Разработка и внедрение автоматизированной освещая, культивированием и система отбора проб для микробного оптогенетика приложений

Summary

Мы разработали непрерывный культивирования аппарат для использования с оптогенетика систем для освещения культуры микробов и регулярно клеток изображений в сточные воды с помощью инвертированного микроскопа. Культивирование, отбор проб, изображений и анализа изображений полностью автоматизированы, так что динамические реакции на освещение может быть измерена в течение нескольких дней.

Abstract

Оптогенетика системы используют генетически кодируемых ими белков, которые изменяют конформацию в ответ на определенную длину волны света, чтобы изменить клеточные процессы. Существует потребность в культивировании и измерительных систем, которые включают запрограммированным освещение и стимулирование оптогенетика систем. Мы представляем протокол для построения и использования непрерывного культивирования устройства для освещения микробных клеток с запрограммированным дозами света, и автоматически получать и анализировать изображения клеток в сточных водах. Функционирование этого аппарата в хемостате позволяет скорость роста и клеточная среда строго контролироваться. Поток, выходящий из непрерывной культуры клеток регулярно отбирают и клетки изображаются с помощью многоканальной микроскопии. Культивирование, отбор проб, изображений и анализа изображений полностью автоматизированы таким образом, что динамические характеристики интенсивности флуоресценции и клеточной морфологии клеток, отбираемых из культуральной стоках измеряются в течение нескольких днейбез ввода данных пользователем. Показана полезность этого устройства для культивирования путем динамического индукции продуцирования белка в штамме Saccharomyces CEREVISIAE спроектированной с системой оптогенетика , который активирует транскрипцию.

Introduction

Оптогенетика системы используют свет , чтобы контролировать растущий список клеточных процессов , включая экспрессию генов, ^{1, 2, 3, 4, 5} локализацию белка, ⁶ активность белка, ^{6, 7, 8} Связывание с белками, ^{8, 9, 10} и деградации белка. ¹¹ Способ культивирования клеток в контролируемой среде с программируемым оптической стимуляции и для измерения их реакции более биологически соответствующих временных рамок необходимо использовать потенциал этих инструментов для исследований в области клеточной биологии и биотехнологии. Наш метод использует преимущества chemostasis для поддержания постоянной скорости роста клеток в хорошо перемешанных, аеспроектировано, и с регулируемой температурой стеклянный сосуд ^{12 Культивирование, 13} , который подвергается воздействию программированного освещения. Мы изображение отдельные клетки в культуральную стоках с помощью инвертированного микроскопа, чтобы измерить отклик культуры запрограммированным освещения. Культивирование, отбор проб, изображений и анализа изображений полностью автоматизированы таким образом, что интенсивность флуоресценции и клеточная морфология вытекающем культуры клеток может быть измерена в течение нескольких дней, без ввода данных пользователем.

Этот протокол может быть реализован в большинстве лабораторий, знакомых с растущей культуре клеток и микроскопии, а аппарат, используемый недорог и сделаны из легко доступных компонентов. Прозрачный сосуд для культивирования помещается над матрицей светодиодов (LED) , способные излучать 1 мкВт / см ² -10 мВт / см ² света. Микробы выращивают в непрерывно культивирования сосуд; один перистальтический насос используется для добавления средств массовой информации вСтепень разбавления, другая используется для вывести культуру при меньшей скорости к микроскопу, и разница выходит через выпускное отверстие перелива. Электрогрелка поддерживает температуру. Воздух непрерывно закачивают в культурального сосуда для поддержания положительного давления, а также смешивать и аэрацию культуру. для воздушного насоса За исключением случаев, питание этих устройств регулируется микроконтроллером, который также принимает входной сигнал от термометра и подключенного настольного компьютера. Выходящий поток клеточной культуры перекачивают в микрожидком устройство на стадии инвертированного микроскопа. Нефлуоресцентной и флуоресцентные изображения автоматически приобрели. Клетки в изображениях характеризуются алгоритмом, который определяет местонахождение каждой ячейки как область интереса (ROI) и измеряет свойства каждого ROI.

Чтобы продемонстрировать применение этого протокола, мы измерили реакцию на различной интенсивности света клеток Saccharomyces CEREVISIAE сконструированных с синим светом тавленныеве оптогенетика систему, которая контролирует транскрипцию флуоресцентного белка. S.cerevisiae , , широко известный как пекарских дрожжей, был выбран потому , что множественные оптогенетика системы для контроля экспрессии генов в этой системе уже существуют ^{14, 15, 16.} Кроме того, эта модель организма обычно используется для исследований в биологии систем ¹⁷ и в качестве шасси для биотехнологического применения ^{18, 19, 20.} Наши репрезентативные результаты показывают, что этот протокол может быть использован для контроля транскрипции культуры в течение нескольких дней путем изменения входного интенсивности света и измерения производства флуоресцентного репортера.

Protocol

Рисунок 1: Непрерывный Культивирование аппарат. Эта упрощенная схема показывает, как аппарат должен быть собран, когда он используется для культуры, освещают, и измерения оптических свойств микробов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Обзор протокола. Действия, описанные в затененной области должны повторяться каждый раз, когда используется протокол. Управление в замкнутом контуре можно ^34, но не реализована в данном протоколе.

