Здесь мы представляем оптимизированный протокол для нумерации и характеризующих макаки - резус CD8 + Т - клеток против вируса СПИДа. Эта статья полезна не только к области иммунологии ВИЧ, но и в других областях биомедицинских исследований , где ответы CD8 + Т - клеток , как известно, влияют на исход заболевания.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8 + Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I (ПКИКЖ-I) тетрамеры был бесценным инструментом для изучения ответов CD8 + Т-клеток. Поскольку эти реагенты непосредственно связываются с рецепторами Т-клеток на поверхности CD8 + Т-лимфоцитов, Флуорохром-меченых тетрамеров ПКИКЖ-I позволяют точное обнаружение антигена (Ag) -специфический CD8 + Т-клетки без необходимости повторной ин витро -стимуляция. Кроме того, в сочетании с многоцветной проточной цитометрии, ПКИКЖ-я тетрамер окрашивание может выявить ключевые аспекты Ag-специфических CD8 + Т-клеток, в том числе стадии дифференцировки, фенотипом памяти, а также состояние активации. Эти виды анализов были особенно полезны в области иммунологии ВИЧ , где CD8 + Т-клетки могут влиять на развитие СПИДа. Экспериментальное заражение макак-резусов с вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО) является бесценным инструментом для изучения клеточного иммунитета против вируса СПИДа. В результате значительная PROGRESS было сделано в определении и характеризующее Т-клеточного ответа в данной животной модели. Здесь мы представляем оптимизированный протокол для перечисления SIV-специфических CD8 + T-клеток в макак-резусов с помощью окрашивания тетрамера ПКИКЖ-I. Наш анализ позволяет одновременно количественной оценки и памяти Фенотипирование двух популяций ПКИКЖ-I тетрамер + CD8 + T-клеток на тест, что может быть полезно для отслеживания SIV-специфических Т-клеточного ответа CD8 + , сгенерированные с помощью вакцинации или SIV инфекции. Учитывая актуальность приматах в биомедицинских исследованиях, эта методика применима для изучения ответов CD8 + Т-клеток в различных условиях болезни.
Введение
CD8 + Т-клетки содержат важнейший компонент адаптивной иммунной системы , поскольку они участвуют в опухоли иммунного надзора и способствовать искоренению внутриклеточных патогенов 1. Проще говоря, CD8 + Т-клетки экспрессируют рецепторы Т-клеток (TCR) , которые специфически распознают пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I (ПКИКЖ-I) молекулы , присутствующие на плазматической мембране клеток - хозяев. Так как эти пептиды являются производными от протеолиза эндогенно синтезированных белков, клеточной поверхности ПКИКЖ-I комплексы обеспечивают окно в внутриклеточной среде. При вирусной инфекции, например, инфицированные кле....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) образцы, используемые в этой рукописи были получены из индийских макак хранящаяся в Национальном исследовательском центре приматов Висконсин. Эти животные были воспитывающихся в соответствии с отчетом Weatherall согласно протоколу , утвержденному в Университете штата Висконсин Высшая школа уходу и использованию животных комитета 33. Все процедуры на животных были проведены под наркозом, и все усилия были сделаны, чтобы минимизировать потенциальные страдания.
