Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Антираковая Эффективность фотодинамической терапии рака легких с таргетингом наночастицами

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54865

⸱

1 декабря 2016 г.

 ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Фотодинамическая терапия (ФДТ) является альтернативным выбором для лечения рака легких. Для повышения терапевтического эффекта ФДТ были разработаны наночастицы, нацеленные на рак легкого, в сочетании с химиотерапией. Оценивалась противоопухолевая эффективность ФДТ с полученными наночастицами как in vitro, так и in vivo.

Аннотация

Фотодинамическая терапия (ФДТ) - это неинвазивный и нехирургический метод, представляющий собой привлекательную альтернативу для лечения рака легких. Фотосенсибилизаторы избирательно накапливаются в опухолевой ткани и приводят к гибели опухолевых клеток в присутствии кислорода и соответствующей длины волны света.

Чтобы увеличить терапевтический эффект ФДТ, мы разработали наночастицы рака легких, нацеленные как на фотосенсибилизатор, так и на противоопухолевый агент. Применялись как пассивное нацеливание, основанное на эффекте повышенной проницаемости и удержания (ЭПР), так и активное нацеливание, основанное на взаимодействии гиалуроновой кислоты и CD44. CD44 является хорошо известным рецептором гиалуроновой кислоты, который часто вводится в качестве биомаркера немелкоклеточного рака легких.

Кроме того, в настоящем исследовании используется комбинация ФДТ и химиотерапии. Эта концепция комбинации может усилить противоопухолевый терапевтический эффект и уменьшить побочные реакции.

В этом исследовании мы выбрали гипокреллин B (HB) в качестве нового фотосенсибилизатора. Сообщалось, что ГВ вызывает более высокую противоопухолевую эффективность ФДТ по сравнению с производными гематопорфирина1. Паклитаксел был выбран в качестве противоопухолевого препарата, поскольку он оказался потенциальным средством для лечения рака легких2.

Противоопухолевая эффективность раствора фотосенсибилизатора (HB), инкапсулированных фотосенсибилизатором наночастиц гиалуроновой кислоты-церамида (HB-NPs) и инкапсулированных фотосенсибилизатором и противоопухолевым агентом (паклитакселом) наночастиц гиалуроновой кислоты и керамида (HB-P-NPs) после ФДТ сравнивали как in vitro, так и in vivo. Оценивали фототоксичность in vitro в клетках A549 (аденокарцинома легкого человека) и противоопухолевую эффективность in vivo у мышей с опухолями A549.

Группа лечения HB-P-NP показала наиболее эффективный противоопухолевый эффект после ФДТ. В заключение следует отметить, что HB-P-NP, полученные в настоящем исследовании, представляют собой потенциальную и новую систему доставки фотосенсибилизаторов в лечении рака легких с помощью ФДТ.

Введение

Фотодинамическая терапия (ФДТ) состоит из трех основных факторов: фотосенсибилизаторов, света и кислорода. ФДТ считается перспективным методом лечения различных видов рака3. Когда фотосенсибилизаторы вводятся онкологическому больному, они избирательно накапливаются в опухолевых тканях. При правильной длине волны света высокореактивный синглетный кислород и другие свободные радикалы приводят к повреждению опухолевых клеток4.

Рак легких был представлен как одно из первых применений для ФДТ в начале 1980-х годов5. ФДТ дает ряд преимуществ в лечении рака легких. Поскольку ФДТ является неинвазивным и нехирургическим методом лечения, она является привлекательной альтернативой для пациентов, которым хирургическая резекция нецелесообразна.

Было много проблем, связанных с повышением эффективности фотосенсибилизаторов в борьбе с раком. Увеличение накопления фотосенсибилизатора в раковых локализациях и уменьшение накопления в нормальных тканях являются идентичными целями исследований, нацеленных на рак. В качестве носителей фотосенсибилизаторов используются различные системы адресной доставки лекарств, такие как полимеры, липосомы и наночастицы6-8. В наших предыдущих исследованиях наночастицы эффективно увеличивали способность фотосенсибилизаторов к борьбе с раком9,10. Наночастицы являются идеальными носителями рака, поскольку они обладают как пассивными, так и активными способностями к нацеливанию. Негерметичные опухолевые сосуды дают возможность наноразмерным носителям легко накапливаться в опухолях, что хорошо известно как эффект повышенной проницаемости и удержания (ЭПР)11,12. Взаимодействие между наночастицами и специфическими рецепторами на раковых клетках обеспечивает активное нацеливание на рак. В этом исследовании мы подготовили наночастицы на основе гиалуроновой кислоты для взаимодействия с CD44, основным рецептором гиалуроновой кислоты, который сверхэкспрессируется на клетках рака легких13.

