Методическая статья

Сочетание мокрой и сухой методы Lab в Руководстве по кристаллизации больших биспиральных, содержащих белки

DOI:

10.3791/54886

⸱

6 января 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем структуру, включающую в себя простой биохимический и вычислительный анализ для определения характеристик и кристаллизации больших областей спирали. Эта структура может быть адаптирована для глобулярных белков или расширена для включения в нее различных методов с высокой пропускной способностью.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Получение кристаллов для определения структуры может быть сложной и трудоемкой задачей для любого белка. Спиральные белки и домены встречаются по всей природе, однако из-за их физических свойств и склонности к агрегации они традиционно считаются особенно сложными для кристаллизации. Здесь мы используем множество быстрых и простых методов, предназначенных для определения ряда возможных доменных границ для данного белка со спиральной спиралью, а затем быстро характеризуем поведение этих белков в растворе. С добавлением сильно флуоресцентной метки (mRuby2) определение характеристик белка становится простым и понятным. Целевой белок может быть легко визуализирован при нормальном освещении и может быть количественно определен с помощью соответствующего тепловизора. Цель состоит в том, чтобы быстро определить кандидатов, которые могут быть исключены из конвейера кристаллизации, потому что они вряд ли будут успешными, предоставляя больше времени для лучших кандидатов и меньше средств, затрачиваемых на белки, которые не производят кристаллы. Этот процесс может быть повторяться для включения информации, полученной в результате первоначальных усилий по скринингу, может быть адаптирован для высокопроизводительных процедур экспрессии и очистки, а также дополнен роботизированным скринингом для кристаллизации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оборудование для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии внес фундаментальный вклад в каждой области современной биологии; обеспечивая атомный вид макромолекул, которые поддерживают жизнь и как они взаимодействуют друг с другом в различных контекстах; что позволяет нам понять механизмы, которые вызывают болезни, и предоставляя возможность рационально разработать препараты для лечения болезни. Кристаллографии уже давно доминирующая экспериментальная методика определения макромолекулярной структуры, и в настоящее время составляет 89,3% от структурной базы данных (www.rcsb.org). Этот метод имеет много преимуществ, в том числе потенциал очень высокой разрешающей способности, способность визуализировать макромолекулы с широким диапазоном размеров, относительно легкого сбора данных, а также возможность представить, как макромолекула взаимодействует с растворителем, а в качестве лигандов.

Несмотря на многочисленные технологические улучшения в экспрессии рекомбинантного белка 1,2, PURфикация 3, и молекулярной биологии используются для создания этих систем 4, самым большим препятствием в процессе кристаллографической остается возможность выращивать кристаллы качества дифракции. Это особенно верно для белков, которые содержат большие домены биспиральных. Было подсчитано , что почти 5% всех аминокислот найдены в пределах намотанных катушек 5,6, что делает это очень распространенная структурная особенность 7, но эти белки часто более трудно очистить и кристаллизуются , чем глобулярных белков 8-10 , Это дополнительно усугубляется тем, что биспиральных домены часто встречаются в контексте более крупного белка, поэтому правильно предсказывать границы этих областей имеет решающее значение, чтобы избежать включения неструктурированной или гибкой последовательности, которая часто вредно для кристаллизации.

Здесь мы представляем концептуальную основу объединения веб-вычислительный анализ с experimentaл данные со скамейки, чтобы помочь пользователям через направляющие на начальных этапах кристаллографической процесса, включая: как выбрать фрагмент белка (ов) для структурных исследований, а также как подготовить и охарактеризовать образцы белка до попыток кристаллизации. Мы фокусируем наш анализ на двух белков, содержащих большие домены биспиральных, Shroom (ШРМ) и Rho-киназы (Rock). Эти белки были выбраны , поскольку они оба содержат домены биспиральных и , как известно, образуют биологически активные сложные 11-16. Shroom и Rho-киназы (Rock), по прогнозам, содержат ~ 200 и 680 остатков биспиральных соответственно, многие части которых были охарактеризованы структурно 17-20. Описанный здесь способ обеспечивает рационализировать рабочий процесс, чтобы быстро идентифицировать фрагменты биспиральных, содержащие белок, которые будут пригодны для кристаллизации, тем не менее, способы, описанные могут быть легко адаптированы для большинства белков или белковых комплексов или модифицированы включением высокой пропускной способностью approaчес как доступный. И, наконец, эти методы, как правило, недороги и могут быть выполнены пользователями практически на всех уровнях опыта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Схема концептуальной основы или рабочий процесс описан на рисунке 1 для справки. Протокол может быть разбит на четыре этапа: вычислительные или последовательности предсказаний, основанных, экспрессии белка и очистки, биохимических характеристик и кристаллизации. Примеры, показанные домены анализа Shroom SD2 и / или Shroom-Рок комплексы, но могут быть использованы с любым белком.

