Методическая статья

Воротной вены для инъекций модель для изучения печени метастазирования рака молочной железы

44.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54903

⸱

26 декабря 2016 г.

 ,  , 
1Department of Cell, Developmental and Cancer Biology, Oregon Health and Science University

В этой статье

Краткое содержание

Была разработана хирургическая процедура для доставки опухолевых клеток молочной железы в печень мыши через инъекцию воротной вены. Эта модель позволяет исследовать поздние стадии метастазирования в печень у полностью иммунокомпетентного хозяина, включая экстравазацию опухолевых клеток, посев, выживаемость и метастатический рост в печени.

Аннотация

Рак молочной железы является основной причиной, связанной с раком смертности у женщин во всем мире. метастаз печени участвует в свыше 30% случаев с метастазами рака молочной железы, а также приводит к плохим результатам медиана выживаемости только 4,8 - 15 месяцев. Текущие модели на грызунах метастазирования рака молочной железы, в том числе ксенотрансплантата первичной опухолевых клеток и спонтанных моделях опухолей, редко метастазирует в печень. Внутриутробная и внутриселезеночное модели инъекций действительно приводят метастазов в печени, однако эти модели могут быть искажены сопутствующей метастазирования вторичного сайта, либо нарушенным иммунитетом вследствие удаления селезенки, чтобы избежать роста опухоли в месте инъекции. Для того, чтобы удовлетворить потребность в улучшенных моделей метастазов в печени, мышиного воротной вены методом впрыска, который обеспечивает клетки опухоли во-первых, так и непосредственно в печень была разработана. Эта модель обеспечивает опухолевые клетки печени без осложнений сопутствующих метастазов в других органах или удаление селезенки. неавтоматическогоimized портал протокола вены использует небольшие объемы инъекции 5 - 10 мкл, ≥ 32 калибровочных игл и гемостаза марли в месте инъекции, чтобы контролировать потери крови. Воротной вены инъекции подход в BALB / с самок мышей с использованием трех сингенных опухоли молочной железы линии различной степени испытывали метастатический потенциал; 4T1 клетки на высоком метастатическим, умеренно-метастатических D2A1 клетки и низким метастатическим D2.OR клетки. Концентрации ≤ результатов 10000 клеток / инъекции в латентности ~ 20 - 40 дней для развития метастазов в печени с более высоким метастатическим 4Т1 и D2A1 линий и> 55 дней для менее агрессивной D2.OR линии. Эта модель представляет собой важный инструмент для изучения груди метастазирования рака печени, и могут быть применимы к другим видам рака, которые часто метастазирует в печень, включая колоректальный рак поджелудочной железы и аденокарциномы.

Введение

Рак молочной железы метастазы в печень

Печень является общим местом метастазирования рака молочной железы, а также костей и легких 1-3. Метастазов в печени у больных раком молочной железы является независимым прогностическим фактором для очень плохих исходов 4,5, а медиана выживаемости больных раком молочной железы с диапазонами метастазов в печени от 4,8 до 15 месяцев 6-9. В отличие от этого , больных раком молочной железы с легкого или метастазов в кости имеют средние показатели выживаемости 9 до 27,4 месяцев 8,9 и 16,3 до 56 месяцев 8,10-12, соответственно. Метастазирование представляет собой многоэтапный процесс, называемый метастатического каскада, который начинается с распространением опухолевых клеток в первичной опухоли и заканчивается смертности пациентов из - за посевом и выроста циркулирующих опухолевых клеток в отдаленный орган 13-15. Моделях грызунов метастаз показали, что метастатический каскад удивительно неэффективным, только 0,02 - 10%циркулирующих опухолевых клеток , устанавливающих откровенного метастазирование 16,17. Одним из основных узких мест метастатической неэффективности продиктован уникальной микросреды ткани на вторичных участках, называемых метастатических нишах 18, подчеркивая важность понимания по конкретным участкам метастазирования. Метастатический ниша является уникальным для сайта рецидива, и, в частности, характеризуется отложением различных белков внеклеточного матрикса 19,20, инфильтрацией различных популяциях клеток иммунной системы , а также 21-23 измененном гомеостаза ткани , включая дизрегуляции производства многочисленных цитокинов, хемокины и факторы роста 15,18,24,25. Таким образом, понимание ткани специфической нише метастатическим предшествует понимание того, как целевой метастазирования. Тем не менее, надежные модели метастазов в печени отсутствуют. Кроме того, улучшенные модели метастазов в печени будет иметь важное значение для определения новых целей и эффективных методов лечения больных раком молочной железы Wiй метастазы в печень.