Чтобы максимизировать противораковую эффективность, в настоящем исследовании используется комбинация ФДТ и химиотерапии. Эта комбинированная концепция может обеспечить повышенный терапевтический эффект. Кроме того, снижение доз как фотосенсибилизатора, так и противоопухолевого препарата может уменьшить побочные эффекты. В настоящем исследовании мы выбрали гипокреллин B (HB) в качестве нового фотосенсибилизатора. HB выделен из китайского лекарственного гриба Hypocrella bambuase. Shang et al. сообщили, что ФДТ на основе HB обладает более высокой противоопухолевой эффективностью по сравнению с ФДТ1 на основе производных гематопорфирина. Паклитаксел был выбран в качестве противоопухолевого препарата, поскольку он оказался потенциальным средством для лечения различных видов рака, включая рак легких2.

Здесь мы сравнили противоопухолевую эффективность раствора фотосенсибилизатора (гипокреллин B, HB), инкапсулированных фотосенсибилизатором наночастиц гиалуроновой кислоты-керамида (HB-NPs) и инкапсулированных фотосенсибилизатором и противоопухолевым агентом (паклитакселом) наночастиц гиалуроновой кислоты-керамида (HB-P-NP) после ФДТ. Оценивали фототоксичность in vitro в клетках A549 (аденокарцинома легкого человека) и противоопухолевую эффективность in vivo у мышей с опухолями A549.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Все протоколы исследования на животных были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Сеульского национального университета Бунданг больницы (BA1308-134 / 072-01) путем.

1. Синтез Гиалуроновая кислота-церамид (HACE)

  1. Солюбилизации 12,21 ммоль гиалуроновой кислоты (HA) олигомера и 9,77 ммоль тетра- н гидроксида -butylammonium (ТБА) в 60 мл бидистиллированной воды (DDW). Смесь перемешивают в течение 30 мин.
  2. Для синтеза DS-Y30 линкер, растворите 8,59 ммоль DS-Y30 керамиды и 9.45 ммоль триэтиламина в 25 мл тетрагидрофурана (ТГФ). Смешать с 8,59 ммоль хлорида 4-chloromethylbenzoyl в ТГФ. Смесь перемешивают в течение 6 ч при 60 ° С.
  3. Растворите синтезированного 8,10 ммоль-ТВА и 0,41 ммоль DS-Y30 компоновщика в смеси ТГФ и ацетонитрила (4: 1, об / об). Перемешивают в течение 5 часов при 40 ° С.
  4. Удаление примесей путем фильтрации с агентом фильтра, и устранить органический растворитель испарением в вакууме. Очищают продукт с применением диализной мембраны (молекулярная масса отсечки: 3,5 кДа) и лиофильной сушке.

2. Подготовка Наночастицы

  1. Растворите 1 мг НВ и 1 мг паклитаксела в 0,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и смешивают с 0,5 мл DDW вихрем смешивания в течение 5 мин. Затем, солюбилизации HACE в этой смеси с помощью вихревого перемешивания в течение еще 5 мин.
  2. Для устранения растворителя при нагревании при 70 ° С в течение 4 ч при слабом токе газообразного азота.
  3. Ресуспендируют пленки, состоящей из HACE, HB и паклитаксел с 1 мл DDW. Фильтр с шприцевой фильтр (размер пор 0,45 мкм), чтобы удалить неинкапсулированной наркотики.

