Кинематический анализ клеточного деления и расширения: Количественная клеточная основа роста и отбора проб Развивающие зон в Zea Mays Листья

Summary

Количественная оценка деления и расширения клеток имеет решающее значение для понимания роста всего растения. В этой статье мы представляем протокол для расчета клеточных параметров, определяющих скорость роста листьев кукурузы, и рассказываем об использовании этих данных для исследования механизмов регуляции молекулярного роста путем разработки стратегий отбора проб для конкретных стадий развития.

Abstract

Анализ роста часто используется в науке о растениях для исследования контрастных генотипов и влияния условий окружающей среды. Клеточный аспект этих анализов имеет решающее значение, потому что рост обусловлен делением и удлинением клеток. Кинематический анализ представляет собой методологию количественной оценки этих двух процессов. Более того, эту методику легко использовать в неспециализированных лабораториях. Здесь мы представляем протокол проведения кинематического анализа на листьях однодольной кукурузы (Zea mays). Представлены два аспекта: (1) количественная оценка параметров деления и расширения клеток и (2) определение местоположения зон развития. Это может послужить основой для разработки выборки и/или может быть полезно для интерпретации данных биохимических и молекулярных измерений с высоким пространственным разрешением в зоне роста листьев. Зона роста листьев кукурузы убирается во время устойчивого роста. Отдельные листья используются для определения длины меристемы с помощью окрашивания DAPI и профилей длины клеток с помощью микроскопии DIC. Протокол подходит для появившихся однодольных листьев, собранных во время устойчивого роста, с зонами роста, охватывающими не менее нескольких сантиметров. Чтобы улучшить понимание регуляции роста растений, необходимо объединить данные о росте и молекулярных исследованиях. Таким образом, важным преимуществом кинематического анализа является возможность соотносить изменения на молекулярном уровне с четко определенными стадиями клеточного развития. Кроме того, это позволяет более целенаправленно выбирать определенные этапы разработки, что полезно в случае ограниченного бюджета или времени.

Introduction

Анализ роста зависит от набора инструментов, которые обычно используются учеными для описания растений генотип определяют различия роста и / или ответы фенотипические к факторам окружающей среды. Они включают в себя измерения размера и веса всего растения или органа и расчеты темпов роста, чтобы изучить основные механизмы роста. роста органов определяется делением клеток и расширения на клеточном уровне. Поэтому, в том числе количественной оценки этих двух процессов роста анализов является ключом к пониманию различий в росте целого органа ^1. Следовательно, крайне важно иметь соответствующую методологию для определения клеточных параметров роста, что является относительно простым в использовании, не специализированных лабораториях.

Кинематический анализ уже создан в качестве подхода , обеспечивающего мощную основу для разработки моделей роста органа ^2. Методика была оптимизирована для линейных систем,такие как Резуховидка Таля корней и листьев однодольных, но и для нелинейных систем, таких как двудольных листьев ^3. В настоящее время эта методика чаще используется для изучения того, как генетические, гормональные, развития, а также факторы окружающей среды влияют на деление клеток и расширение в различных органах (Таблица 1). Кроме того, он также обеспечивает основу для связи клеточных процессов их основных биохимических, молекулярных и физиологических норм (таблица 2), хотя ограничения могут быть наложены по размеру органа и пространственной организации для методов , которые требуют больших количеств растительного материала (например, метаболит измерения, протеомики и т.д.).

Однодольные листья, такие как кукуруза (Zea Мейс - ) листа, представляют собой линейные системы , в которых клетки перемещаются от основания листа к кончику, последовательно проходя через меристемы и удлинение зоны , чтобы достичь зрелогозона. Это делает его идеальной моделью системы для количественных исследований пространственных закономерностей роста ^4. Кроме того, листья кукурузы имеют большие зоны роста (меристемы и относительное удлинение зоны , занимающие несколько сантиметров ⁵⁾ и предоставляют возможности для проведения исследований на других организационных уровнях. Это позволяет при исследовании (мнимых) регуляторных механизмов , контролирующих деление клеток и расширения, количественно с помощью кинематического анализа с помощью ряда молекулярных методов, физиологических измерений и клеточной биологии подходов (таблица 2).

Здесь мы приводим протокол для выполнения анализа кинематики в однодольных листьях. Во-первых, мы объясним, как провести надлежащее анализ как клеточного деления и удлинения клеток в зависимости от положения вдоль оси листа и, как вычислить кинематических параметров. Во-вторых, мы также показывают, как это может быть использовано в качестве основы для формирования выборки. Здесь мы рассмотрим два случая: в высоком разрешении по отбору пробd сосредоточены выборки, позволяя улучшить интерпретацию данных и экономии времени / денег, соответственно.

