Методическая статья

Измерение нитритов и нитратов, метаболиты в оксид азота Pathway, в биологических материалах с использованием метода хемилюминесценции

22.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54879

⸱

25 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine Branch, NIDDK, NIH

В этой статье

Краткое содержание

Оксид азота (NO) является важной сигнальной молекулой в сосудистом гомеостазе. Производство NO in vivo слишком низкое для прямого измерения. Хемилюминесценция дает полезную информацию о цикле NO путем измерения его предшественников и продуктов окисления, нитритов и нитратов. Объясняется определение нитритов/нитратов в тканях и жидкостях организма.

Аннотация

Оксид азота (NO), является одним из основных молекул регулятора в сосудистом гомеостазе, а также нейромедиатор. Ферментативно NO окисляется до нитритов и нитратов в результате взаимодействия с различными кислородно-гема белков и других до сих пор не очень хорошо известных путей. Обратный процесс, восстановление нитрита и нитрата в NO были обнаружены у млекопитающих, в последнее десятилетие, и все большее внимание привлекает как один из возможных путей, чтобы предотвратить или облегчить целый ряд сердечно-сосудистых, метаболических и мышечных расстройств, которые, как полагают, быть связано со снижением уровня NO. Поэтому важно, чтобы оценить количество NO и его метаболитов в различных отсеках тела - кровь, жидкости организма и различных тканей. Кровь, из-за его легкой доступности, является предпочтительным отделение используется для оценки NO метаболитов. Из-за короткого времени жизни (несколько миллисекунд) и низкой концентрации к югу от наномолярной, прямых надежных измерений крови NO <EM> в естественных условиях нынешних больших технических трудностей. Таким образом НЕТ Наличие не обычно оценивается на основе количества продуктов его окисления, нитритов и нитратов. Эти два метаболита всегда измеряются отдельно. Есть несколько хорошо известных методов для определения их концентрации в биологических жидкостях и тканях. Здесь мы приводим протокол для метода хемилюминесценции (CL), на основе спектрофотометрического обнаружения NO после нитритов или нитратов сокращения на три-йодида или ванадия (III) хлоридных растворов, соответственно. Чувствительность к нитритов и обнаружения нитратов находится в низком диапазоне наномолярной, который устанавливает CL как наиболее чувствительный метод имеющихся в настоящее время для определения изменений в NO метаболических путей. Мы подробно объяснить, как подготовить образцы из биологических жидкостей и тканей с целью сохранения первоначальных количеств нитрита и нитрата в настоящее время сбора и как определить их соответствующие суммы в образцах. Ограничения метода CL также ехржаловались,.

Введение

Нитриты и менее продлить нитратов, уровни в крови не отражают общее состояние организма NO метаболизм. концентрации нитрита в крови и большинство органов и тканей только в высокой наномолярной или низком диапазоне микромолярном, нитратов обычно присутствует в гораздо больших количествах - в микромолярном диапазоне. Изменения в уровнях нитритов вследствие прогрессирования заболевания или изменения привычек питания достаточно малы и могут быть измерены только с помощью очень чувствительный метод. Из-за их самых разных уровней и различных метаболических процессов, раздельное определение нитритов и нитратов уровней имеет важное значение. Так не называется "NO определения х" , где нитритов и нитратов измеряются вместе имеет очень мало значения.

Было разработано несколько методов количественного определения нитрита в различных биологических образцах - наиболее распространенным является самой старой, основанный на реакции Грисса, которые были первоначально описанной в 1879. Даже с современной modificatioнс, предел чувствительности для нитрита достижимый методом Грисс 'находится в низком диапазоне микромолярном. Хемилюминесценции (ХЛ), в сочетании с три-йодид раствора восстанавливающего, в настоящее время считается наиболее чувствительным методом, что позволяет количественно оценить в низком диапазоне наномолекулярных концентрации нитрита 1-8,10,11. Тот же метод CL, в сочетании с ванадий (III) , хлорид раствора восстанавливающего, могут быть использованы для чувствительных измерений нитратов, с точностью в диапазоне наномолярной 9.

