, выберите "Prime", а затем "Выполнить". Контроль Микрожидкостных линий длится 10 мин.
  4. Извлеките чип и повторно запечатать синюю пленку на нижней стороне чипа.

figure-protocol-3
Рисунок 4: Одноклеточный мультиплекс экспрессии генов чип загрузки. Эти шаги требуют грасно точность, особенно во время передачи 96-луночного планшета к одноклеточным экспрессии генов чип мультиплекса. Чтобы избежать ошибок при загрузке и misplacements, настоятельно рекомендуется работать последовательно. Объем взятый для каждой передачи должна контролироваться во время процесса пипетирования. И, наконец, важно, чтобы избежать каких-либо пузырьков и удалить их в случае образования. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. С помощью пипетки 8-канальный, передача 5 мкл из 96-луночного планшета для анализа на стороне A1 (левая сторона) микросхемы. Заполните левую сторону чипа, как показано на рисунке 4. Будьте осторожны, чтобы всегда сделать один и тот же объем на кончиках.
    1. Не создавать пузыри. Если появляются пузырьки, удалите их с помощью 10 мкл советов. Изменить подсказки для каждой лунки чипа.
  2. Повторите шаг 7.5 на правой стороне Oе чип с использованием 5 мкл образца из 96-луночного планшета.
  3. Удалите синюю пленку с нижней части чипа. Загрузите чип в контроллер IFC. На экране контроллера МФК, выберите "RUN SCRIPT", а затем "RUN". Загрузка Микрожидкостных линий длится 45 мин.
  4. Извлеките чип и повторно запечатать синюю пленку на нижней стороне чипа.

8. Запустите Чип

  1. На микрожидком КПЦР компьютере, выберите программу "Сбор данных". Как только он начинает, выберите пункт "New Run".
  2. Выберите "выталкивания" удалить синий пленку из нижней части чипа, и загрузить чип. Поместите чип, чтобы получить A1 и налево и к экспериментатору.
  3. На "Настройки проекта" выберите "Нет", а затем "Далее".
  4. Выберите "New чипу", "Новый каталог чипа" (создать папку для эксперимента) и "Next".
  5. На "экспрессии генов" выберите "; Пассивная ссылка = ROX "(карбокси-х-родамин) и" Единый зонд; "выберите правильный фильтр в соответствии с праймерами Выберите." Далее ".
  6. Выберите "Обзор" и выбрать правильную программу в соответствии с праймеров.
    Примечание: "Default-10мин-Hotstart.pcl" является наиболее часто используется программа для одноклеточных мультиплекса RT-КПЦР.
  7. Выберите "Пуск Выполнить". Реакция занимает примерно 90 мин.
  8. После завершения, выберите "Eject-Готово».

Анализ данных 9.

  1. Откройте "ПЦР в реальном времени анализ" программное обеспечение, выберите "Файл" и "Открыть", найдите папку эксперимента, и выберите "ChipRun.bml файл."
  2. Нажмите на кнопку "Анализ" View "таблицы результатов" и "Heat Map View"; поля, отмеченные знаком "Х" находятся ниже уровня обнаружения порога и / или имели плохие кривые усиления.
  3. Назовите образцы. Перейдите к пункту "Sample Setup" и СельЭСТ "Новая SBS 96." Нажмите на кнопку "Mapping" и выберите "..." Скопируйте и вставьте образец макета дизайна из программного обеспечения с электронными таблицами. Определить вставленное макет как «образец имени."
  4. Назовите анализы. Повторите шаг 9.3 с праймером именами в "Настройка детектора." Определить вставленное расположение, как "детектор имени."
  5. Нажмите на "точки зрения анализа" и "Analyze"; имена образцов и праймера будут автоматически приписаны к образцам и праймеров (рисунок 7).
  6. Вычислить Ct, Ct Delta и Fold изменения для каждого образца. Использование гена домашнего хозяйства в качестве внутреннего контроля (здесь, GAPDH):
    & Delta ; CТ = Ct образец - внутренний контроль Ct
    Сложите Изменить = 2 - (управление ΔCtsample-ΔCtnegative)
    1. Нажмите на кнопку "Detector Setup" и выберите скважину без контроля ввода (использовать ген домашнего хозяйства в качестве внутреннего контроля для нормализации экспрессии генов). Выберите "EДитор "," определить ссылку "и" Обновить ".
    2. Выберите все ячейки, к которым будет применяться определенная выше внутреннего контроля. Выберите "Редактор" и "определяют как Test." Выберите соответствующий эталонный ген и нажмите кнопку "Обновить".
    3. Выберите "Sample Setup" для выбора отрицательного контроля. Выберите "Редактор" и определить "Reference". Нажмите кнопку "Обновить".
    4. Выберите "Анализ View" и "Анализ"; Дельта Ct и Fold Изменение будет автоматически рассчитываться.
  7. Экспорт данных. Выберите "Файл" и "Экспорт, сохранить как" таблицы результатов "выберите папку назначения и нажмите кнопку" Сохранить "и" Выход ".
  8. Повторите шаг 9.7, но вместо "таблицы результатов" Сохранить как "HeatMap результатов."