Таблица 1. Обзор кинематических методы анализа для количественного определения клеточного деления и расширения в различных органах.

орган	Справка
однодольные листья	16, 20, 21, 22
кончики корней	2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
двудольные листья	21, 30, 31
стрелять апикальной меристемы	32

Таблица 1. Обзор кинематических методы анализа для количественного определения клеточного деления и расширения в различных органах.

Таблица 2. Связь между клеточными процессами количественно с помощью кинематического анализа их регуляции на молекулярном уровне. Ссылки на различных исследований , связывающих количественное клеточных процессов на результатах биохимических и молекулярных анализов в различных видах и органах. Ксилоглюкан endotransglucosylase (XET), малонового (MDA), циклин-зависимых киназ (CDK). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Protocol

Примечание: Следующий протокол для кинематического анализа действительна только для листьев во время стационарного роста. Это предполагает стабильную скорость листа удлинением и пространственные структуры , длины клеток и расширения в листе в течение периода нескольких дней ^6.

1. Рост растений и измерения листьев Удлинение Rate (МПУ)

1. Выберите лист в установившемся роста и стадии развития интереса.
   Примечание: Существует разница между стационарному роста и повторяющегося роста, что предполагает сходные пространственные узоры на последовательных листьев на той же оси. На ранних стадиях роста всходов, последующие листья , как правило , становятся все более быстрее из - за увеличения размера зоны роста ^7. Хотя несколько более высокие позиции листа могут иметь аналогичные показатели роста ^8, это переходная фаза , которая может повлиять на лечение под следствием. Поэтому важно, чтобы сравнить линии и тр eatments строго на том же самом положении листа, даже если оно может развиваться в разное время. Даже при постоянной скорости удлинения профиль скорости роста не обязательно же на разных стадиях развития. Поэтому, важно , чтобы проанализировать листьев на той же стадии развития ^8, как правило , определяется количеством дней после появления всходов.
2. Для того, чтобы выполнить полный кинематический анализ роста листьев у однодольных, растут по крайней мере 15 растений для каждой обработки и генотипа в контролируемых условиях в помещении роста.
3. В то время , лист интереса появляется (выход из мутовки окружающих листьев), начать измерение длины листа ежедневно с линейкой , пока лист не будет полностью расширен (рис 1i). Длина листа подразумевает длину от уровня почвы до кончика листа. Будьте осторожны, чтобы не сломать или повредить лист, так как это может изменить свой рост.

Re 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Схематический обзор кинематической анализа листьев кукурузы Лист интерес измеряется с помощью линейки в течение трех дней подряд , чтобы вычислить Leaf Удлинение Rate (LER). После этого лист собирают и сегмент трехсантиметрового используется для определения размера меристемы. Это делается путем измерения длины от основания до самой дистальной митотической фигуры после DAPI окрашивания. (A) Примеры пролиферативных митотических фигур и (В) формообразующих фигур митоза. Первые одиннадцать сантиметров от основания листа на другой стороне средней вены используются для резки десять сегментов одного сантиметра для измерения длины ячейки. Эти измерения служат основой для создания профиля длины ячейки, которая служит для определения длины зрелой клетки (л _мат) и длину клеток , выходящих из меристемы (л _дел). л _мат используются для расчета скорости производства клеток (P), а л _DIV и L - _мер используются для расчета количества клеток в меристемы (N _меров). В свою очередь, Р и N - _мер используются для вычисления средней скорости деления клеток (D), который является обратным к длительности клеточного цикла (T _c). Стрелки одного и того же цвета указывают на параметры, которые используются для вычисления параметра следующее на этих стрелок. Шкала баров = 40 мкм. Римские цифры используются для обозначения конкретных экспериментальных процедур , описанных в протоколе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Уборка урожая