1. Лечение ИПК
Примечание: Это не является обязательным, но рекомендуется для Маму-B * 017: 01 тетрамеров. См результаты
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол , описанный здесь , был использован для определения величины и памяти фенотип поствакцинальный, Gag CM9-специфических ответов CD8 + Т-клеток в Маму-A1 * 001 + макаки - резус. Для этого анализа, БТР-конъюгирован Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 тетрамер был использован в 8-цветной проточной цитометрии окрашивания панели. Фигура 1А - F показана стратегия стробирования используется для анализа данных, которые должны быть применены для об.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несколько шагов в этой процедуре заслуживают обсуждения, поскольку они имеют решающее значение для приносит оптимальные результаты. Во- первых, поскольку качество биологических образцов является сильным прогностическим фактором успеха любого потока цитометрии анализа 38, все необходимо соблюдать осторожность , чтобы гарантировать , что клетки жизнеспособны и в суспензии во время процедуры окрашивания. Это особенно актуально при работе с криоконсервированных образцов, так как они более склонны к слипания и обы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Уоткинса за поддержку экспериментов, которые позволили оптимизировать существующей методологии. В исследовании, опубликованном в данной публикации, была частично поддержана пилотным гранта, предоставленного Майами Центром исследований в области СПИДа Национальных институтов здравоохранения под номером награду P30AI073961. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дазатиниб | Аксон медхим | Аксон 1392 | Должен быть повторно суспендирован в ДМСО и немедленно храниться при температуре -20°С; C |
| RPMI с Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Необходимо хранить при температуре 4 °De; С |
| Инактивированный при нагревании FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Должен храниться при температуре 4 °°; С |
| Пенициллин-стрептомицинг-амфотерицин B | Lonza | 17-745E | Необходимо хранить при температуре 4°°; С |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Хранить при комнатной температуре. |
| Полипропиленовые трубки с круглым дном 5 мл | VWR | 60819-728 | |
| Фторохром-сопряженные тетрамеры pMHC-I | NIH Tetramer Core или MBL, Inc. | Необходимо хранить и обслуживать при температуре 4 °C. Перед использованием центрифугу при температуре 20 000 x g в течение 15 минут. Не замораживайте. | |
| Фторохром-конъюгированные мАТ | различных компаний | должны храниться и обслуживаться при температуре 4 °C. Не замораживайте. | |
| ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ Исправляемая аква Мертв Набор для окрашивания клеток | Life Technologies | l34957 | Необходимо хранить при температуре -20 °C. Повторно суспендируйте каждую аликвоту в 50 °M; ДМСО перед использованием. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Необходимо хранить при 4 градусах; С |
| Фосфатно-солевой буфер | VWR | 97064-158 | Хранить при комнатной температуре |
| Альбумин крупного рогатого скота | VWR | 700011-230 | Необходимо хранить при температуре 4 С |
| Азид натрия | VWR | 97064-646 | Хранить при комнатной температуре. Токсичное вещество. Не смешивайте с отбеливателем. |
| Отбеливатель | VWR | 89501-620 | Коррозионное химическое вещество, нельзя смешивать с азидом натрия. Обращайтесь с осторожностью |
| Параформальдегид | Электронная микроскопия Sciences | 15714-S | Легковоспламеняющийся, коррозионный и токсичный реагент. Ручка с осторожностью |
| Полисорбат 20 (Твин-20) | Alfa Aesar | L15029 | Хранить при комнатной температуре |
| Раствор для пермеабилизации 2 | BD Biosciences | 340973 | Токсичный и коррозионный реагент. Ручка с осторожностью |
| Sarsdet Tubes 1,5 мл с завинчивающейся крышкой | VWR | 72.692.005 | |
| 2,0 мл ДНК/РНК Пробирки с низким связыванием | Eppendorf | 22431048 | Использование стерильных микропробирок предпочтительно |
| Вихревой смеситель | На усмотрение ученого | ||
| Кабинет биобезопасности | На усмотрение ученого | ||
| Milli Q Intergral Water Очистка системы | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology от любого поставщика |
| Микроцентрифуга | На усмотрение ученого | ||
| Центрифуга | На усмотрение ученого | ||
| 4 ° С | холодильник На усмотрение ученого | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Проточный цитометр должен содержать лазеры и фильтры, совместимые с используемой окрашивающей панелью. | |
| Деионизированная вода | |||
| Алюминиевая фольга | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Инкубатор | должен быть в состоянии поддерживать 37 ° С внутренняя температура | ||
| Программное обеспечение FACS Diva | BD Biosciences | ||
| Программное обеспечение Flowjo версии 9.6 | Flowjo | Используется для анализа файлов FCS, генерируемых программным обеспечением FACS | |
| Diva Наконечники |
Ссылки
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