1. Установите термометр с печатной платой

Рисунок 3: Соединения для считывания значений термометра. Эта диаграмма показывает, как цифровой термометр должен быть подключен к печатной плате таким образом, что микроконтроллер может получить обратную связь, чтобы контролировать температуру культуры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Припой Ground, данные и положительные линии напряжения цифрового термометра в их соответствующие сквозные отверстия с маркировкой "GD + V".
2. Клип от одного контакта из женского заголовка 3-контактный и обрезать оставшиеся 2 булавки с проводными машинки для стрижки, так что он может поместиться в два сквозных отверстия с маркировкой "R2", а не препятствовать микроконтроллер. Припой это на месте. Соедините два спаянных булавки, вставляя 4,7 кОм резистор в заголовке выводами.

2. Подключите питания ConTROL Компоненты с печатной платой

Рисунок 4: Подключение для управления мощностью в грелку. Эта диаграмма показывает, как PCB и вспомогательные части должны быть собраны для того, чтобы контролировать мощность на грелку. Части для управления перистальтические насосы соединены аналогичным образом. Обратите внимание, что компоненты для термометра были удалены для ясности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Обрежьте 1 см от штырей пяти женских заголовков 3-контактный. Припой их на позиции, на печатной плате (PCB), помеченный как "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" и "CB Е."
2. Обрежьте 1 см от булавки женского 6-контактный и 8-контактный разъем. Припой эти бок о бокколонна сквозных отверстий маркированы K1 через К14.
3. Подключение грелку к печатной плате.
   1. Вставьте концы 100 кОм в сквозные отверстия с маркировкой K1 и K2 на печатной плате. Вставьте металл-оксид-полупроводник полевой транзистор (MOSFET) в положение, обозначенное # 1 на печатной плате, с этикеткой полевого МОП-транзистора, обращенной к K1 через К14 сквозные отверстия таким образом, чтобы источник штифт находится ближе всего к "# "ярлык, и дренажный штифт отдален от" # "этикетке.
   2. Обрежьте заземления линии постоянного тока кабеля питания 5 В (DC) и подключить его к J2. Подключите провод заземления линии грелку к J1. Подключить К3 к контакту 3 с 1 кОм сопротивлением. Ток должен теперь только поток от J1 до J2, когда штырь 3 установлен на + 5V.z
      Примечание: резистор / MOSFET набор функций как переключатель, который позволяет току течь от контактов J1 на J2, когда контакт 3 микроконтроллера устанавливается на +5 В.
4. подключатьмедленный перистальтический насос.
   1. Вставьте концы 100 кОм в сквозные отверстия с маркировкой К4 и К5 на печатной плате. Вставьте МОП-транзистор в положение, обозначенное # 2 на печатной плате, с этикеткой полевого МОП-транзистора, обращенной к K1 через К14 сквозные отверстия таким образом, чтобы источник штифт находится ближе всего к "#" этикетки, и дренажный штифт на противоположной стороне от "#" метка.
   2. Разрежьте линию заземления цепи постоянного тока кабеля 12 V питания медленного перистальтического насоса. Подключите перистальтический насос, обращенную конец J3 и стеной бородавка, обращенную конец J4. Подключите К6 к контакту 4 с 1 кОм сопротивлением. Ток должен теперь только поток от J3 до J4, когда штырь 4 установлен на +5 В.
5. Подключите быстрый перистальтический насос
   1. Вставьте концы 100 кОм резистор в сквозные отверстия с маркировкой K7 и K9 на печатной плате. Вставьте МОП-транзистор в положение, обозначенное # 3 на печатной плате, с этикеткой полевого МОП-транзистора, обращенной к K1 через K14 сквозные отверстия с о том, что источник контактный находится ближе всего к "#" этикетке, и дренажный штифт отдален от "#" этикетке.
   2. Разрежьте линию заземления цепи постоянного тока кабеля 12 V источника питания быстрого перистальтического насоса. Подключите перистальтический насос, обращенную конец J5 и стеной бородавка, обращенную конец J6. Подключение K9 к контакту 5 с 1 кОм сопротивлением. Ток должен теперь только вытекать из J5 к J6, когда штырь 5 установлен на +5 В.