1. На стадии развития интереса (например, на третий день после появления всходов), выбрать по крайней мере , пять представительную рЛанц из партии, на котором для проведения кинематического анализа. Продолжить измерения остальных растений, как описано в пункте 1.3 для определения конечной длины листа.
2. Вырезать наземную часть растения. Чтобы сохранить меристематическую часть нетронутыми, вырезать как можно ближе к корням (рис 1II).
3. Начиная от внешних листьев, удалить все листья до листа интереса, осторожно разворачивая их один за другим. При необходимости, удалите несколько дополнительных миллиметров от основания, чтобы отделить листья. Также удалите апекса и маленькие листья приложенные листом интереса (рис 1iii).
4. Вырезать сегмент 3 см, начиная от основания на одной стороне средней вены, и хранить ее в 1,5 мл пробирку, наполненную смесью 3: 1 (по объему), абсолютный этанол: раствор уксусной кислоты (ОСТОРОЖНО: носить перчатки) на 4 ° С в течение 24 ч до нескольких месяцев (Рисунок 1IV). Этот сегмент будет позже использоваться для определения длины меристемы.
5. ИзДругая сторона вены, вырезать сегмент 11 см от основания (рис 1 V) и поместите его в 15 мл пробирку , заполненную абсолютным этанолом при температуре 4 ° С в течение по меньшей мере 6 ч для удаления пигментов (рисунок 1 VI).
   Примечание: В дальнейшем, использовать только первые 10 см для определения профиля длины ячейки (см Обсуждение).
6. Заменить абсолютный этанол для другого раунда очистки при 4 ° С в течение по меньшей мере 24 ч (рис 1vi).
7. И, наконец, заменить абсолютный этанол с чистой молочной кислоты (ОСТОРОЖНО: носить перчатки) для очистки и хранения при 4 ° С в течение 24 ч или до дальнейшего использования (рисунок 1vi).

3. Длина Измерения меристемы

1. Приготовьте полоскание буфера, содержащего 50 мМ хлорида натрия (NaCl), 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА; ВНИМАНИЕ: носить перчатки) и 10 мМ Трис (гидроксиметил) хлористоводородной кислоты (Tris-HCl, рН 7).
2. Возьмем сегмент 3 см из раздела 2.4 и такак его в буфере в течение 20 мин (рис 1vii).
3. Во время ожидания, используют промывную буфер для подготовки 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) окрашивающий раствор 1 мкг / мл, держа его на льду и в темноте.
4. Пятно ядра путем размещения сегмента меристемы в течение 2-5 мин в растворе для окрашивания DAPI. Работа на льду и в темноте (рис 1vii).
5. Проверьте флуоресцентного сигнала путем быстрого монтажа сегмент на стекле микроскопа и покрывая ее покровным стеклом. В эпидермальные клетки должны проявлять флуоресценцию, в то время как основные клеточные слои не должны.
6. Если окрашивание недостаточно, поместить сегмент обратно в окрашивающего раствора DAPI в течение нескольких дополнительных минут.
7. Чтобы остановить окрашивания, смонтировать сегменты в капле ополаскивания буфера на слайде микроскопа и крышкой с защитным стеклом.
8. С помощью микроскопа, оборудованного УФ-флуоресценции при увеличении 20Х, что позволяет визуализации около 1000 эпидермисаAl клетки сразу. Прокрутка по всему сегменту и искать пролиферативных фигуры митоза (метафазных, анафазе, телофазе и цитокинеза), но избежать формирующее деление клеток развивающегося устьиц (рис 1viii) ^9. Определите, где наиболее дистальной фигура митоза находится.
9. Определить длину меристемы путем измерения расстояния между основанием листа и наиболее дистальной эпидермальной митотической фигуры. Используйте программное обеспечение анализа изображений (например, ImageJ) для измерения полной длины кадра изображения.
   1. Подсчитайте количество кадров , которые охватывают всю длину меристемы (от основания листа к наиболее дистальной митотической фигуры) и умножить это число на длину одного кадра , чтобы получить полную длину меристемы (рис 1ix).

4. Ячейка Длина профиля

1. Возьмите сегмент, который хранится в молочной кислоте (этап 2.5) и аккуратно поместите его на скамейке запасных. Обрежьте сегменты остроумиега скальпель в 10 сегментах 1 см каждая (рис 1x).
2. Установите последовательные сегменты листьев на микроскопии горкой в ​​небольшую каплю молочной кислоты. Убедитесь в том, чтобы постоянно сталкиваться либо адаксиальная или абаксиальный стороной вверх. В принципе, нет никакого предпочтения определенной стороны.
3. С помощью микроскопа, снабженного дифференциального интерференционного контраста (DIC) оптики для анализа сегментов, начиная от основания листа. Измерение с помощью программного обеспечения для анализа изображений в длину по меньшей мере 20 Репликация эпидермальных клеток в файлах, непосредственно примыкающих к устьичными файлов для того, чтобы последовательно выбрать один и тот же тип клеток.
   1. Делайте это в равномерно расположенных местах вдоль каждого из сегментов (4 позиции в сегменте) хватает, и убедитесь в том , чтобы записать соответствующее положение для каждого измерения на протяжении всего листа (рис 1xi).
4. Определить среднюю длину ячейки в каждый мм вдоль оси листа с помощью локального полиномиального сглаживания рrocedure, реализованный в R-сценария (рис 1xii; Дополнительный файл 1).
   Примечание: R-сценарий предоставляет ряд данных с увеличением разглаживанию. Количество сглаживания требуется несколько произвольно и в идеале должен просто удалить локальный шум, но не влияет на общую кривую. Убедитесь в том, чтобы использовать такое же количество сглаживания для всех образцов в течение одного эксперимента.
5. Нормальное длину ячейки в каждой позиции между растениями и вычислить стандартную ошибку, чтобы создать профиль длина ячейки вдоль оси листа.