Основанная модели , чтобы изучить Рак молочной железы метастазы в печени

В настоящее время имеющиеся модели для изучения метастазирование рака молочной железы в печень включают ксенотрансплантатов раковых клеток человека в иммунных мышей скомпрометирована. Эти модели , как правило , используют хорошо изученные человеческие клеточные линии рака молочной железы , такие как MCF-7 и MDA-MB-231 и Ню, RAG1 - / - или SCID иммунные скомпрометированы мышиные хозяев 26-29. Ксенотрансплантата модели обеспечивают преимущество с участием клеточных линий рака человека происходит, однако, учитывая недавнюю оценку для иммунных клеток в метастазирования 30-32 и в терапевтической резистентности 33-35, исследование метастазирования в полностью иммунокомпетентных хозяина имеет первостепенное значение. Модели для изучения груди метастазирования рака печени в иммунокомпетентных хозяев включают ортотопической инъекции сингенных опухолевых клеток (например, 4T1 и D2A1 клеточных линий) в жировой ткани молочных желез, с или без хирургическогорезекцию первичной опухоли, и последующая оценка метастаз 36-38. Следует отметить, что скорость метастазов в печени из моделей ортотопической трансплантации является очень низким или несуществующим по сравнению с другими метастазами , таких как легкие 39,40, или происходит после того, как установлено метастаз легких, что затрудняет исследование печени конкретных метастазирования 37,39 ,

Опухолевые эксплантов из спонтанных генетически модифицированных моделей рака молочной железы может быть повторно введен в молочных жировым наивных хозяев как сингенных опухолевых клеток. Например, недавно было сообщено , что спонтанные опухоли от K14 Cre ECAD F / F P53 F / F мышей, которые модель инвазивный рак молочной железы очаговая, развиваются опухоли , когда ортотопически вводят в дикого типа хозяев. После хирургической резекции этих опухолей , как только они достигают 15 мм 2, 18% мышей прогрессировали до метастазов в печени 40,41. Третий подход к модели метастазов в печень используетспонтанное метастазирование в генетически модифицированных мышей. На сегодняшний день сообщения о спонтанных мышиных моделях рака молочной железы, что метастаз легко распространился на печень являются редкостью. Исключение составляют H19-Igf2, р53 Fp / Fp MMTV-Cre Wap-Cre, а K14 Cre ECAD F / F P53 F / F генетически модифицированных моделей мышей, где метастаз печени развивается в низкий процент мышей 38,41- 43. Таким образом, в то время как с помощью генной инженерии мышиные модели способствуют изучению всех этапов метастатического каскада, предоставляя мощные и клинически значимые модели, они ограничены в связи с низкими показателями метастазирования 38 печени.

Несколько моделей метастазирование обходят начальные шаги метастатического каскада включая распространение опухолевых клеток из первичной опухоли и intravasation. Эти модели позволяют расследование поздних стадий метастатического каскада, от транссудации к созданию опухолей на вторичных сайтов. INTracardiac модель инъекции обеспечивает выход опухолевых клеток в левый желудочек, который распределяет опухолевые клетки в кровеносную систему через аорту. Внутриутробная инъекции требует ультразвуковой визуализации руководствовались в месте инъекции или другие методы визуализации, такие как биолюминесценции люциферазы меченой клетки для подтверждения успешного инъекции. Инъекции опухолевых клеток с помощью левого желудочка , может привести к кости, мозга, легких, и / или метастазов в печени, среди других органов 44-48. Из-за метастазов полиорганной, эти мыши часто должны быть умерщвлены до развития явных признаков метастазов в печени, отрицая возможность полностью исследовать метастатического роста в печени. Альтернативный подход, который значительно минимизирует развитие нескольких площадок метастазирования является внутриселезеночное модель инъекции. Внутриселезеночное инъекции обеспечивает опухолевые клетки через селезеночной вены , которая соединяется с верхней брыжеечной вены , чтобы стать воротной вены 49,50. Животные могут быть проверены для outgrowth метастатических очагов в печени , так как образование метастазов в других местах редко, и , как результат, общее состояние здоровья животного поддерживается 49,50. Тем не менее, важно отметить , что внутриселезеночный модель требует спленэктомии , чтобы избежать селезеночной опухолей 49,50, процедура , которая влияет на иммунную функцию. Например, инфаркт ишемия реперфузии характеризуется инфильтрацией Ly6C + моноцитов подмножеств , которые исходят из селезенки и отвечают за фагоцитарной и протеолитической активности во время заживления ран после ишемии 51,52. С спленэктомии, происходит заметное сокращение популяции моноцитов , которые помогают в заживлении ран 52. Кроме того, спленэктомии было показано , чтобы уменьшить рост первичной опухоли и метастаз легкого в модели рака немелкоклеточного рака легкого, в частности , за счет снижения числа циркулирующих и внутри опухоли CCR2 + CD11b + Ly6C + моноцитов миелоID клетки 53. Кроме того, спленэктомия следующие внутриселезеночное инъекции раковых клеток толстой кишки приводит к снижению уровня противоопухолевых естественных клеток - киллеров в брыжеечных лимфатических узлов и повышенной метастаз печени 54. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что спленэктомия ставит под угрозу роль иммунной системы с последующими последствиями для метастатической судьбы клеток.