3. Подключите светодиодная матрица с печатной платой

Рисунок 5: Соединения для управления светодиодной матрицы. Эта диаграмма показывает, как светодиодная матрица должна быть подключена к печатной плате. Он также показывает, что печатная плата может быть уложены на микроконтроллере. Обратите внимание, что компоненты для термометра и для управления мощностью постоянного тока с другими устройствами, были удалены для ясности.эс / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Припой 6-контактный, 10-контактный и два 8-контактный разъем заголовки контактов в отверстия сквозные по сторонам печатной платы таким образом, что она может быть уложены на верхней части микроконтроллера.
2. Припой 100 нФ и 10 мкФ конденсаторов их отмеченных местах на печатной плате, отметив, что отрицательный вывод 10 мкФ конденсатора (короче свинца) должен быть подключен к сквозного отверстия, отмеченные отрицательным знаком.
3. Припой светодиодный драйвер на 2 по 12 набора сквозных отверстий, с углублением на водителя далеко от сквозных отверстий, зарезервированных для светодиодной матрицы.
4. Припой 2 колонки мужских заголовков контактов для сквозных отверстий, помеченных для светодиодной матрицы, и обрезать концы этих под макете таким образом, что они не будут препятствовать микроконтроллер. Подключите их к двум 8-проводных полос женских / женских перемычек. Подключите второй набор мужскихконтактные разъемы на другом конце перемычек.
5. Вставьте светодиодную матрицу над медианой макете, а затем вставьте второй набор контактных заголовков столбцов по обе стороны от матрицы. Убедитесь, что электрические соединения являются такими же, как если светодиодная матрица была непосредственно соединена с печатной платой с меченым стороне матрицы, соответствующей меченой колонке сквозных отверстий.
6. Клип от одного контакта из женского заголовка 3-контактный и обрезать оставшиеся 2 булавки с проводными машинки для стрижки, так что он может поместиться в два сквозных отверстия с маркировкой "R1", а не препятствовать микроконтроллер. Припой это. Соедините два спаянных булавки, вставляя 1 кОм резистор в заголовке выводами.
   Примечание: Культивирование судно будет укладываться над светодиодной матрицы. Если провод ленты препятствуют судно, смещение от матрицы. Затем, используя твердую основную проволоку, чтобы преодолеть разрыв между матричными штырями и провода ленты булавки, таким образом, что электрические соединения не CHАнж.

4. Установка программного обеспечения и подключение к Hardware

1. Стек PCB на микроконтроллер.
2. Следуйте по ссылкам в списке материалов для загрузки интегрированной среды разработки (IDE) и пользовательский код для микроконтроллера.
3. Подключение микроконтроллера к микроскопу компьютеру с помощью универсальной последовательной шины (USB) кабель AB. Компилировать и загружать пользовательский код для микроконтроллера.
4. Скачать Micro-Manager ^{21, 22} и ²³ Fiji. Настройка Micro-Manager в качестве подключаемого модуля ФИДЖИ путем копирования всех ".dll", каталог "mmplugins", и "mmautofocus" каталог из каталога, где Micro-менеджер был загружен в каталог "Fiji.app". Кроме того, скопируйте "плагины / Micro-Manager" каталога в каталог "Fiji.app/plugins~~HEAD=pobj".
5. Скачать "BioreactorController.jar" файл Intо директории "Fiji.app/mmplugins~~HEAD=pobj".
6. Открытый Micro-менеджер от ФИДЖИ> Плагины> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. С помощью аппаратного мастера настройки для настройки программного обеспечения для управления микроскопом. Включите устройство "FreeSerialPort" в мастере с меткой порта, к которому подключен кабель USB AB.

5. Сделайте и Охарактеризовать светонепроницаемыми Корпус для культурального сосуда

1. Стек три 8-контактный IC розетки в качестве строительных блоков на макете на каждом углу светодиодной матрицы таким образом, что культивирование судно может покоиться на них выше матрицы.
2. Закрепить часть диффузионной бумаги под верхним слоем из гнезд, таким образом, что свет, падающий на судно от культивирования светодиодной матрицы диффузно.
3. Вырежьте три 8 "на 6" порциями черной пены. Вырезать часть, которая имеет те же размеры, как электронная макете (2,3 "х 3,5") от внутренней части первой ТВтO, и часть, которая является размер прямоугольника, сделанного гнездах IC (0,9 "х 1,8") с внутренней стороны третьего. Штабелировать эти слои над светодиодной матрицы таким образом, чтобы последний слой, содержащий 0,9 "х 1,8" апертура лежит вровень с верхней части гнезда IC, и окружает светодиодная матрица.
4. Вырезать дополнительный лист черной пены пополам, чтобы сделать прямоугольник 6 "на 24". Ролл это в полую колонну черного пены, что для культивирования сосуд может поместиться в с комнатой для трубок и проводов, таким образом, что она будет термически и оптически изолирования для культивирования сосуд.
5. Сосредоточьте полый столб черного пены над светодиодной матрицы, и отметьте границу столбца на слой черной пены под ним. Эта граница будет отмечать, где она должна быть сосредоточена в будущем.
6. Вырежьте 3 "х 3" часть черной пены. Используйте это позже в качестве крышки, который может быть закреплен в верхней части колонны, чтобы блокировать внешний свет.
7. Закрепить датчик фотодиод мощности к й е культивированием колпачок судна с лентой, прикрепить крышку, и вставьте в сосуд для культивирования корпуса.
8. В Micro-Manager, перейдите к Plugins> биореактора Controller. Установите матрицу для освещения на подмножества диапазона возможных интенсивностей на 30-секундные интервалы.
9. Запись интенсивности света, как показано на измеритель мощности консоли, подключенной к датчику мощности. Эти измерения позволят фактическая интенсивность света, чтобы быть известным, когда количество светодиодов, которые светятся, и широтно-импульсной модуляцией (ШИМ) тока для этих светодиодов установлен.