5. Расчеты кинематических параметров (см Дополнительный файл 2)

1. Вычислить LER, принимая изменение длины листа между двумя последовательными моментами времени (например, 24 часа в сутки, как на стадии 1.3) и разделив его на интервал времени.
2. Вычислить длину зоны роста (L _ГЗ) , соответствующий положению дистально от основания , где клетки достигают 95% их зрелого CEдлина LL на сглаженного профиле длины ячейки.
   1. Возьмем для каждой позиции на сглаженного длина ячейки профиля 95% от среднего значения всех длин клеток после этой позиции (рисунок 2).
   2. Сравните сглажена длины ячейки (шаг 4.4) с расчетной длины ячейки 95% на каждой позиции. Начиная от основания листа, зона роста заканчивается в положении , когда фактическая длина ячейки равна 95% от следующей длины клеток (рисунок 2, см дополнительные данные 2).

Рисунок 2:. Определение конца зоны роста меристемы: В положении , указанном с красной звездой, фактический размер ячейки меньше , чем 95% (красная пунктирная линия) от среднего размера ячейки всех клеток после этой позиции (красного твердого вещества линия). Конец зоны роста (L _GZ, обозначается ABLUE звезда) находится где 95% (пунктирная синяя линия) от среднего размера ячейки всех клеток после этой позиции (сплошная синяя линия) равен действительному размеру ячейки. Разделение зоны (D), удлинение зоны (Е), и зрелыми зона (М). Пунктирные стрелки указывают на сближение между местным размером до 95% от среднего размера по сравнению с дистальной части листа при перемещении из базальных позиций до кончика листа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Вычислить длину удлинения зоны (L _ЭБ) как разность между длиной зоны роста (L _ГЗ) и размер меристемы (L _{мерным,} определенный на стадии 3).
4. Вычислить длину зрелой клетки (л _мат) в качестве средней длины ячейки в зрелой зоне.
5. Разделите LER на л _коврик , чтобы получитьскорость производства клеток (P).
6. Подсчитать количество клеток в зоне растяжения (N - _эль) как разность между N _ГЗ и N _меров. Число клеток в меристемы (N _меров) равен совокупному количеству клеток , расположенных в интервалах , соответствующих меристемы. Число клеток в зоне роста (N _ГЗ) равен совокупному количеству клеток , расположенных в интервалах , соответствующих зоне роста.
7. Вычислить среднюю скорость деления клеток (D) , как P / N _меров. Продолжительность клеточного цикла (Т _с) равен п (2) / D.
8. Рассчитайте время в зоне растяжения (Т - _эль) путем деления N _EL Р. Время в зоне деления равна Log ₂ (N _{мерная)} * Т _с. Длина клеток , выходящих из меристемы (л _дел)равна длине ячейки из сглаженного профиля длины клеток в конце меристемы.
9. Вычислить среднюю скорость расширения ячейки (R - _эль) , используя следующую формулу: п (л _мат) -ln (L _дел)] / T _эл.

Results

Здесь мы покажем, сравнение между хорошо орошаемые растений (контроль, 54% содержания воды в почве, (SWC)) и растений, подвергнутых условиях засухи (засуха, 34% ПВС) с точки зрения их роста листа. Все растения выращивали в ростовой камере в контролируемых условиях (16 ч день / 8 часов ночи, 25 ° C / 18 ° C день / ночь, 300-400 μEm ^-2 сек ^-1 фотосинтетически активной радиации (ФАР). Условия засухи были созданы путем удержания воды до тех пор, пока не будет достигнуто...