Воротной вене Инъекции Модель печени метастазами

Для исследования молочной железы метастазирования рака в печень в полностью иммунокомпетентных хозяина в условиях, когда мышей не подвергаются риску из-за метастазов полиорганной, была разработана модель инъекции воротной вены. Внутрипортальной модели для инъекций использовались ранее для изучения метастазов печени колоректальной 55,56 и меланому 16 клеточных линий; Здесь мы опишем применение внутрипортальной инъекции для моделирования сингенную молочной метастазов опухолевых клеток. Эта модель может быть использована для изученияпоздние стадии метастатического каскада, включая экстравазации клеток рака молочной железы и посевом, опухолевых клеток решения судьбы относительно смерти / пролиферации / дремоты и выроста в откровенных поражений. В этой модели сингенных молочной линии опухолевых клеток инъецируют через воротную вену иммунокомпетентных самок мышей линии BALB / C, способ , который обеспечивает опухолевые клетки , во - первых , и непосредственно в печень без удаления селезенки. Для разработки этой модели, использование четырех молочных линий опухолевых клеток, которые варьируются в их метастатической способности от низкого до высокого использовались: D2.OR, D2A1 и 4T1, и использовали D2A1 маркированный зеленого флуоресцентного белка (GFP-D2A1) до исследовать раннее время-очков после инъекции опухолевых клеток. 4T1 является весьма метастатическим клеточная линия происходит от 410.4 опухоли, спонтанно возникшей в ВОМЖМ + BALB / C самки мыши 36,37 и метастазирует в легкие, печень, мозг и кости из жировой ткани молочных желез первичных опухолей 39,57,58. Опухолевые клетки D2A1 WERе также первоначально получена от спонтанной опухоли молочной железы , возникающего в BALB / C хозяина после пересадки D2 гиперпластических альвеолярных клубеньковых клеток, и подтверждено, что метастатические из первичной опухоли в легких 59,60. D2.OR опухолевые клетки являются неметастатической сестра линии к D2A1 линии и, хотя они избегают первичной опухоли и прийти вторичных сайтов, они редко устанавливают отдаленные метастазы 60,61.

Кроме того, важно избегать использования широко используемых препаратов управления боли, включая нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) во время или после хирургической процедуры. НПВС имеют противоопухолевую активность в некоторых видов рака молочной железы 62-65, а некоторые классы НПВС увеличивают риск гепатотоксичности 66,67, потенциально ставя под угрозу исследование метастаза печени и метастатический печени нишу. Кроме того, исследования показывают, что НПВС оказывают непосредственное влияние на микросреду ткани, уменьшая про-метастатического добracellular матричные белки тенасцину-C 68 и фибриллярный коллаген 62,65. В качестве альтернативы, использование опиоидного производного, бупренорфин, был использован из - за его эффективности в управлении грызун боли 69 и из - за отсутствия доказательств , что опиоиды имеют противоопухолевую активность 70. Эта модель инъекции воротной вены была оптимизирована для небольших объемов инъекции 5 - 10 мкл, чтобы избежать ненужного повреждения печени. Модель была также оптимизирована для включения иглы с меньшим диаметром (≥ 32 калибра) и использования гемостатической марли сразу после инъекции, чтобы свести к минимуму потери крови во время процедуры. В отличие от этих оптимизированных параметров закачки, количество клеток должно быть определено на индивидуальной основе, на основе онкогенного потенциала клеточной линии. Тем не менее, начиная с ≤ 10000 клеток / инъекций для долгосрочных исследований рекомендуется. Для более коротких конечных точек (например, 24 ч после инъекции) значительно больше опухолевых клеток (например,1 х 10 5 - 1 × 10 6) , может быть использован , если оправдано. Таким образом, инъекции модель воротной вены подробно описаны здесь представляет собой полезный инструмент для изучения метастазов рака молочной железы в печень и обходит ряд ограничений других моделей метастазов в печени. Эта модель облегчает изучение опухолевых клеток экстравазации, посевом, ранние судьбы решений выживания, пролиферации и покоя, и метастатическим выроста в иммунокомпетентных мышиных хозяев.