3. In Vitro фототоксичности

  1. Усвоение наночастиц в линиях клеток рака легких
    1. Подготовка среды RPMI-1640, содержащих 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки и 1% (вес / об) пенициллин-стрептомицина.
    2. Семенной клеток А549 в 24-луночные планшеты для культивирования клеток при плотности 1 × 10 5 клеток / лунку (трехкратном повторе для каждогогруппа). Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2 воздуха и 95%.
    3. После прикрепления клеток, удаления среды и промыть клетки путем добавления 1 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
    4. Растворите наночастиц в PBS до конечной концентрации 2 мкМ / мл НВ. Затем, инкубировать клетки с 1 мл PBS, пустых NPs, HB-NPs или HB-P-NPs в каждую лунку в течение 4 часов в темноте.
    5. Удалить весь раствор и промыть клетки путем добавления 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз. Добавить свежую культуральную среду.
  2. Жизнеспособность клеток для анализа
    1. Поместите культуральный планшет под волокном PDT (с 1 см расстояния от волокна до PDT скважины). Носите лазерные защитные очки и освещают клетки с помощью лазера PDT (630 нм, 400 мВт / см 2) в темноте в течение различных периодов времени: 0, 5, 10, 20, 30 и 40 сек (0, 2, 4 , 8, 12, и 16 Дж / см 2). Затем, инкубировать клетки в течение 24 ч в темноте.
    2. Аспирируйте средних и мыть клетки, добавляя 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз.
    3. Добавьте 10 мкл цитотоксичность мерного раствора в каждую лунку. Инкубируют в темноте в течение 2 часов.
    4. Измеряют поглощение при 450 нм с использованием микропланшет-ридера.
  3. Микроскопический анализ
    1. Поместите культуральный планшет под волокном PDT (с 1 см расстояния от волокна до PDT скважины). Носите лазерные защитные очки и освещают клетки с помощью лазера PDT (630 нм, 400 мВт / см 2) в темноте при 0, 20 или 40 сек (0, 8, или 16 Дж / см 2). Затем, инкубировать клетки в течение 24 ч в темноте.
    2. Аспирируйте средних и мыть клетки, добавляя 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз.
    3. Добавляют 50 мкл аннексина V-FITC и 50 мкл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 1,5 мкг / мл). Слегка встряхните планшет и инкубируйте его в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
      Примечание: Используйте аннексина V-FIТС из комплекта флуоресцентного микроскопа.
    4. Промывают клетки путем добавления 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз. Держите клетки в свежей PBS. Определение апоптоза клеток с помощью световой микроскопии при 100-кратном увеличении.
  4. сортировка флуоресценция активированных клеток (FACS) анализ
    1. Поместите культуральный планшет под волокном PDT (с 1 см расстояния от волокна до PDT скважины). Носите лазерные защитные очки и освещают клетки с помощью лазера PDT (630 нм, 400 мВт / см 2) при 0, 20 или 40 сек (0, 8, или 16 Дж / см 2). Затем, инкубировать клетки в течение 24 ч в темноте.
    2. Аспирируйте средних и мыть клетки, добавляя 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз.
    3. Ресуспендируют клеток в 1 мл 1 × буфера для связывания (развести 1 часть 10 - кратного буфера для связывания, 0,1 М HEPES / NaOH (рН 7,4), 1,4 М NaCl и 25 мМ CaCl 2 до 9 частей дистиллированной воды) и передачи в количестве 100 мкл раствора образца до 5-млкультура трубки.
    4. Добавьте 5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл пропидийиодидом (PI). Аккуратно вихревой трубки и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) в темноте. Добавить 400 мкл 1 × буфера для связывания.
      Примечание: Используйте аннексина V-FITC и PI из комплекта флуоресцентного микроскопа.
    5. Определение апоптотических клеток с помощью FACS 14. Лазерные возбуждения линии ПИ и аннексина V-FITC являются 488 нм и 635 нм соответственно. Измерение флуоресценции PI и аннексина V-FITC при 610 ± 20 нм и 660 ± 20 нм, соответственно. Собрать полученные клетки на цитометр потока на 10000 событий.