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лимфоидные популяции отображать большое разнообразие в экспрессии генов. В этом протоколе, печени МКТ отделение гетерогенность исследовали с использованием экспрессии гена RT-КПЦР одноклеточного мультиплекс. В отличие от других методов экспрессии генов, экспрессия гена RT-КПЦР одноклеточного мультиплекс позволяет работать на нескольких популяциях, даже редчайший, в то же время. Эта специфика, в сочетании с высокой чувствительностью на клоновых уровне, позволяет исследовать различия в ген...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как получить исчерпывающую информацию экспрессии генов на уровне клонального. Здесь мы исследовали печени ILC отделения гетерогенность. После сортировки одноклеточного различных ILC популяций (на основе широко экспрессируется ILC поверхностных маркеров), образцы были предварительно усиливается для конкретных предварительно выбранных генов. Затем полученную кДНК и праймеры были загружены на мультиплексной RT-КПЦР микрожидком чипа. И, наконец, мы получили выражение 48 различных генов из 48 отдельн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot и Ministère de la Recherche (в S.C.); Association pour la Recherche sur le Cancer (в S.C. и R.G.); REVIVE Future Investment Program и Agence Nationale de Recherche (ANR; грант ''Twothyme'' для A.C.); грант ANR ''Myeloten'' (Р.Г.); и Institut National du Cancer (Роль иммунного микроокружения в канцерогенезе печени, по R.G.). Выражаем признательность платформе Центра иммунологии человека и цитометрии Института Пастера за поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для количественной ОТ-ПЦР Cells Direct One Step AppliedBiosystems 11753100Комплект для обнаружения праймерного щупа. Содержит 2x реакционную смесь, фермент SSIII Platinium.
Low TE EDTA BufferAffymetrix75793 100ML
96-луночные планшетыThermofisher ScientificAB 110096-луночные планшеты, адаптированные для сортировки клеток и термоциклирования
Защитная пленкаDominique Dutscher106570алюминиевая защитная пленка; предотвращение загрязнения и испарения
ActbThermofisher ScientificMm00607939_s120x грунтовка
AesThermofisher ScientificMm01148854_s120x праймер
AhrThermofisher ScientificMm00478932_s120x праймер
Bcl2Thermofisher ScientificMm00477631_s120x праймер
c-mycThermofisher ScientificMm00487804_s120x праймер
CbfbThermofisher ScientificMm01251026_s120x праймер
Cd27Thermofisher ScientificMm01185212_s120x праймер
Cd49aThermofisher ScientificMm01306375_s120x праймер
CD49bThermofisher ScientificMm00434371_s120x праймер
Cxcr5Thermofisher ScientificMm00432086_s120x праймер
Cxcr6Thermofisher ScientificMm02620517_s120x праймер
EomesThermofisher ScientificMm01351985_s120x праймер
Ets1Thermofisher ScientificMm01175819_s120x праймер
Foxo1Thermofisher ScientificMm00490672_s120x праймер
GapdhThermofisher ScientificMm03302249_s120x праймер
Gata3Thermofisher ScientificMm00484683_s120x грунтовка
Gm-csfThermofisher ScientificMm01136644_s120x грунтовка
Hes1Thermofisher ScientificMm01342805_s120x грунтовка
HprtThermofisher ScientificMm00446968_s120x грунтовка
Id2Thermofisher ScientificMm01293217_s120x грунтовка
Il-12rb2Thermofisher ScientificMm00711781_s120x грунтовка
Ил-18r1Thermofisher ScientificMm00515178_s120x грунтовка
Il-1rl1Thermofisher ScientificMm00434237_s120x грунтовка
Ил-22Thermofisher ScientificMm001226722_s120x грунтовка
Ил-23рThermofisher ScientificMm00519943_s120x грунтовка
Ил-2раThermofisher ScientificMm01340213_s120x грунтовка
Ил-2rbThermofisher ScientificMm01195267_s120x грунтовка
IL-7rThermofisher ScientificMm00434295_s120x грунтовка
Klr5Thermofisher ScientificMm04207528_s120x грунтовка
Lef1Thermofisher ScientificMm00550265_s120x грунтовка
Ncr1Thermofisher ScientificMm01337324_s120x грунтовка
Nfil3Thermofisher ScientificMm01339838_s120x грунтовка
Notch1Thermofisher ScientificMm00435249_s120x грунтовка
Notch2Thermofisher ScientificMm00803069_s120x грунтовка
RoraThermofisher ScientificMm01173766_s120x грунтовка
RorcThermofisher ScientificMm01261022_s120x грунтовка
Runx3Thermofisher ScientificMm00490666_s120x грунтовка
Tbx21Thermofisher ScientificMm01299453_s120x грунтовка
Tcf3Thermofisher ScientificMm01175588_s120x грунтовка
Tcf7Thermofisher ScientificMm00493445_s120x грунтовка
Tle1Thermofisher ScientificMm00495643_s120x грунтовка
Tle3Thermofisher ScientificMm00437097_s120x грунтовка
Tsc22d3Thermofisher ScientificMm01306210_s120x грунтовка
Tnfrsf11aThermofisher ScientificMm00437132_s120x грунтовка
ToxThermofisher ScientificMm00455231_s120x праймер
Zbtb16Thermofisher ScientificMm01176868_s120x праймер
Zbtb7bThermofisher ScientificMm00784709_s120x праймер
qPCR Master mix Applied BioSystemsP/N 4304437
2x Загрузочный реагент для анализаFluidigmP/N 85000736Анализы удельной плотности среды для загрузки в мультиплексном микрофлюидном чипе RT-qPCR.
2x Реагент для загрузки образцовFluidigmP/N 85000735Среда удельной плотности для загрузки образцов в микрофлюидный чип RT-qPCR.
48.48 Мультиплекс RT qPCR микрофлюидный чипFluidigmBMK-M-48.4848.48 Динамическая матрица IFC для экспрессии генов; чип для мультиплексной реакции RT-qPCR
48.48 mutliplex RT qPCR микрофлюидный чип контроллерFluidigm8900002048.48 IFC Controller; управление чипом внутренней флюидной системы, загрузка проб и анализов в реакционные камеры
mutliplex RT qPCR микрофлюидный термоциклерFluidigmGE48.4848.48 Dynamic Array IFC термоамплификатор
96-луночных планшетовThermofisher ScientificAB 110096-луночные планшеты, приспособленные для сортировки клеток и термоциклирования
C57Bl/6 мышейJanvierC57Bl/6 miceJ@RJ
шприц 10 млBD Biosciences309639
PBSLife Technologies14040174
HBSSLife Technologies24020133
RPMILife Technologies61870044
FCSCVFSVF000UEurobio AbcysСтандартная фетальная сыворотка для телят
Поттер ТубаН/Д
15 мл ТубаCorning352097
1,5 млСигма-ОлдричT9661-1000EA
Машина FACSН/Д
центрифуга Thermofisher Scientific75004538
1,000 &микро; l советыFisher Scientific10313272
P1000 ГилсонF123602
ПерколлДоминик Датчер17-0891-01
Facs tubeFalcon352235
антитела к биотину к CD8 Антитела к мышамSony1103520линейные антитела
против CD19 Антитела к биотинуSony1177520антитела
линии против TCRab Антитела к биотинуBioLegend109204линия антител
против TCRgd Биотин мышиное антителоBD Biosciences553176линия антител
против Ter119 Антитело к биотинуBD Biosciences553672линейное антитело
против Gr1 Антитело к биотинуBD Biosciences553125линейное антитело
против CD45.2 PerCPCy5.5 антитело мышиBioLegend109828
анти-IL7ra PeCy7 мышиное антителоebioSciences25-1271-82
анти-CD3 BV510 мышиное антителоBD Biosciences563024
анти-CD4 BV786 мышиное антителоBD Biosciences563727
анти-NKp46 PE мышиное антителоebioSciences12-3351-82
стрептавидинSony2626025
Пропидий йодидSigma-AldrichP4864-10ML
Электронная пипеткаEppendorf4986000017
Combitips 0,1 млEppendorf30089405
многоканальная пипеткаRaininL8-10XLS+
AccudropBD Biosciences345249проверочные бусины для FACS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
  2. Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  3. Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
  4. Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
  5. Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
  6. Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
  7. Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
  8. Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
  9. Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
  10. Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
  11. Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
  12. Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
  13. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
  14. Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
  15. Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
  16. Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Single cell Gene ExpressionMultiplex RT qPCRRare Lymphoid PopulationsInnate Lymphoid CellsHepatic ILC CompartmentFluorescence activated Cell SortingMicrofluidic qPCR ChipPre amplification MixGene Expression HeterogeneityReal time PCR Analysis

Похожие статьи