Протокол

Все процедуры на животных в этой статье были рассмотрены и одобрены Oregon Health & Science University Институциональные уходу и использованию животных комитета.

1. Подготовка хирургической области и инструменты

  1. Приготовьте ножницы, пинцет и кровоостанавливающего автоклавированием при 124 ° С в течение 30 мин, 1 - 2 дня до проведения запланированных операций. Обеспечить доступ к автоклавного или стерильно постельных принадлежностей, клетки, и пищи для послеоперационного восстановления.
  2. Готовят асептический хирургическую область, предпочтительно в колпаке с ламинарным потоком.
    1. Протрите все поверхности хирургической области с 10% хлорной извести, в том числе грелку, источник света, анестезию НКТ и носового конуса, а также какой-либо другой части хирургического набора, которые будут находиться в непосредственной близости от хирургического вмешательства в то время как она выполняется ,
    2. В асептической хирургической области, место очищено грелку с Салфетка стерильная, источник света, анестезии и трубки, головная часть инсулина шприцы, 1 мл шприцы, бупивакаина, искусственные слезы, стерильный физиологический раствор, 2 х 2 "стерильные марлевые тампоны, 4 х 4" стерильной марли, кровоостанавливающее марли разрезают на 0,5 - 1 см 2 шт, ножницы, пинцеты, кровоостанавливающего, 4-0 викрил швами с тонкой игле, и 50 мл 2% хлоргексидина глюконата в качестве автоклавного контейнера.
    3. Убедитесь в том, что есть место в этом пространстве для подготовленных опухолевых клеток, хранящихся на льду.
    4. На скамейке, прилегающей к хирургической области, подготовить область восстановления со второй грелку и чистые клетки со стерильным постельных принадлежностей.
      Примечание: Эта область может также дома такие предметы, как шарик стерилизатор.