CL обнаруживает свободный газ NO. Поэтому, нитриты, нитраты, R-нитрозотиолы (R-SNO), R-нитрозоамины (R-нно), или соединения металла NO (далее в рукописи упоминается как "R- (X) -NO"), должны быть преобразованы в бесплатно без газа для того, чтобы количественно оценить свои первоначальные суммы через CL. Преобразование в NO достигается с помощью нескольких различных восстанавливающих растворов, в зависимости от характера NO метаболита. После преобразования, свободный газ не удаляется из реакционного сосуда с помощью газа-носителя (He, N2 или Ar) в реакционную камеру анализатора CL , где озон (O 3) в сочетании с NO с образованием диоксида азота (NO 2) в активированном состоянии. С возвращением в основное состояние, NO 2 * излучает в инфракрасной области спектра и излучается фотон регистрируется ФЭУ (ФЭУ) КЛ инструмента. Интенсивность излучаемого света прямо пропорциональна концентрации NO в реакционной камере, что позволяет рассчитывать концентрацию исходных видов, используя соответствующие калибровочные кривые.

В нашем протоколе мы дадим сначала CL на основе определения нитритов и нитратов в наиболее часто используемых клинических условиях - в крови и плазме, а затем мы рассмотрим, как определить эти ионы в образцах ткани. Мы также подробно объяснить, как сохранить первоначальную физиологическую концентрацию нитритов в нитрит-реактивных средах, таких как кровь и его отделений, плазмы и красных кровяных телец.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы, включая использование животных были одобрены для использования NIDDK уходу и использованию животных комитета и человеческая кровь была получена из банка крови NIH от здоровых доноров.

1. Подготовка образцов

  1. Приготовление раствора нитрита с сохранением
    1. Готовят раствор , содержащий 890 мМ феррицианида калия (K 3 Fe (CN) 6) и 118 мМ NEM (N-этилмалеимид) в дистиллированной воде. Растворите хорошо, пока не станет ясно, желтый, без кристаллов присутствующих. Добавить NP-40 (октил phenoxylpolyethoxylethanol) в соотношении 1: 9 (об / об, NP-40 / раствор). Осторожно перемешать, чтобы избежать пенообразования и хранят при температуре 4 ° С в течение недели).
  2. Сбор и подготовка проб крови
    1. Сбор крови с использованием, по меньшей мере, 20 G иглы, чтобы избежать гемолиза с гепарином для предотвращения коагуляции (5 ед / мл). Для получения образца цельной крови, перемешать кровь с нитритом сохранением раствора сразу в соотношении 1: 4 (об/ Об раствора / кровь).
    2. Для получения плазмы и эритроцитов образцов, центрифуга собранную кровь в течение 5 мин при 4000 х г при 4 ° С для отделения красных кровяных клеток (эритроцитов) и плазмы. Возьмем супернатант (плазма) и смешать его с нитритом сохранением раствора, как описано выше, для определения уровня нитритов в плазме.
    3. Осторожно удалить остатки плазмы и поглощающее покрытие из образца и пипетки RBC образца из нижней части трубки, чтобы избежать загрязнения другими типами клеток крови с использованием среза пипетку, и передать его в пробирку, содержащую нитрит сохраняющее раствор в том же самом соотношение, как указано выше.
    4. Смешайте каждого образца (плазмы и эритроцитов) с холодным метанолом в соотношении 1: 1 или 1: 2 (объем / объем пробы / метанол) и центрифугировать их при 13.000 х г при температуре 4 ° С в течение 15 мин для осаждения белков. Возьмите супернатант и использовать его для измерения нитритов или заморозить Приготовленные образцы, если это необходимо, на сухом льду и хранят при -80 ° С.
      Примечание: Нитрит быстро ReaКТС с оксигемоглобина (oxyHb) в формировании нитрата крови. Так как oxyHb всегда присутствует в большом избытке над нитрита, эта реакция приводит к почти полное уничтожение родного нитрита крови с временной рамкой из ~ 10 мин. Для того чтобы сохранить большую часть эндогенного нитрита крови, нитритов, сохраняющих раствор добавляют к цельной крови сразу после взятия крови. Раствор быстро лизировать эритроциты и окисляют oxyHb в метгемоглобин (metHb), неактивную форму гемоглобина, который не вступает в химическую реакцию с нитритом.
  3. Подготовка образцов из других видов жидкости организма
    1. После взятия пробы в соответствующий контейнер, хорошо перемешать с нитритом сохранением раствора, deproteinate и измерить сразу или заморозить и хранить при температуре -80 ° C.
  4. Сбор и подготовка образцов тканей
    1. Собирают ткани от животных увлажненную с гепарином солевым раствором (10 U HEPARin / мл). Акцизной около 1 г желаемой ткани и гомогенизируют либо с помощью ручного гомогенизатора или автоматизированный гомогенизатора.
    2. Добавить известное количество нитрита, сохраняющих решение по мере необходимости для достижения гладкой гомогената.
    3. После того, как ткань гомогенизируют, осадить белки с использованием холодного метанола (1: 1 или 1: 2 соотношение объем / объем образца / метанол), как описано выше, а затем центрифуга образцы при 13.000 х г при температуре 4 ° С в течение 15 мин.
    4. Соберите супернатант и измерения уровней нитритов. При необходимости, заморозить образцы на любой стадии приготовления на сухом льду и хранят при -80 ° С.