6. Подготовить культурального сосуда

Рисунок 6: Емкость подключения. Эта диаграмма показывает, как сосуд и трубки аппарата должен быть подключен перед автоклавной.пустым "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Отметьте высоту, соответствующую каждому 2 мл приращению жидкости в диапазоне от 10 до 30 мл в культурального сосуда. Вставьте 10 мл стерильной деионизированной воды, отметьте уровень воды, добавьте 2 мл, отметьте уровень воды, и повторять, пока уровень 30 мл не отмечено. Накройте маркировки с ясной лентой так, чтобы они не так легко удалены, и утилизировать жидкости.
2. Поместите длинный конец порта алюминия через силиконовой прокладкой, в культурального сосуда. Винт на крышке.
3. Накройте один выход порта короткий алюминий с 1/16 "ID силиконовой трубки. Вставьте дистальный конец, вставив женский замок Люэра , а затем соединительный разъем замка с мужской Luer. Этот выход является дополнительным, и не будет использоваться (труба 6 на рисунке 6 ).
4. Соедините два коротких сегментов 1/16 "ID силиконовой трубки с мужскими и женскими Luer замков. Подключите один конец к розетке короткого алюминиевого порта и подключить Количесл конец с мужской Luer и вилки замка женского Луер. Судно будет прививали через эту трубу (труба 7 / 7.1 на рисунке 6).
5. Подключите два 1/16 "ID трубки к концам 1/16" ID перистальтический и разъемов. Подключите один конец к короткому алюминиевом порту и подключите другой (трубы 4 на рисунке 6). В дальнейшем это будет подключен к мультимедийному колбу.

7. Подготовьте носитель колба

1. Подключите 1/16 "внутренний диаметр (ID) силиконовую трубку к длинной алюминиевой порту. Трубка должна быть достаточно длинной, чтобы достигнуть флягу носителя. Подключите 1/8" люэровского ID Мужского на коротком отрезке 1/16 " ID трубки, подключить к предыдущей трубке ,, а затем вставить этот короткий отрезок в резиновую пробку на колбе медиа (труба 3 на рисунке 6).
2. Зажмите трубку. Такое соединение позволяет воздуху поступать из медиа колбы в культуральный сосуд. Когда колба СМИ позже накачке воздуха следующиеd эта трубка unclamped, культура будет неоднородным, так газированная, и выдерживают при положительном давлении поступающими пузырьков.
3. Вставьте 1/16 "ID трубки достаточно долго, чтобы достичь дна колбы в пробку, через которую будут передаваться СМИ. Подключите другой 1/16" идентификатор трубки к этому, а затем 3/16 "ID трубки что. Подключите это с внутренним диаметром 3/16 "женский замок Люэра и вилкой мужчина люэровского (труба 1 / 1.1 на рисунке 6).
4. Третье отверстие в пробке должна быть заполнена с коротким сегментом 1/16 "ID трубки, соединенные с двумя другими сегментами труб среднего диаметра и вставлен в дистальном конце (трубка 2 / 2,1 на рисунке 6). Это будет подключен с вакуумным насосом, а затем в аквариуме насоса.
   Примечание: Если трубка не может легко проходить через отверстия в резиновой пробкой, срезанные концы трубок с перекосом. Затем, наклонная конец которого выталкивается через отверстие можно использовать, чтобы вытащить остальные через.

1. Вставьте мужской замок Люэра в сегмент 1/16 "ID силиконовой трубки, а затем плотно вставьте 0.022" ID политетрафторэтилена (PTFE) трубки. Отдельно приложите женский замок Люэра к 1/16 "ID трубки. Затем один конец нити вдоль трубки PTFE для подключения замков , а другой короткий алюминиевый порт (труба 5 на рисунке 6).
2. Подключите открытую 1/50 "ID силиконовой трубки к 1/50" ID перистальтической трубки и разъемы. Для этого необходимо соединить три сегмента 1/50 "ID трубки и два сегмента 0,022" ID PTFE трубки, чередуя их. Подключите к вытекающего колбу через 1/16 "ID трубкой (трубная 5 на рисунке 6).
3. Подключите один конец 1/16 "ID силиконовой трубки ко второй длинной трубки порта алюминия, а другой конец к вытекающему колбы. Эта алюминиевая трубка устанавливает объем культуры, а также избыток культуры перетекает в вытекающем контейнер (труба 8 в
4. Автоклава сборку с последующим культивированием при температуре 121 ° С и 15 фунтов на квадратный дюйм (общий стерилизации) в течение 30 мин.
   Примечание: Трубки, через которую Колбу носитель заполнен, через которую носитель Колбу вакуумируют, и через которую культивирования сосуд засевают имеют несколько сегментов трубки таким образом, что, если дистальный сегмент загрязнена, то ее можно удалить, чтобы выявить стерильный сегмент.

9. Подготовьте Микрожидкостных канал

1. Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS) и отвердителя в соотношении 9: 1. Дега и вылить на мастер кремния формы.
2. Вылечить PDMS в течение 2 ч при температуре 65 ° С, а затем разрезать ее от маски с лезвием бритвы. Вырезать вокруг PDMS, пока он не освободит из пресс-формы. Не толкайте вниз и ломая хрупкую пластину.
3. Используйте 1,2 мм ID отверстий биопсия перфоратора для пробивки отверстий на обоих концах канала.
4. Плазменный облигационной PDMS к покровного стекла ^24.
5. Лента длинная концы покровного стекла на опорной алюминиевой раме таким образом, что канал ПДМС центрирована на алюминиевой раме, а затем выпекать PDMS снова в течение 2 ч при 65 ° С.