2. Инъекции воротной вене

  1. Один час до запланированных инъекций, лечения BALB / с самок мышей в возрасте 8 - 15 недель с 100 мкл 0,015 мг / мл бупренорфина, подкожно, для лечения боли.
    Примечание: Этот протокол инъекции может быть применен к любому штамму женской или мужской мыши в любом возрасте, с использованием соответствующихклеточные линии для изменений штамма.
  2. Подготовка опухолевых клеток для инъекций, основанные на протоколах для линии клеток или опухоли эксплантов выбора. Проверьте все линии опухолевых клеток перед введением на наличие мышиных патогенов, чтобы уменьшить риск введения таких патогенных микроорганизмов в животных колонии.
    1. Для сингенных опухолевых клеточных линий BALB / C включая D2A1, D2.OR и опухолевых клеток 4Т1, оттаивание клеток в 10 см культуре ткани планшете за 3 дня до инъекции таким образом, что на следующий день клетки при ~ 90 - 100% сплошности.
    2. клеток после опухоль оттепели мыть клетки 1 день один раз с 1x фосфатным буферным раствором (PBS) и Trypsinize опухолевых клеток с использованием сливающийся 2 мл 0,05% трипсина при 37 ° С в течение 5 мин. Добавить 8 мл полной среды (DMEM высокий уровень глюкозы, 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, и 1x пенициллина / стрептомицина) и прохождение 1:10 в свежую 10-см чашку с 10 мл полной среды.
    3. В день инъекции, мыть клетки один раз с 1x PBS и тrypsinize, как описано выше.
    4. Ресуспендируют трипсином клетки в 8 мл полной среды, спина в течение 5 мин при 1500 XG, удалите СМИ и ресуспендируют в 5 мл 1x PBS.
    5. Граф клеток на гемоцитометра с использованием трипанового синего для оценки жизнеспособности. Ресуспендируют клетки для инъекций в 1X PBS в заранее определенной концентрации и объема.
      Примечание: 5 - 10 мкл рекомендуется как меньшие объемы впрыска предотвратить ненужное повреждение печени.
    6. Сохранить клетки на льду в течение всего срока инъекций. После завершения инъекции, возвращают образец клеток в лабораторию и место в культуре в полной среде в течение 1 дня, чтобы обеспечить жизнеспособность.
  3. Место мыши под анестезией с 2 ​​- 2,5% изофлуран (2-хлор-2- (дифторметокси) -1,1,1-трифтор-этан) поставляется в кислороде. Поддерживать температуру тела с помощью грелки. Обеспечить полное обезболивание путем оценки для реакции на носок щепотку, а затем поддерживать anesthe2 в ООО - 2,5% изофлуран.
    Примечание: Важно, чтобы контролировать животных частоту дыхания и регулировать изофлуран скорости потока соответственно в течение всей процедуры.
  4. Поместите небольшое количество искусственных слез или ветеринаром мази на каждый глаз, чтобы избежать чрезмерного высыхания глаз во время хирургической процедуры.
  5. Поместите мышь в положении лежа на спине, на спине с живота подвергается.
  6. Удалить волосы на вентральной левой стороне грызуна от второго ребра пространства вплоть до паховой молочной железы сосок на 4 - м протиранием области с химической удаления волос. Дайте депиляторный сидеть в течение 1 - 2 мин , а затем полностью удалить с марлей и H 2 O. Этот шаг можно сделать 1 - 2 дня заранее , чтобы сэкономить время , если многочисленные операции планируются.
  7. Возьмите одну 2 х 2 "стерильной марлевой губки (смоченной в 2% Хлоргексидин) и протирать мышь на месте удаления волос. Стерилизовать все окружающее пространство, в том числе за хвост, чтобы свести к минимуму бактериальное продаминирование инструментов.
  8. Протрите место удаления волос и окрестностей вниз спиртовой подготовительную площадку.
  9. Повторите 2% хлоргексидин и алкоголь шаги еще раз и закончить с окончательным Хлоргексидин вытирать в общей сложности три 2% хлоргексидин и двух промываний спирт Prep колодки. Есть ли протирать такие окончательное хлоргексидина, что химическое вещество не капает вокруг хирургического участка, чтобы избежать попадания хлоргексидин на внутренние органы. Примечание: Применение больших количеств хлоргексидина и спирта на кожу и окружающие мех, может привести к существенному снижению температуры тела. Не протирайте избыточного объема во время этапов 2.7-2.9. Поддержание температуры тела с грелку.
  10. Использование стерильных перчаток и стерилизованного скальпель стерильным лезвием, сделать один 1-дюймовый разрез в коже между средним и сагиттальной плоскостях на левой стороне мыши, начиная чуть ниже ребер и заканчивая чуть выше плоскости четвертого паховых молочная железа сосков.
  11. Использование автоклавного или гранула стерилизованные ножницы и пинцет, сделать подобный 1-дюймовый разрез в брюшину. Избегайте резки в жировой ткани молочных желез и обеспечить, чтобы не порезать кишечник, печень, или диафрагму.
  12. Поместите 4 х 4 "марлевым тампоном, пропитанным стерильным физиологическим раствором на левой стороне мыши, где был сделан надрез, таким образом, что внутренние органы могут быть размещены на марлю и не вступают в контакт с окружающими участками кожи или хирургической области.
  13. Подготовка опухолевых клеток с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, как опухолевые клетки будут оседать в процессе подготовки мыши. Готовят 25 мкл съемную иглу шприца и 32 калибра иглу с опухолевыми клетками. Нажмите на шприц, пока опухолевые клетки не находятся на острие иглы и поршень находится в соответствующем объеме для инъекций; избежать инъекции пузырьков воздуха.