2. Подготовка решений Снижение

  1. Tri-йодид (I 3) раствора восстанавливающего для нитритов и R- (X) -NO видов определения 1,3,4
    1. Приготовьте раствор 301 мМ KI вместе с 138 2 мМ раствора I в воде. Смешать с помощью ледяной уксусной кислоты в соотношении 2: 7 (об / об раствора / кислоты) на магнитной мешалке в течение ~ 30 мин, пока всекристаллы растворяются. Предпочтительно иметь в темную бутылку, как йодид чувствителен к свету, и использовать в течение одной недели с момента приготовления.
      Примечание: Это решение позволит сократить нитрита в NO , и он также выпустит NO из R-SNO, R-NNO и Fe-NO функциональных групп (R- (X) -NO), но нитрат не будут затронуты. Сигнал от вышеуказанных NO на основе функциональных групп могут быть отделены от истинного сигнала нитрита путем обработки половины образца с подкисленной сульфаниламида (AS) и сравнив AS-обработанных и необработанных сигналов. А.С. образуют необратимые диазония катион с нитритом и этот комплекс не может быть уменьшена путем I 3 раствора. Для лечения AS, подготовить 290 мМ раствора сульфаниламида в 1 М HCl и добавить его к аликвоте образца в соотношении 1: 9 (v / v AS / образец). Измерьте сигнал CL в AS-обработанных и необработанных участках образца. Вычислить истинный сигнал нитрита как разность AS-обработанных и необработанных части образца. Нитрит может быть также измерена с применением селективной нитобряду снижающих раствор аскорбиновой / смеси уксусной кислоты, как описано в части 2.2. Тем не менее, из-за обычно небольшого количества R- (X) -NO присутствующих видов, измерения с использованием в качестве необработанной пробы в большинстве случаев очень хорошее приближение общего содержания нитрита.
  2. Аскорбиновая кислота уксусная кислота Раствор / (4A) для селективного определения нитрита 2
    1. Приготовьте 500 мМ аскорбиновой кислоты в воде. Смешайте этот раствор с помощью ледяной уксусной кислоты в соотношении 1: 7 (об / об, аскорбиновая кислота / уксусная кислота) с получением реакционной смеси.
      Примечание: Это решение является специфическим для нитрита, не будет выпускать NO из любого R- (X) -NO видов или нитрат. Тем не менее, раствор аскорбиновой и уксусной кислоты должны быть подготовлены свеже каждый день перед измерениями, как аскорбиновая кислота легко окисляется в растворе.
      Завершение нитрита снижения зависит от концентрации аскорбиновой кислоты; и по меньшей мере 50 мМ аскорбиновой кислоты рекомендуется для полного гОбразование плазменного нитрита. Тем не менее, рекомендуется выполнить несколько пробных экспериментов с различными концентрациями аскорбиновой кислоты и стандартов нитрита в ожидаемом диапазоне концентраций нитритов до окончательных выборочных измерений. Имейте в виду, что аскорбиновая кислота слегка истощает во время измерений, рекомендуется так частые изменения реакционной смеси в реакционной камере стекла.
  3. Ванадий (III) , хлорид восстановительный раствор для определения нитратов 9
    1. Готовят 51 мМ раствор VCl 3 в 1 М HCl. Фильтр раствор через фильтр 200 мкм и хранить в темной бутылке, использовать в течение двух недель.
      Примечание: Пониженная нитраты, нитриты и все R- (X) -NO видов, так что, если сравнимые количества нитритов или других R- (X) , -NO виды присутствуют вместе с нитратом, конечное содержание нитратов следует рассчитать как разность между ХЛ сигналами , полученными с VCl 3 и I3 сокращения решений.