1. С помощью установления веб-инструментов для генерации Численные предсказания границ доменов биспиральных

  1. Соберите эволюционно разнообразный набор Последовательности гомологов.
    1. Перейти к www.uniprot.org и введите в Shroom в верхней строке поиска.
    2. Выбор последовательности для загрузки, установив флажок рядом с их номером. Последовательности со звездой показывают последовательности с помощью UniProt рассмотрены и, как правило, более надежны. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что все последовательности являются полными и точными.
    3. Сохранение выбранных Sequences, нажав кнопку Загрузить.
    4. Совместите коллекцию Shroom последовательностей с использованием Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Нажмите на кнопку "Обзор", чтобы выбрать файл с последовательностями Shroom, а затем нажмите кнопку Отправить.
    5. После завершения юстировки, нажмите кнопку "Загрузить файл" Выравнивание.
    6. Откройте выравнивание множественный последовательность, генерируемая в 1.1.5 с помощью Jalview (Файл | Input Alignment | Из файла). В новом окне выравнивания, цвет по идентичности (Цвет | процент идентичности).
  2. Подсчитайте предсказания вторичной структуры, предсказания гибкой или неупорядоченной последовательности, и предсказаны областей биспиральных в белка (белков), представляющих интерес.
    1. Перейти к http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj, для расчета прогнозов биспиральных. Скопируйте и вставьте последовательность в последовательность Box и нажмите кнопку Отправить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данный анализ может занять несколько часов, чтобы компLete. Так как Shroom последовательности достаточно велики, последовательности, возможно, должны быть разделены на блоки менее чем 1000 аминокислот, чтобы соответствовать размеру ограничения на веб-сервере. При анализе Shrm2, рекомендуется, что С-концевые аминокислоты 1000 используются в качестве В этом разделе содержит домен SHRM SD2, который, как известно, содержат области биспиральных. При повторении этого анализа с другими белками, рекомендуется использовать белковые последовательности полной длины, когда это возможно. Если это не вариант, использовать самый большой фрагмент можно или рассекать последовательность, основанную на известных биохимических или функциональных данных.
    2. Перейти к http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj, для расчета прогнозов биспиральных. Скопируйте и вставьте последовательность в последовательность Box и нажмите кнопку Отправить.
  3. Объединить результаты шагов 1.1 до версии 1.2.2 в единый всеобъемлющий аннотирования последовательности Shroom.
    Примечание: Настоятельно рекомендуется также включать в себя любые и все соответствующие Iнформация, что можно почерпнуть из литературы или других источников о функции белка или очистки на этой стадии.
  4. Используя эту всеобъемлющую аннотированный последовательность, предсказать границы домена (или ряд возможных границ) для белка, пытаясь максимизировать сохранение и предсказал структурные особенности при минимизации количества неупорядоченных или гибкой последовательности. Если известно, в результате чего белок должен сохранить функциональные свойства, представляющие интерес.

2. Экспресс и очисти Белки с границами домена намеченными в разделе 1

Примечание: Целью данного раздела является использование серии быстрых и легко поддающихся количественной оценке анализов для выявления границ гипотетические доменов, сгенерированные в разделе 1.