10. Наполните СМИ Колба

Рисунок 7: Добавление средств массовой информации. Эта диаграмма показывает, как средства массовой информации должны быть вакуум-фильтрации в СМИ колбу. Это гарантирует, что носитель остается стерильным. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Сделать соответствующие средства массовой информации. Если система непрерывного культивирования будет работать в качестве хемостате, используют средства массовой информации ограничены для определенного питательного вещества.
   Примечание: Примеры стандартного состава средств массовой информации для исследований с S.cerevisiae , которые были ранее опубликованы ^25,= "Xref"> ^{26, 27, 28, 29.}
2. Присоединить вакуумный фильтр к бутылке емкостью 100 мл, снимите крышку сосок, затем удалите белую заглушку из сосков вакуумного фильтра с стерильным пинцетом.
3. Подключение к внутренним диаметром 3/16 "силиконовую трубку к соску, другой свободный трубка медиа - колбу , к вакуумному насосу (трубы 1 и 2 на рисунке 7, соответственно), а также гарантировать , что трубка , соединяющая медиа колбу для культивирования сосуд зажимают закрыть (трубки 3 на рисунке 7).
4. Заполните фильтр с помощью средств массовой информации, включите вакуумный насос, а затем отфильтровать остальную часть средств массовой информации. Зажим 1/16 "ID силиконовой трубки, соединенный с вакуумом (трубы 2 на рисунке 7) и выключите вакуумный насос.
5. Удалите Leurs из промежуточного сегмента 1/16 "ID трубки соединен с вакуумным насосом, так что незараженных конец трубки доступен. Вставка-йе синий конец стерильной воздушный фильтр шприца в эту трубу.
6. Зажим 3/16 "ID силиконовой трубки (трубки 1 на рисунке 7) и отсоедините мужской Луер от него. Отсоедините вилку от женской Луер медиа - впускной трубы Культивирование судна. Соедините эти мужские и женские Luers для того, чтобы средства массовой информации , чтобы быть закачивают в культурального сосуда.
7. Снимите вакуумный фильтр и увенчать 100 мл флакон носителя, который был присоединен к вакуум-фильтра.
8. За день до культивирования сосуд будет прививали, прививают одну колонию оптогенетика микроба в пробирку с 4 мл средства массовой информации, собранных в предыдущем шаге, и пусть она расти в течение ночи при 30 ° C или оптимальной температуре роста температуры культуру в при перемешивании.

11. Сборка аппарата Вокруг микроскопа

1. Установить непрерывную сборку культивирования рядом с микроскопом со средствами массовой информации колбы выше культурального сосуда и effluлор колбу ниже культурального сосуда, таким образом, что труба состоит из сегментов 0,022 "ID PTFE трубки (трубки 5 на рисунке 6) может достигать предметный столик микроскопа. Плотно лентой вниз резиновыми ограничителями на медиа - колбы и вытекающего контейнера.
2. Отключите концы 0,022 "ID PTFE трубки из 1/50" ID силиконовой трубки , соединяющие их (трубку 5 на рисунке 6), и подключить эти концы в входе и выходе из микрожидкостных устройства.
3. Подключите белый конец воздушного фильтра шприца аквариума насоса. Давление воздуха будет толкать носитель в культурального сосуда.
4. Когда носитель достигает уровня исходящего порта, оберните 1/16 "ID медиа впускной трубы и разъемы вокруг медленного перистальтического насоса (труба 4 на рисунке 6) и 1/50" ID образца трубы на выходе и разъемы вокруг поста перистальтический насос (труба 5 на рисунке 6).
5. Аэрируйте носителя путем разжим воздуха втбыть между медиа-колбы и культурального сосуда.
6. Лента грелку и термометр для культивирования сосуд таким образом, чтобы его температура может регулироваться. Катушка медиа трубку вдоль культурального сосуда, так что поступающие средства массовой информации будет при той же температуре, что и сосуд.
   Примечание: ШИМ тока на грелку регулируется микроконтроллер, который использует входы от термометра, чтобы сохранить для культивирования сосуд заданной температуры воды.
7. Вставьте сосуда для культивирования в черной пены шкафа над светодиодной матрицы, и убедитесь, что трубы не сдавлены.
8. В Micro-Manager, перейдите к Plugins> биореактора Controller. Установите "соотношение медиа-насоса на" поле до 0,1 и "отношение насоса образца на" поле 0. Скорость потока будет очень низким, но больше, чем скорость испарения.
9. Закрепить входящий воздушной трубки между СМИ колбу и культурального сосуда. Выньте вилку из прививка трубки (трубки 7 на рисунке
10. Закройте корпус так, чтобы свет не входит, и пусть культуры растут в течение ночи.