Discussion

Полный кинематический анализ на листьях кукурузы позволяет определять клеточной основе роста листьев и позволяет для разработки эффективных стратегий выборки. Хотя протокол относительно проста, некоторая осторожность рекомендуется в следующих важных шагов: (1) Важно отделить молодых, закрываемый листья (шаг 2.3), не повреждая меристемы, так как определение длины меристемы (этап 3) требует полного меристемы присутствовать. Некоторые практики заранее могут быть необходимы. (2) определение длины МЕРИСТЕМАТИЧЕСКИХ основывае...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Горшки	Any	Any Мы	используем горшки со следующими мерами, но могут отличаться в зависимости от обработки/исследования: диаметр дна: 11 см, диаметр отверстия: 15 см, высота: 12 см. Мы выращиваем одно растение кукурузы в горшке.
Субстрат для посадки	Any	Any	Мы используем почвенную среду (Jiffy, Нидерланды), но можно использовать и другие субстраты, в зависимости от обработки/исследования.
Линейка	Любая		Любая Удлинительная линейка, которая покрывает не менее 1,5 метров, необходима для измерения конечной длины листьев растений.
Семена	Any	NA	Seeds можно заказать у селекционера.
Скальпель	Любой	Любой	Скальпель используется во время сбора листьев, чтобы отделить интересующий лист от окружающих его листьев и сразу после сбора урожая вырезать подходящий образец для измерения длины клетки и длины меристемы.
Пробирки для сокола объемом 15 мл	Любые		Пробирки для сокола объемом 15 мл используются для хранения образцов, используемых для измерения длины клеток во время очистки образцов с использованием абсолютного этанола и молочной кислоты.
Пробирки Eppendorf	Any	Any	Пробирки Eppendorf используются для хранения образцов, используемых для измерения длины меристемы, в растворе этанол:уксусная кислота 3:1 (v:v).
Перчатки	Any	Any	Латексные перчатки, которые защищают от агрессивных реагентов.
Уксусная кислота	Любая	Любая	ОСТОРОЖНОСТЬ: Коррозионная для металлов, категория 1 Коррозия кожи, категории 1A,1B,1C Серьезное повреждение глаз, категория 1; Легковоспламеняющиеся жидкости, категории 1,2,3
Абсолютный этанол	Любой	Любой	ВНИМАНИЕ: Опасен при попадании на кожу (раздражитель), при попадании в глаза (раздражитель), при вдыхании. Малоопасен при попадании на кожу (пермеатор), попадания
в организм молочной кислоты >98%	Любое	ВНИМАНИЕ	: Коррозионное воздействие на металлы, категория 1 Коррозия кожи, категории 1A,1B,1C Серьезное повреждение глаз, категория 1
Хлорид натрия (NaCl)	Любая
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Любая		любая ОСТОРОЖНОСТЬ: Острая токсичность (пероральная, кожная, ингаляционная), категория 4 Раздражение кожи, категория 2 Раздражение глаз, категория 2 Сенсибилизация кожи, категория 1 Токсичность для специфических органов-мишеней – Однократное воздействие, категория 3
Трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорид (Tris-HCl)	Любой	Любой Этот	материал может быть раздражителем, следует избегать контакта с глазами и кожей. Вдыхание пыли может раздражать дыхательные пути.
4′,6-Diamidine-2′-фенилиндолдигидрохлорид (DAPI)	Any		Any Cell Проницаемый флуоресцентный зонд связывания минорных бороздок для ДНК. Вызывает раздражение кожи. Может вызвать аллергическую реакцию кожи. Может вызвать раздражение дыхательных путей.
Лед	Любой	NA	Решение DAPI должно оставаться на льду.
Флуоресцентный микроскоп	AxioScope A1, Axiocam ICm1 от Zeiss или другой		Для определения длины меристемы можно использовать любой флуоресцентный микроскоп.
Микроскопическое предметное стекло	Любое
Любое покровное стекло	Любой	Любой
пинцет	Любой	Любой	пинцет нужен для разворачивания свернутого листа кукурузы сразу после сбора урожая, чтобы нарезать подходящий образец для измерения длины клетки и длины меристемы.
Программное обеспечение для анализа изображений	Axiovision (Release 4.8) от Zeiss	NA	Программное обеспечение можно загрузить по адресу: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Можно использовать и другие программы, такие как ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
Микроскоп, оснащенный DIC	AxioScope A1, Axiocam ICm1 от Zeiss или другим		Для измерения длины клеток может использоваться любой микроскоп, оснащенный дифференциальным интерференционным контрастом (DIC).
Программное обеспечение для статистического анализа	R Foundation for Statistical Computing	NA	Открытый исходный код; Можно скачать по адресу https://www.r-project.org/
R script	NA NA	Мы	используем функцию сглаживания ядра locpoly пакета Kern Smooth (Wand MP, Jones MC.  Сглаживание ядер: Chapman & Hall/CRC (1995)). Скрипт доступен для Mac и Windows по запросу у соответствующего автора.