4. В естественных условиях противораковый эффективность в опухоли мышей

  1. Рак легких индуцированных модель мыши
    1. Готовят 1 × 10 6 клеток A549 в 0,1 мл среды RPMI-1640; держать его на льду.
    2. Обезболить мышей с IP-инъекции ксилазина и смеси tiletamine и zolazepam (1: 2, 1 мл /кг). Подтвердите надлежащее обезболивание, осторожно щипать небольшой складки кожи мыши. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
      Примечание: Если не наблюдается никакого движения, животное достаточно наркозом, чтобы начать эксперименты.
    3. Вводят клетки подкожно в левый фланги BALB / C мужской голых мышей (6 - 7 недель, 20 - 22 г).
    4. Продолжайте наблюдать мышей, пока они не начинают двигаться по клетке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока он не полностью восстановилась. Держите мышей под конкретного патогена (SPF) условиях.
    5. Измерьте размер опухоли циркулем каждый день. Рассчитать объем опухоли (мм 3), (длина × ширина 2) / 2. Когда размер опухоли достигает приблизительно 200 мм 3 по объему, начать эксперимент.
  2. Исследование эффективности противоопухолевых
    1. Случайным образом разделить мышей на 4 группы (n = 10 в каждой группе).
    2. Обезболить мышей с IP-инъекции ксилазина и смеси tiletamine и zolazepam (1: 2, 1 мл / кг). Подтвердите надлежащее обезболивание, осторожно щипать небольшой складки кожи мыши. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
      Примечание: Если не наблюдается никакого движения, животное достаточно наркозом, чтобы начать эксперименты.
    3. Растворите наночастиц в PBS до конечной концентрации 2 мг / мл НВ. Вводят PBS, свободный HB, HB-NPS или HB-P-NPS через хвостовую вену (2 мг / кг в качестве HB) дважды в дни 0 и 7.
    4. Продолжайте наблюдать мышей, пока они не начинают двигаться по клетке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое не прооперированы в компании других животных до полноговыздоровел. Держите клетки темные и при определенных условиях SPF.
    5. 24 ч после каждой инъекции, анестезию мышей с IP-инъекции ксилазина и смеси tiletamine и zolazepam (1: 2, 1 мл / кг). Подтвердите надлежащее обезболивание, осторожно щипать небольшой складки кожи мыши. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
      Примечание: Если не наблюдается никакого движения, животное достаточно наркозом, чтобы начать эксперименты.
    6. Поместите сайт опухоли под волокна PDT (с 1 см расстояния от волокна до ФДТ опухоли). Носите очки лазерной безопасности, выключите выключатель, и осветить опухоль с помощью лазера PDT (630 нм, 400 мВт / см 2) в течение 500 сек (200 Дж / см 2) дважды в дни 1 и 8.
    7. Продолжайте наблюдать мышей, пока они не начинают двигаться по клетке. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое имеет undergonе хирургии в компании других животных, пока полностью не выздоровел.
    8. Держите клетки в условиях SPF. Поддерживать клетки в темноте в течение 24 ч после лазерной обработки.
    9. Визуально контролировать объем опухоли и изменения в опухоли ежедневно. Измерьте размер опухоли с суппортами, и рассчитать объем , как и (длина × ширина 2) / 2 (мм 3). Сфотографируйте опухолевых сайтов каждый день, чтобы проверить наличие поверхностных опухолей изменений после ФДТ.
    10. На 16-й день, пожертвовать пять мышей в группе терминальными анестезии с использованием изофлуран.
    11. С помощью пинцета и ножниц, вырезать наружную оболочку и подвергать опухоли 15. Осторожно собрать их. Закрепить их в 10% раствор формалина, встраивать их в парафин, и окрашивают их гематоксилином и эозином (H & E) для гистологического анализа 16.
    12. Через 45 дней мониторинга, пожертвуйте оставшихся мышей терминальными анестезии с использованием изофлуран.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы подготовили как HB-NPS и HB-P-NPS с методами, упомянутыми выше. Средние диаметры HB-NPs и HB-P-NPs были 220,9 ± 3,2 нм и 211,9 ± 1,6 нм, соответственно.

Жизнеспособность клеток в клетках А549 после 4 ч инкубации с PBS, пустыми NPs, HB-NPs и HB-P-NPs с последующим облучением светом ( от 0 до 16 Дж / см 2), показан на рисунке 1. Без света группа лечения HB-NP не показали цитотоксичность вообще, в т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Самым важным шагом в данном исследовании, заключается в выборе правильных лазерных условий: длины волны, мощности и времени облучения. Надлежащая длина волны света, подходящей для конкретного фотосенсибилизатора необходимо для ФДТ. Мы использовали 630-нм лазер , который был подходящим для гипокреллин В. Выходная мощность является еще одним важным фактором, который был установлен на уровне 400 мВт / см 2 на основе многих экспериментальных исследований. Выходная мощность превышает 400 мВт / см 2 повр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грант №. 14-2014-017 из Фонда SNUBH Research.