12. откалибровать Насосные тарифы

1. В Micro-Manager, перейдите к Plugins> биореактора Controller. Установите "отношение насоса носителя на" поле до 0,5 и "отношение насоса образца на" поле 0.
2. Отсоедините переливную трубку из вытекающего потока колбы (трубка 8 на рисунке 6) и трубкой для отбора проб из вытекающего потока колбы (трубки 8 на рисунке 6) и собирают сточные воды в отдельных сосудах. Сбор стоков в течение 1 ч, начиная после того, как насосы в течение 15 мин.
3. Рассчитывают скорость потока сред в культурального сосуда из объема собранного в емкости, как:
   
4. Отрегулируйте значение "коэффициента насоса СМИ на" поле с помощью этой линейной оценки:
   
   где
   
5. Итерации через эту процедуру калибровки, пока разность между требуемым расходом и измеренной скорости потока не является <0,2 мл / ч, где скорость потока усредняется по 1-часового периода.
6. Увеличение значения "соотношение образца на" поле и не калибровать его аналогичным образом до тех пор , примерно 4/5 ^го объема , выходящего из сосуда для культивирования , откачивают с помощью насоса для отбора проб и примерно 1/5 ^го объема уходит через переполнение порта.
7. Пусть плотность культуры в непрерывном культивирования устройства уравновешивания в этих условиях в течение ночи.
   Примечание: Если скорости целевого потока не может быть достигнуто, изменениеперистальтический насос трубки. Жидкость перекачивается с более высокой скоростью, когда используется больший диаметр трубки. Выполните шаг 14, а затем вернуться к шагу 8.4.

13. Собирайте микроскоп Изображения культивируемыми микроорганизмами

1. Заполните Stage Список Позиция в Micro-Manager с набором непересекающихся положений, в которых изображения клеток, сданной в микрожидкостных канал будет находиться в фокальной плоскости.
2. Откройте плагин "Биореактор Controller". Выберите нужный курс LED времени матрица, каналов визуализации и других экспериментальных установок от подсказкам. Сбор и анализ изображений.
3. Хотя эксперимент работает, убедитесь, что средства массовой информации в средствах массовой информации колбе остается прозрачным. Если это облачно, то она была загрязнена.

14. Пост-эксперимент

1. Утилизировать СМИ, избыток культуры клеток и сточных вод.
2. Пополняйте медиа колбу с 200 мл 20% -ного этанола, смешанного с деионизированной водой. Запуск хемостата, как это было ранеебыла запущена во время эксперимента, чтобы смыть остатки клеток и средств массовой информации.
3. Когда раствор спирта сливают из средств массовой колбы, разобрать хемостата полностью.
4. Мытье посуды и трубы с теплой водой и мягким моющим средством и тщательно промойте деионизированной водой. Оставьте сохнуть.
5. Откройте файл "microcontrollerRecords.csv", чтобы просмотреть температуру и состояние матрицы LED над ходом эксперимента, файл "Summary.csv", чтобы просмотреть сводные данные из каждого набора изображений и "Результаты <п> .csv" файлы для просмотра данных , суммирующих каждый ROI от каждого периода времени, где п п ^го набора данных.

Results

Этот аппарат был использован , чтобы стимулировать культуру S.cerevisiae , выражающую желтый флуоресцентный белок (YFP) в ответ на синего света через индуцируемого оптогенетика системы транскрипции на основе белка пары CRY2 / CIB1 ^30. Клетки выращивали chemostatically в фосфатном ограниченных средах со средней скоростью разбавления 0,2 ± 0,008. Фосфаты ограничение обычно используется в экспериментах S. CEREVISIAE хемостатическую контролировать ск...