  1. Используя стандартные методы молекулярной биологии, генерируют плазмиду экспрессии с требуемой кодирующей последовательностью в кадре внутри Его 10 -mRuby2-ХН2 плазмиды (смотри рисунок 3 для векторного отображения ай дополнительные детали).
  2. Уровни экспрессии испытаний для каждой плазмиды экспрессии с использованием BL21 (DE3) E.coli или другого подходящего штамма экспрессии в autoinduction сред 1 при комнатной температуре в течение 18-24 ч.
    1. Transform плазмид экспрессии, а также пустой контроль плазмиды в BL21 (DE3), следуя инструкциям, которые пришли с клетками или с использованием надежного протокола преобразования, например, один здесь (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial~~HEAD=pobj -преобразованием /).
    2. Из свеже преобразованного пластины, выбрать одну колонию и вырастить закваски 5 мл при 37 ° С в течение ночи в лизогении бульоне (LB) средств массовой информации с 34 мкг / мл канамицина.
    3. На следующий день, гранулы культуры и мыть осадок со свежей LB.
    4. Добавьте закваску в 50 мл autoinduction среды с 34 мкг / мл канамицина. Дайте культуре расти до насыщения при любой комнатной температуре или 37 ° С. Как правило, растут в течение ~ 18-24 ч.
    5. Пелле клетокs и замораживать в результате гранулы клеток при -80 ° С до бесконечности до очистки.
    6. Сравните целые экстракты клеток из каждого штамма экспрессии и пустого векторного управления с помощью SDS-PAGE для определения штамма, который наиболее эффективно продуцирует желаемый слитый белок. Для его 10 -mRuby2-Shroom SD2 слитых белков, запустить 10% SDS-PAGE гели при 180 В в течение ~ 50 мин или пока фронт красителя достигает нижней части геля 22.
    7. Пятно гель с Кумасси синим , чтобы визуализировать суммарные клеточные белки , в пределах каждого штамма 23.
  3. Выполните начальную стадию аффинной хроматографии на каждого штамма, который успешно экспрессированы mRuby2-слитого белка. Как правило, выполняют очистку шаги 2.3.2-2.3.7 при комнатной температуре, если белок не будет извлечь выгоду из изменившихся условий, таких как очистка при 4 ° С.
    1. Оттепель гранулы клеток из стадии 2.2.5.
    2. Ресуспендируют каждый осадок клеток в 1,5 мл буфера для лизиса (10% глицерина, 500 мМ NaCl, 40мМ имидазола, 20 мМ Трис рН 8,0, 1 мМ бета-меркаптоэтанола). Дополнение лизиса буфер с ингибиторами протеазы в зависимости от обстоятельств.
    3. Добавить 30 мкл 10 мг / мл лизоцима и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Разрушать ультразвуком, следуя инструкциям для инструмента используются.
    4. Перенести в 1,5 мл пробирку и центрифугируют в настольную центрифугу в течение 30 мин при 14000 х г в гранулах нерастворимого материала или unlysed клетки. Сохранить как супернатанта и осадка для последующего анализа с помощью SDS-PAGE.
    5. Выполните очистку никеля сродства, инкубирование растворимую фракцию со 100 мкл Ni-NTA бусинок. Инкубируйте бусины с растворимой лизата в течение 5-10 мин, переворачивая несколько раз, чтобы смешать шарики.
    6. Центрифуга при 800 мкг в течение 30 секунд в настольной центрифуге для осаждения шариков. Следуйте этим путем промывки Осадок 3-5 раз буфером для лизиса для очистки от неспецифических примесей.
    7. Элюировать рубин слитый белок из гранул с буфером для лизиса с добавлением 1M имидазола.
    8. С помощью SDS-PAGE, чтобы сравнить поведение Его-mRuby2-Shroom белков в "быстрой и грязной" очистки выше.

3. Охарактеризуйте белка Образец для выявления тех, с преимущественными свойствами

  1. С помощью набора спектрофотометре при длине волны 280 нм для определения концентрации белка слияния рубинового, а затем оценить однородность образца путем загрузки 1-5 мкг слитого белка на нативного PAGE гель 24. Выполнить гель на 10% нативный PAGE при 4 ° С в течение 140 мин при 175 В.
    1. Изображение родной СТР с помощью тепловизора оборудованный для визуализации флуоресценции, наблюдая, где mRuby-меченый слитый мигрирует в этом анализе.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы наблюдать за слитый белок, который застрял в скважине, как этот белок, вероятно, агрегируются. Если флуоресцентный тепловизор не доступен, часто можно визуализировать и изображения сосредоточены образцы Руби меченый белок под черным светом или с коробкой ультрафиолетового света.
  2. Выполните ограниченный протеолиз, чтобы идентифицировать стабильно сложенных домены. Выдержите 95 мкл Рубин-ШРМ SD2 плавления при ~ 1 мг / мл с 5 мкл 0,025% субтилизина А.
    1. Пример реакции при временных точках 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, и 120 мин, удаление 10 мкл из реакционной смеси для каждой временной точки и визуализации хода реакции с помощью SDS-PAGE с использованием акриламидный гель 15% ,
    2. Пятно с Кумасси синим, как на этапе 2.2.7 и оценить, могут ли быть идентифицированы протеаза видов устойчивые.
  3. Интеграция данных из эффективности очистки, поведения в родной страницы, а также ограниченного протеолиза на частично очищенных слитых белков mRuby2-Shroom в комплексную оценку общего поведения этих белков в растворе.
    1. (Необязательно) Если подходящий функциональный анализ доступен, проверки активности в этой точке.

4. выпускать продукцию высокого качества кристаллов биспиральных SD2Домен от Shroom

Примечание: Все шаги в разделе 4.1 выполняются при комнатной температуре, если белок не выиграют от очистки при различной температуре, обычно от 4 ° C.

  1. Используя 50 мл наросты в качестве грубой оценки экспрессии и очистки потенциала, выполнять крупномасштабные выражения mRuby2-Shroom SD2 с целью достижения 5-20 мг полностью очищенного образца. Как правило 2 л культуры обеспечивает адекватный исходный материал. После гранул роста клеток центрифугированием при 8000 х г в течение 10 мин.
    1. Ресуспендируют осадок от роста 2 л в буфере для лизиса, как и раньше, с помощью файлов ~ 2 мл лизис на грамм замороженного осадка клеток при использовании лизоцима для лизиса. В качестве альтернативы, ресуспендируют в ~ 8 мл / г окатышей, если с помощью гомогенизатора или французская пресса. Гранул клеточного дебриса путем центрифугирования при 30000 х г в течение 30 мин.
    2. Пакетный связать растворимой фракции от изложенных в разделах 4.1.1, используя 10 мл Ni-NTA смолы. Разлить в соответствующую колонку тяжестии позволяют несвязанные белки стечь.
    3. Промыть смолу 3-5 раз с 40 мл буфера для лизиса, с последующей промывкой буфером для лизиса, дополненной до 1 М NaCl.
    4. Промыть смолу с 40 мл буфера для лизиса, дополненного 80 мМ имидазола.
    5. Элюции слитого белка рубин-Shroom с 40 мл буфера для лизиса, дополненных до 1 М имидазолом. Вручную фракционирования элюированного белка в 4-10 мл фракции.
    6. Confirm фракции, содержащие рубин-Shroom слитого белка с использованием 10% SDS-PAGE.
    7. Диализировать соответствующие фракции (обычно 2-4 фракций) в 8% глицерина, 250 мМ NaCl, 15 мМ имидазола, 20 мМ Трис рН 8,0, 1 мМ β-ME, используя 6-8 кДа MWCO диализной трубки. Добавляют 1 мг TEV протеазы для каждого 25-50 мг слитого белка. Диализировать в течение ночи при комнатной температуре при медленном перемешивании.
    8. Очистка Повторите никелевого сродства шаги 4.1.2. в разделе 4.1.6. Домен Shroom СД2 должен теперь оставаться в несвязанной фракции в то время как его 10 -mRuby2 будет оставаться связанным ссмолу и будет найден в элюированных фракций. Повторите это с помощью 12% SDS-PAGE окрашивания кумасси синим.
    9. Диализировать фракций, содержащих домен Shroom SD2 в 8% глицерина, 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0, 5 мМ бета-меркаптоэтанола буфера в течение ночи.
    10. Выполнение обменной хроматографии 25 аниона с использованием FPLC и элюируя градиентом NaCl от 0,1-1,0 М NaCl. Анализ фракций с помощью 12% SDS-PAGE.
    11. Используя спиновый концентраторы (MWCO 10 кДа или более в зависимости от белка исследуемой), концентрат Пиковые фракции до ~ 0 мг / мл, а затем выполнить вытеснительной хроматографии 26, анализируя пиковые фракции с помощью 12% SDS-PAGE.
    12. Бассейн пиковые фракции и диализ в 20 мМ Трис рН 8,0, 50 мМ NaCl, 2% глицерина, 1 мМ β-ME и концентрируют до 10 мг / мл перед кристаллизацией.
      Дополнительно: Во время этого этапа удаления 5 мкл образцов при концентрации 1, 2, 5, и 10 мг / мл в течение концентрирования пробы.Запуск родной загрузки страницы 2-5 мкл каждого образца, чтобы посмотреть на поведение образца во время этого шага.
  2. Экран небольшой массив из 12 условий, чтобы определить оптимальную концентрацию белка для кристаллизации испытаний. Состав этих условий описана на рисунке 7.
    1. Использование 24-луночного сидя падение кристаллизации подносы, выполняют кристаллизации испытаний с использованием метода диффузии в паровой фазе, пипетирования 500 мкл каждого из 12 условий в отдельные лунки с последующим каплями, которые изначально содержат по 1 мкл скважины раствора и 1 мкл образца белка на покровных стеклах , Пожалуйста , см 27 для получения дополнительной информации по этой методике.
    2. Быстро запечатать поднос с лентой и ясном переместить лоток в контролируемой среде подходящей температуры, свободной вибрации. Температура, используемая может варьироваться, но 4 ° С, 16 ° С, и 20 ° C весьма распространены.
    3. Осмотрите капли в лотках в течение следующих 3 днейAYS с помощью микроскопа со скоростью до 100х. В конце 3-дневный срок, оценка каждую каплю, как не содержащий осадков (сброс), небольшие осадки, сильные осадки (коричневый), или кристаллы. Подходящая концентрация белка должна содержать не более 6 тяжелых осадков.
    4. Использование концентрации белка идентифицированного в разделе 4.2, экран широкий диапазон коммерчески доступных экранов кристаллизации. Использование жидкой обработки или кристаллизации робота значительно ускоряет этот процесс, в то же время сводя к минимуму ошибки в каплях. Это требует гораздо меньшего количества белка, а также, что позволяет пользователю экран больше условий с помощью одного образца.
    5. Улучшение исходных условий, определенных с широких экранов путем систематического изменения каждой из переменных внутри капли кристаллизации с использованием 24-луночного скрининге лотков, как и раньше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диаграмма , изображающая рабочего процесса , используемого в данной системе показана на фиг.1 , и включает в себя три основных этапа. Компьютерный анализ последовательности используется для разработки гипотезы о границах домена белка биспиральных интереса. Примером аннотированный анализа домена Shrm2 SD2 показан на рисунке 2. На этой диаграмме, цель состояла в том, чтобы определить возможные границы домена для консервативном домене на С-конце регулятора ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь, предназначен, чтобы помочь пользователю определить границы доменов в пределах больших белков биспиральных для облегчения их кристаллизации. Протокол основан на целостном включение разнообразных данных из вычислительных предсказаний и других источников, чтобы генерировать ряд возможных границ доменов. За ними следуют набор биохимических экспериментов, которые быстро и недорого, и используются для дальнейшего уточнения этих исходных гипотез. Используя этот подход, пользователь может быстро устра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом NIH R01 GM097204 (APV и JDH). Финансирование JHM было предоставлено за счет летней стипендии HHMI для студентов бакалавриата.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BL21(DE3) RosettaEmd Millipore70954-3
BL21(DE3) StarThermoFisher ScientificC601003
BL21(DE3) Codon PlusAgilent Technologies230245
LysozymeSpectrum Chemical Mfg CorpL3008-5GM
Ni-NTA смолаLife Technologies25216
SubtilisinASpectrum Chemical Mfg CorpS1211-10ML
24 скважины Cryschem PlateHampton researchHR3-160
INTELLI-PLATE   96:Art Robbins Instruments102-0001-03
PEG 3350Hampton researchHR2-591
PEG 8000Hampton researchHR2-515
PEG 400Hampton researchHR2-603
PEG 4000Hampton researchHR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2Addgene49089
Ночная экспресс-система автоиндукции 1Emd Millipore71300
Порошок бульона LysogenyThermoFisher Scientific12795027 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  2. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  3. Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
  4. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  5. Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
  6. Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
  7. Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
  8. Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
  9. Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
  10. Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  11. Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
  12. Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
  13. Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
  14. Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
  15. Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
  16. Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
  17. Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
  18. Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075(2013).
  19. Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
  20. Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080(2011).
  21. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539(2011).
  22. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  23. Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
  24. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  25. Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
  26. Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
  27. Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
  28. Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
  29. Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
  30. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  31. Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
  32. Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
  33. Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  34. Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Coiled coil ProteinsProtein CrystallizationDomain Boundary PredictionNickel Affinity PurificationLimited ProteolysisNative PAGE AnalysisSize Exclusion ChromatographyVapor Diffusion MethodCrystallization ScreeningRuby Tag Fusion

Похожие статьи