Авторы признательны Дж Патрик Баррон, почетный профессор Токийского медицинского университета и адъюнкт - профессор Сеульского национального университета Бунданг больницы для его про боно редактирование этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
олиго гиалуроновая кислотаBioland Co., Ltd.
(керамид 3B; в основном N-олеоилфитосфингозин)Doosan Biotech Co., Ltd._
дигидразид адипиновой кислотыSigma AldrichA0638
N-(3-диметиламинопропил)-N′ -этилкарбодиимидSigma Aldrich39391
4-(хлорметил)бензоилхлоридSigma Aldrich270784
Tween 80Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0546
шприцевой фильтрSartorius Stedim Biotech GmbH1776215 мм, RC, PP, 0.45 &; m
триэтиламинSigma AldrichT0886
Mini-GeBAflex трубкиGene Bio-Application Ltd.D070-12-100
ПаклитакселТайхуа Корпорейшнз_
RPMI-1640Gibco Life Technologies, Inc.11875
Пенициллин– стрептомицинGibco Life Technologies, Inc.15070
Фетальная бычья сывороткаGibco Life Technologies, Inc.
Celite (Фильтрующий агент)Sigma Aldrich6858См. шаг 1.4
DS-Y30 16140071

Ссылки

  1. Shang, L., Zhou, N., Gu, Y., Liu, F., Zeng, J. Comparative study on killing effect of esophageal cancer cell line between hypocrellin B-photodynamic therapy and hematoporphyrin derivative-photodynamic therapy. Chin J Cancer Prev Treat. 12, 1139-1142 (2005).
  2. Huisman, C., et al. Paclitaxel triggers cell death primarily via caspase-independent routes in the non-small cell lung cancer cell line NCI-H460. Clin Cancer Res. 8 (2), 596-606 (2002).
  3. Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
  4. Pass, H. I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
  5. Sutedja, T. G., Postmus, P. E. Photodynamic therapy in lung cancer. A review . J. Photochem. Photobiol. 36 (2), 199-204 (1996).
  6. Peng, C. L., Shieh, M. J., Tsai, M. H., Chang, C. C., Lai, P. S. Self-assembled star-shaped chlorin-core poly(epsilon-caprolactone)-poly(ethylene glycol) diblock copolymer micelles for dual chemo-photodynamic therapies. Biomaterials. 29 (26), 3599-3608 (2008).
  7. Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T. Liposomal delivery of photosensitising agents. Expert Opin Drug Deliv. 2 (3), 477-487 (2005).
  8. Lee, S. J., et al. Comparative study of photosensitizer loaded and conjugated glycol chitosan nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 152 (1), 21-29 (2011).
  9. Chang, J. E., et al. Anticancer efficacy of photodynamic therapy with hematoporphyrin-modified, doxorubicin-loaded nanoparticles in liver cancer. J. Photochem. Photobiol. 140, 49-56 (2014).
  10. Chang, J. E., Cho, H. J., Yi, E., Kim, D. D., Jheon, S. Hypocrellin B and paclitaxel-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles for targeted photodynamic therapy in lung cancer. J. Photochem. Photobiol. 158, 113-121 (2016).
  11. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle delivery of cancer drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  12. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  13. Penno, M. B., et al. Expression of CD44 in human lung tumors. Cancer Res. 54 (5), 1381-1387 (1994).
  14. Wilkins, R., Kutzner, B., Truong, M., Sanchez-Dardon, J., McLean, J. Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: Flow cytometry using Annexin V and propidium iodide versus the neutral comet assay. Cytometry. 48 (1), 14-19 (2002).
  15. Bannas, P., et al. Validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft NIRF-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy. J Vis Exp. (98), e52462(2015).
  16. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
  17. Lam, S. Photodynamic therapy of lung cancer. Semin Oncol. 21 (6 Suppl 15), 15-19 (1994).
  18. Simone, C. B. 2nd, et al. Photodynamic therapy for the treatment of non-small cell lung cancer. J Thorac Dis. 4 (1), 63-75 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD44BA549in vitroin vivo
Антираковая Эффективность фотодинамической терапии рака легких с таргетингом наночастицами
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.