Discussion

Мы разработали этот аппарат с гибкостью в виду. Весь код, используемый является свободным и открытым исходным кодом. Процесс анализа изображений по умолчанию для ячеек сегмента проста и работает быстро. Пользовательский анализ может быть реализован путем записи ввод данных пользователем при анализе репрезентативной изображение с графическим пользовательским интерфейсом ФИДЖИ, преобразование входа в BeanShell сценария, а затем установить плагин для вызова скрипта. Когда он вызывается, этот сценарий будет послан массив ст...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Подробное руководство по лабораторной работе	GitHub	NA	Подробное, регулярно обновляемое руководство по лабораторной работе доступно в разделе « Оптогенетические хемостатные файлы" Репозиторий GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Это также включает описание микрофлюидной формы, используемой для получения репрезентативных результатов.
Fritzing Design Viewer	Fritzing	NA	Бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для просмотра и редактирования проектов печатных плат типа .fzz доступно по адресу "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - в сборе)	Adafruit	50	Микроконтроллер. 1 требуется.
Комплект стекируемых разъемов Arduino	SparkFun Electronics	10007	Гнездовые контактные разъемы для подключения печатной платы к микроконтроллеру. Требуется 1.
Регулируемый паяльник 30 Вт 110 В - XY-258 110 В	Adafruit	180	Для выполнения электрических подключений к печатной плате.
Подставка для паяльника	Adafruit	150	Для выполнения электрических подключений к печатной плате. требуется 1 шт.
Катушка для припоя Mini - 60/40 свинцовый припой с канифолевым сердечником диаметром 0,031 дюйма - 100 г	Adafruit	145	Для выполнения электрических соединений с печатной платой.
0,1 μ F конденсатор	SparkFun Electronics	COM-08375	Стабилизирует напряжение на печатной плате. 1 требуется.
10 μ F конденсатор	SparkFun Electronics	COM-00523	Стабилизирует напряжение на печатной плате. 1 требуется.
MAX7219CNG Драйвер светодиодной матрицы/цифрового дисплея - MAX7219	Maxim	MAX7219CNG	драйвер светодиода. Требуется 1 драйвер.
8-контактный IC Socket	Mouser Electronics	575-144308	16 требуется. Они будут уложены друг на друга, чтобы поддерживать сосуд для культуры над светодиодной матрицей.
24-контактный разъем IC	Mouser Electronics	535-24-3518-10	Опционально. Используйте его для обратного подключения драйвера MAXIM 7219CNG к печатной плате.
Цифровой мультиметр	Adafruit	2034	Для устранения неполадок электроники. 1 обязательно.
Отрывные разъемы - 40-контактный штекер (длинный центрированный, PTH, 0,1 дюйма)	SparkFun Electronics	PRT-12693	Штыревые разъемы для подключения светодиодной матрицы к печатной плате. Концы можно обрезать кусачками. Требуется 1 комплект.
Диагональные кусачки	Adafruit	152	Для обрезки длинных контактных разъемов и резки силовых кабелей. 1 обязателен.
Премиальные провода для перемычек - 40 x 12" (300 мм)	Adafruit	793	для подключения макетной платы к светодиодной матрице. Может быть соединен встык с помощью штыревых разъемов, чтобы быть длиннее. 1 обязательный.
Макетная плата половинного размера	Adafruit	64	Светодиодная матрица будет подключаться к ней, а емкость для культивирования будет располагаться над ней.
Миниатюрная синяя светодиодная матрица 8x8	Adafruit	956	Источник света. Доминирующая длина волны – 470 нм (синий). 1 обязательный. Альтернативные миниатюрные светодиодные матрицы от того же производителя доступны с доминирующими длинами волн: 624 нм (красный), 588 нм (желтый), 525 нм (зеленый), 572 нм (желто-зеленый) и белый.
Штабелируемый разъем - 3 контакта	SparkFun Electronics	13875	8.
Комплект резисторов - 1/4 Вт (всего 500)	SparkFun Electronics	10969	Для электроники. Требуется 1.
IRL520N MOSFET	International Rectifier	IRL520N	Переключатель регулирования напряжения для управления постоянным током. 4 Требуется.
Соединительный провод - Ассортимент (Solid Core, 22 AWG)	Провод для электроники SparkFun Electronics	PRT 11367	Требуется 1 шт.
Импульсный источник питания 5 В, 2 А (2000 мА) - включен в список UL	Adafruit	276	Блок питания для грелки и Arduino. Требуется 2 очка.
Регулируемый импульсный адаптер питания 12 В постоянного тока 1000 мА - включен в список UL	Adafruit	798	Для перистальтических насосов. Требуется 2.
Электрическая грелка - 10см х 5см	Adafruit	1481	Для нагрева биореактора. 1 обязательно.
Перистальтический насос с переменным расходом низкого расхода	Fisher Scientific	13-876-1	Для перекачивания сред. 1
требуется Перистальтический насос с переменным расходом среднего расхода	Fisher Scientific	13-876-2	Для перекачивания культуры. 1 требуется.
Регулируемый коммутационный адаптер питания 9 В постоянного тока 1000 мА - включен в список UL	Adafruit	63	для питания микроконтроллера. Приказ 1.
Высокотемпературный водонепроницаемый DS18B20 цифровой датчик температуры + дополнительные услуги	Adafruit	642	для биореактора. Требуется 1 шт.
Micromanager	Micromanager	NA	Бесплатное программное обеспечение для управления микроскопом с открытым исходным кодом доступно по адресу "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI	ImageJ	NA	Бесплатное программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом доступно по адресу "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment	Arduino	NA	Бесплатная среда разработки с открытым исходным кодом доступна по адресу "https://www.arduino.cc/en/Main/Software
" Пользовательский код	GitHub	NA	Пользовательский код микроконтроллера и плагин "Bioreactor Controller" доступны в разделе " Оптогенетические хемостатные файлы" Репозиторий GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB-кабель от A до B - 6 футов	SparkFun Electronics	CAB-00512	Используется для загрузки данных на микроконтроллер. Требуется 1 кабель.
bioreactorTimecourse_example.csv	GitHub	NA	Преимущество загрузки значений светодиодной матрицы из файла CSV заключается в том, что подключаемый модуль может вызвать программу для обновления этих значений на основе результатов анализа изображений, и эти значения могут быть повторно загружены на микроконтроллер, что обеспечивает управление обратной связью. Его можно приобрести в разделе « Оптогенетические хемостатные файлы" Репозиторий GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Гели Tota-frost (диффузионная бумага)	B & H	B& H # LOFSFTL MFR # T1-72	Для светодиодной матрицы. 1 обязательно.
Комплектующий лист Crosslink 1/4x12x24in	Grainger, inc	20JL37	Черная пена для культивирования корпуса сосуда. Требуется 4.
Стандартный датчик мощности фотодиода, Si, 200 - 1100 нм, 50 мВт	Thorlabs	S120VC	Для измерения интенсивности света. 1 обязательно.
Маркировочная лента	Fisher Scientific	159015N	Для маркировки и закрепления незакрепленных компонентов. 1 обязательно.
Компактная консоль измерителя мощности и энергии, цифровой 4-дюймовый ЖК-дисплей	Thorlabs	PM100D	Для измерения интенсивности света. 1 требуется.
100 мл GL45 гибридизационная стеклянная бутылка	Bellco Glass, Inc.	(7910-40150)	Сосуд для биореактора. Требуется 1 контейнер.
Шестипортовая сборка	Bellco Glass, Inc.	Пользовательский	Для корпуса биореактора. Характеристики трубки: .125" OD x .055"ID. Порт A: 1.0" в длину над пробкой крышки и на дно трубки. Порты B,C,E,F: 1,0 дюйма в длину над пробкой крышки, 33 мм в длину снизу. Порт D: длина 1,0 дюйма над пробкой крышки, 65 мм  долго внизу. 1 обязательный. Включает в себя полипропиленовую завинчивающуюся крышку с открытым верхом диаметром 45 мм и белую силиконовую прокладку для обеспечения плотного прилегания крышки к сосуду.
Скотч Magic Tape 3105, 3/4 x 300 дюймов, упаковка из 3	амазонок	B0009F3P3U	прозрачный скотч. Это доступно у многих других поставщиков. Он используется для покрытия маркировки на емкости для культивирования и для крепления защитного стекла с помощью канала PDMS к алюминиевой опорной раме.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Санитарная силиконовая трубка	United States Plastic Corp.	57288	Трубка. ~25' требуется.
Cole-Parmer Twistit белая резиновая пробка, размер 10	Cole-Parmer	EW-62992-32	Пробка для колб со средой и пробка для колб для сточных вод. Требуется 2.
Лабораторная колба объемом 2 л	Pyrex	4980	Колба для сред и колба для сточных вод. Требуется 2 л.
Дневной пинчкок	Fisher Scientific	5867	Для защемления трубок закупорить. 3 обязательно.
Запасная трубка в сборе 1/16" ID	Отслеживаемые продукты	3372	Перистальтические насосы поставляются с набором трубок, но они изнашиваются после нескольких недель использования.
Сменная трубка в сборе 1/50 дюйма ID	Отслеживаемая продукция	3371	Перистальтические насосы поставляются с набором трубок, но они изнашиваются после нескольких недель использования.
Наружный люэр со стопорным кольцом x штуцер для шланга 1/16", нейлон, 25/шт	Cole-Parmer	EW-45505-00	Требуются соединители. ~10 люэров.
Наружный люэр со стопорным кольцом x штуцер для шланга 1/8", нейлон, 25/шт.	Cole-Parmer	EW-45505-04	Соединители. Требуется 5, по одному на каждое отверстие резинового стопора для заполнения трубкой.
Внутренняя люэр x адаптер для шланга 1/16 дюйма, нейлон, 25 / шт.	Cole-Parmer	EW-45502-00	Соединители. ~10 люэр
Внутренняя люэр x адаптер для шланга 3/16	Cole-Parmer	EW-45502-08	Требуется разъем. ~10 люэров.
Аксессуар Cole-Parmer Luer, колпачок Luer с внутренней резьбой, нейлон, 25 / шт.	Cole-Parmer	SC-45502-28
Аксессуар Cole-Parmer Luer, блокировочная заглушка с наружной резьбой, нейлон, 25 шт.	Cole-Parmer	EW-45505-56
Трубка из микроотверстия из ПТФЭ, 0,022 дюйма ID x 0,042 дюйма OD, 100 футов / рулон	Cole-Parmer	EW-06417-21	Трубка. Требуется 1 рулон. Требуется 1 рулон.
Трубка из платинового отверждения Masterflex, L/S 13, 25 футов	Cole-Parmer	EW-96410-13	Трубка. ~25 футов.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Санитарная силиконовая трубка	United States Plastic Corp.	57293	Трубка. ~1' Требуется.
Вакуумный фильтр	Fisher Scientific	974107	вакуумный фильтр Nalgene для стерильных фильтрующих материалов.
Aquel Oxy-Boost 200	Rena Aquatic Supply	AP200	Двухмембранный воздушный насос с регулируемым расходом для аэрации и смешивания сред. 1 требуется.
0,2 μ m поровый шприцевой фильтр	Corning International	431229	Это гарантирует, что воздух из аквариумного насоса не загрязнит аппарат. 1 обязательно.
Slygard 184 Набор силиконовых эластомеров	Dow Corning	Slygard 184	Для микрофлюидного устройства. 1 обязательно.
Американская безопасная бритва GEM Scientific Однолезвийные бритвенные лезвия	Fisher Scientific	17989000	Для резки трубок и PDMS. Требуется 1 лезвие.
Harris Uni-Core дырокол 1,2 мм ID	Sigma-Aldrich	WHAWB100028 ALDRICH	Для пробивки входа/выхода в микрофлюидном устройстве. 1 обязательно.
Защитное стекло микроскопа 22x60-1.5	Fisher Scientific	12-544-G	Для микрофлюидного прибора. 1 обязательно.
Прямоугольная алюминиевая рама с квадратным окном	Custom	Custom	Для поддержки микрофлюидного канала. Внешние размеры: 3 дюйма x 1,25 дюйма. < > Внутренние размеры (вырезанная часть): 7/8 дюйма x 7/8 дюйма< > Толщина: ~1/32 дюйма