3. Хемилюминесценция (CL) Analyzer Настройка и Измерения

  1. Стандартное решение
    1. Готовят 1 мкМ раствор нитрита натрия (NaNO 2). То же самое решение может быть использовано для нитритов и нитратов определений.
  2. НЕ используя анализатор
    Примечание: В настоящее время два коммерчески доступных NO анализаторы , которые являются достаточно чувствительными для биологических целей исследований - Сиверс NOA и Ecophysics CLD 88Y. Они оба работают по тому же принципу; Основное различие заключается в том , что CLD 88Y использует кислород из воздуха в помещении , чтобы сделать озон (O 3), в то время как NOA требуется внешний бак кислорода для этой цели. Приведенная ниже процедура описывает набор вверх для Сиверса НОА.
    1. установка параметров прибора
      1. Выполнение начальной настройки на NO анализатора в соответствии с рекомендациями завода-изготовителякак видно на рисунке 1.
      2. Открыть O 2 бак подключен к прибору. Выберите "анализ" и "войти" в главном меню на передней панели. На следующем экране выберите "Пуск" и нажмите "Enter". Подключите кислоты ловушку (содержащего 1 М NaOH) к прибору , как показано на рисунке 1.
      3. Подождите, пока ФЭУ не остынет до температуры ниже -12 ° С, и реакционную камеру вакуумируют до 6 мм рт. Она занимает около 30 минут, чтобы достичь стабильного плоской базовой линии. Базовая линия должна стабилизироваться в течение 1 - 2 мВ, его номинальное значение имеет меньшее значение, чем его стабильность.
        Примечание: Если нитрат измеряется, включите ванну охлаждающей воды (устанавливается при 4 ° С, которая служит в качестве охлаждаемой ловушки для паров кислоты и воды) и нагрева водяной бане (основной реакционной камере, 95 ° C). Скорость восстановления нитрата в NO в 3 растворе Vcl зависит от температуры, и это очень медленно при комнатной Температура, так что значительное повышение температуры необходимо, чтобы наблюдать за реакцией.
      4. Откройте He бак и подключить стеклянную реакционную камеру к кислотной ловушке , как показано на рисунке 1. Наполните реакционную камеру с соответствующим восстанавливающим раствором, уменьшить прорывается к минимуму и соединить реакционную камеру к кислотной ловушке. С помощью метода проб и ошибок, регулировать скорость кипящий он соответствовал скорости всасывания прибора (обычно ~ 200 мл / мин для NOA Сивер в).
      5. Включите компьютер, контролирующий прибор и запустить программное обеспечение Liquid Labview основе. Для включения связи между прибором и программным обеспечением сбора данных, нажмите "ввод", когда в меню "данных", пока экран не читает "включен выход", а затем нажмите кнопку "Очистить", чтобы вернуться к экрану данных.
      6. Дождитесь стабильной базовой линии следа на экране и начать инъекционным образцы и стандарты нитритов в сокращении раствор через перегородку. Всегда ждать, чтобы достичь стабильного базового кормовой частиэр пик. Это может занять до 2 мин. Liquid программное обеспечение имеет возможность «отметить» времена инъекции и аннотирования инъекции, и она будет экспортировать эти комментарии в отдельный файл (filename.info) в качестве полезного дополнения к файлу данных (filename.data).
      7. После того, как образцы и стандарты измеряются, выберите "стоп" опцию в меню Liquid программного обеспечения - это будет записывать данные из временного файла в постоянный файл, известный как "filename.data". Опция При нажатии кнопки "прервать" прекратит измерение без записи полученных данных в постоянный файл.
      8. Для завершения эксперимента, отсоедините машину от реакционного сосуда, отключив запорный кран на верхней части реакционного сосуда и отсоедините трубку между кислотой ловушку и реакционный сосуд (см рисунок 1). Теперь остановить анализатор NOA - нажмите "Очистить", перейдите в раздел "анализ", поставить машину на "ожидания" и "Confirm" в режиме ожидания. Если используется регулярно, тоПрибор может быть оставлен в режиме ожидания в течение нескольких недель. Выключите подачу кислорода. Затем промойте восстанавливающий раствор из реакционной камеры, отсоединить и закрыть He бак из реакционного сосуда и стеклянный По окончании очистки реакционного сосуда.
    2. Стандарты и образцы инъекции
      1. Вводят 50 мкл 1 мкМ раствора нитрита в реакционной смеси с использованием хорошо промытый Гамильтон шприц. Подождите, по крайней мере, 1 - 2 мин между инъекциями, чтобы достичь хорошего разделения пиков. Повторите инъекции 50 мкл, чтобы получить дубликаты в каждой точке данных. Промыть шприц с деионизированной водой после каждой инъекции.
      2. Для получения полного набора данных для стандартной кривой, по-прежнему с повторяющимися инъекциями 100, 150 мкл (дополнительные 200 мкл могут быть необходимы, если высокие концентрации нитритов или нитратов, как ожидается) 1 мкМ раствора нитрита. В каждом случае, позаботиться, чтобы ждать, пока сигнал не падает обратно к базовой линии, а затем приобрести 1 - 2 милип базовой линии для достижения хорошего разделения пиков.
        Примечание: стандарты Нитриты могут быть измерены в любой момент во время экспериментов. Тем не менее, предпочтительно, чтобы приобрести стандартную кривую перед измерением данных, поскольку она также служит в качестве независимой проверки функциональных возможностей прибора.
        При сборе данных, количество образца впрыскивают должно привести к хорошо выраженных пиков. Однако следует иметь в виду, что фотоэлектронный линейна только до ~ 800 мВ, так что ни один из пика не должна быть выше, чем на ~ 700 мВ. Это может быть достигнуто либо за счет уменьшения количества от вводимой пробы или разбавления пробы деионизированной водой. Каждая точка должна быть измерена по крайней мере в двух экземплярах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты , полученные от стандартов и пяти различных образцов. Как показано на этом рисунке, увеличивается фотоэлектронный умножитель напряжения сразу после того, как нитриты, содержащих раствор (стандарты или пробы) вводят в сокращении раствор (инъекции раз обозначены красными стрелками ниже кривой) и возвращается к базовому значению, как только все нитрит, присутствующих в впрыскивается решение было уменьшено. Также ясно, из это...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола

Аликвоты всех решений (включая воду), используемых для приготовления, разбавленные или иным образом обработать оригинальные образцы должны быть сохранены и проверены на предмет возможного нитрита или (чаще) загрязнение нитратами. Мы обнаружили, что наиболее загрязнение происходит из воды и многих химических веществ, используемых для лечения образца (кровяной), в частности, также содержат значительное количество нитратов загрязнения в некоторых партий, что меш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Д-р Алан Шехтер указан как соавтор на нескольких патентов, выданных Национальным институтом здоровья для использования нитрита солей для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Он получает лицензионные платежи, основанные на NIH лицензирования этих патентов для клинического развития, но никакой другой компенсации.

Благодарности

Авторы хотят признать важный вклад д-ра А. Dejam и М. М. Пеллетье в развитии использования нитрита сохранения раствора для измерения нитритов в крови.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
феррицианид калия; K3Fe(CN)6Sigma702587
NEM; N-этилмалеимидSigma4260
NP-40; 4-нонилфенил-полиэтиленгликольSigma74385
сульфаниламид; АС SigmaS9251
HClSigmaH1758
уксусная кислота, ледянаякислота SigmaA9967
аскорбиновая кислота SigmaA7506
йодид калия; йод KISigma60399
; I2Sigma207772светочувствительный, токсичный
нитрит натрия; NaNO2Sigma563218
ваниумия(III) хлорида; VCl3Sigma208272ligt чувствительный, токсичный
GentleMacMiltenyi
Sievers NOA 280iGE
CLD 88Y  Экофизика 

Ссылки

  1. Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
  2. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
  3. Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).
  4. Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
  5. Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
  6. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
  7. Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
  8. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
  9. Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).
  10. Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
  11. Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи