$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
EMSAs используются для анализа взаимодействия между ДНК и белками, используя нативный электрофорезом на геле полиакриламида (СТР) , чтобы разрешить смесь интересующего белка и меченой ДНК зонда , содержащего потенциальные целевые участки белка 1. ДНК-зонд связан с белком будет мигрировать медленнее по сравнению со свободным ДНК-зондом, и, следовательно, задерживается в его миграции через матрицу полиакриламида. Радиоактивной ДНК 32 Р является основным методом для обнаружения в EMSAs. Хотя применение радиомечения в биохимических исследованиях было выгодным, методы альтернативной маркировки ДНК с сопоставимой чувствительностью в настоящее время используются в связи с риском для здоровья и безопасности, связанных с обработкой радиоактивностью. Эти альтернативные методы включают конъюгацию ДНК с биотином 2 или дигоксигенином (DIG) 3 (оба из которых затем детектируется системами хемилюминесцентные), SYBR зеленый окрашивание ДСН 4,или прямое обнаружение ДНК-флуоресцентного красителя конъюгатов путем сканирования геля 5,6.
Разрешенные гели EMSAs с использованием радиоактивно меченых зондов ДНК требуют postrun обработки через авторадиографии пленок или систему Phosphorimager для обнаружения радиоактивных сигналов 1,7. Гели EMSAs с использованием биотин - 2 или DIG-конъюгированные зондов 3 ДНК также должны быть обработаны и переданы на подходящую мембрану , а затем детектируется хемилюминесценции 6. SYBR зеленого окрашивания геля требует postrun геля окрашивания и флуоресцентный сканер 4. Поскольку этапы обработки postrun гель необходимы для EMSAs с помощью этих методов мечении ДНК, разрешенное гель можно анализировать только один раз. В отличие от этого, ДНК-зондов, меченных флуорофоров могут быть непосредственно обнаружены в геле внутри стеклянных пластин с помощью сканера. Таким образом, ДНК-белковых взаимодействий можно контролировать и несколько раз в различные моменты времени оценивали во время бега, котораязначительно сокращает затраты времени и средств. ДНК-флуоресцентный краситель конъюгаты , которые были использованы для EMSAs включают Су3 6,8, Су5 6,8, флуоресцеин 9 и инфракрасные флуоресцентные красители 4-6.
Регуляция транскрипции требует белок-ДНК взаимодействия факторов транскрипции и их генов-мишеней. Координация этих взаимодействий порождает различные типы клеток от общего предка во время развития животных. Объективный вперед генетический экран был выявлен миссенс мутации, G73E, в высоко законсервированной HMG ДНК-связывающим доменом Caenorhabditis фактора транскрипции Элеганс SOX-2. Мутация в трансформации идентичности клеток из AWB обонятельных нейронов в текущем AWC обонятельных нейронов на молекулярном, морфологических и функциональных уровнях 5,10. SOX-2 дифференцированно регулирует терминальную дифференцировку AWB и AWC нейронов путем взаимодействия с контекстно-зависимых факторов транскрипции партнер и соответствующийДНК - мишени сайты 5,10. SOX-2 партнеров с LIM-4 (LHX) в терминале AWB дифференцировки нейронов, в то время как SOX-2 партнеров с ЦВЗ-36 (OTX / ОДТ) в терминале AWC дифференцировки нейронов. Люциферазы анализы показывают , что SOX-2 и мутантные SOX-2 G73E белки имеют кооперативные взаимодействия с транскрипционных кофакторов LIM-4 и ЦВЗ-36 , чтобы активировать промотор , выраженный в AWB и AWC нейронов. Тем не менее, SOx-2 и мутант НОСКОВ-2 G73E отображаются свойства дифференциальной активацию промотора. Для изучения молекулярной основы дифференциальной ДНК - связывающим деятельности SOX-2 и SOX-2 G73E, fEMSAs были выполнены с этими белками и их потенциальных сайтов - мишеней.
Во-первых, биоинформатики подход был использован для идентификации биологически активные к ДНК последовательности в пределах области промотора 1 кб, используемого в анализе люциферазы. Поскольку несколько потенциальных SOX-2 сайты связывания присутствовали на протяжении промотора, мы сфокусировалина предсказанных SOX-2 связывающих участков, прилегающих к предполагаемому ЦВЗ-36 или LIM-4 сайты связывания и эволюционно консервативными между различными видами нематод. Эти последовательности были удалены или мутируют, и затем испытывали в естественных условиях для их деятельности , чтобы выразить GFP репортер трансгенов в AWB или AWC нейронов. Благодаря такому подходу, мы определили потенциальные LIM-4 / SOX-2 и Чех-36-2 SOX соседние целевые сайты /, которые конкретно необходимы для экспрессии GFP в AWB и AWC нейронов, соответственно 5. Мы исследовали потенциальные различия в ДНК связывания SOX-2 и SOX-2 G73E использованием FEMSA с выявленными LIM-4 / SOX-2 и ЦВЗ-36 / SOX-2 смежных целевых сайтов. Наш анализ показал , что EMSA SOX-2 G73E не связывает ДНК - зонд , содержащий LIM-4 / SOX-2 смежных целевых сайтов (необходим для экспрессии генов в AWB) столь же эффективно , как WT SOX-2 сделал. Тем не менее, SOX-2 и SOX-2 G73E не было никакой разницы в связывании ДНК - зонд , содержащий ЦВЗ-36 / SOX-2 аdjacent целевой сайт (необходим для экспрессии генов в AWC) 5,10. Наш FEMSA анализ обеспечивают механистической понимание природы G73E мутации SOX-2 в воздействии специфической ДНК - связывающей активности для идентичности клеточного фенотипа трансформации AWB-к-AWC. Здесь мы опишем оптимизированный протокол FEMSA с использованием очищенных 6xHis-SOX-2 или 6xHis-SOX-2 G73E вместе с ИК - флуоресцентных зондов ДНК красителя-меченый , содержащих LIM-4 / SOX-2 смежных целевых сайтов в качестве тематического исследования для решения важный биологический вопрос.