  14. Протрите наружную поверхность иглы со стерильным спирта площадку для удаления каких-либо внешних опухолевых клеток. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать уколов.
  15. Держите медианный SIDе разреза, в том числе кожи и брюшную подкладке, в сторону с пинцетом и использовать стерильный ватный тампон, чтобы аккуратно придерживая большие и маленькие кишок наружу, размещая их на стерильной марлей, смоченной в стерильном физиологическом растворе. Вытащите большие и малые кишечники, пока воротной вены не визуализируется.
  16. Накройте внутренние органы в солевом пропитанной марли для поддержания внутренней влаги и стерильность.
  17. Попросите помощника, а также носить стерильные перчатки, держите кишечник, завернутые в солевом пропитанной марли аккуратно из пути с помощью стерильного хлопка наконечником тампоном, чтобы полностью раскрыть воротной вены. Кроме того, может возникнуть необходимость использовать автоклавного кровоостанавливающего или пинцет, чтобы удерживать ткани в сторону от средней части разреза.
  18. Вставьте иглу, загруженной с опухолевыми клетками ~ 3 - 5 мм в портальную вену ~ 10 мм ниже печени под углом <5 ° к вене, с конической и цилиндрической лицевой стороной вверх. Медленно введите полный объем, содержащий опухолевые клетки. Разрешить крови течь мимо иглы чСвинец в течение нескольких секунд, чтобы избежать обратного потока опухолевых клеток из вены. Сведение к минимуму перемещения иглы в вену во время инъекции. Опять же, будьте осторожны, чтобы избежать уколов.
    Примечание: Визуализация воротной вене делается без увеличения, однако стерео микроскоп может быть использован, если предпочтительнее.
  19. Удалите иглу, одновременно помещая стерильного ватного наконечника аппликатора на вены с давлением. С помощник все еще держа кишок в сторону поместить одну часть 0,5 - 1 см 2 гемостатической марли над местом инъекции на вены.
    Примечание: Гемостатическое порошок также пытался для этого шага в протоколе, но не был эффективен в предотвращении венозной потери крови после инъекции.
  20. Держите кровоостанавливающее марлю в месте инъекции с давлением со стерильным ватным наконечником аппликатора в течение 5 мин.
  21. Оценка закрытие вены, осторожно поднимая кровоостанавливающее марлю, если марлевых прилипает к окружающей ткани, небольшое количество Sterilе солевой раствор может быть использован, чтобы впитать и поднимите марлю.
  22. Если потеря крови происходит в это время, поместите дополнительный кусок гемостаза марли на участке с давлением в течение еще 5 мин. Когда поток крови полностью прекратилось, удалите марлю с помощью мыши.
    Примечание: Потеря крови во время хирургической процедуры должны быть тщательно оценены, и если общий допустимый объем потери крови или превышаются (на основе нормативных стандартных операционных процедур для плат организационного обзора следователя) мышь должна быть умерщвлены в то время как под наркозом сердечной перфузии.
  23. После того, как место инъекции считается неповрежденным, без крови, оставляя место инъекции, поместите внутренние органы аккуратно обратно в брюшную полость.
  24. Шовный брюшную подкладке, а затем кожу стерильной 4-0 викрил швом и тонкой игле, используя простой непрерывный или прерывистый шаблон шовного. Как правило, закрытие надрез требует 10-15 наложения швов.
  25. Вводят 100 мкл BUPIvacaine (5 мг / мл) вдоль участка разреза для местного лечения боли с использованием инсулиновый шприц. Вводят 0,5 мл стерильного физиологического раствора, подкожно с помощью шприца на 1 мл с 26-го калибра иглы для гидратации. Хирургии занять 15 - 25 минут, чтобы закончить.
  26. Для поддержания стерильных условий на протяжении операции, убедитесь, что все инструменты и материалы, вступая в контакт с мышью, в том числе в перчатке, очищаются надлежащим образом перед контактом. Там, где возможно использование стерильных материалов и перчатки, или минимально использовать 70% раствор этанола или 10% раствор хлорной извести для очистки.
  27. Если несколько операций запланированы на одной сессии римейк начальную хирургическую область со свежей стерильной драпировки, инсулиновые шприцы, 1 мл шприцы, стерильный физиологический раствор, 2 х 2 "стерильный марлевые тампоны, 4 х 4" стерильной марли, кровоостанавливающее марли нарезать 0,5 - 1 см 2 шт, 4-0 викрил швы с коническим иглой и 2% хлоргексидина. Бусина-стерилизовать ножницы, пинцет и кровоостанавливающего между ними операций и позволяютдля адекватного охлаждения перед повторным использованием.

3. Восстановление, мониторинг здоровья, грызунов и оконечная Анализы

  1. После того, как хирургическая процедура будет завершена, сохранить мышей на грелку для восстановления в постельных свободных, чистых клетках в течение как минимум 20 мин. Мыши, как правило, берут 2 - 4 мин, чтобы проснуться от наркоза.
  2. Не возвращать животное, которое перенес операцию на сожительство с другими животными, пока она полностью не оправилась от наркоза. Не оставляйте животное без присмотра приходя в сознание, и контролировать, пока животное не восстановила способность поддерживать себя в грудины лежачее.
  3. Дайте мышам 0,05 - 0,1 мг / кг бупренорфина для лечения боли каждые 6-12 ч после операции, на срок до 72 часов.
  4. Проверьте швы ежедневно, чтобы гарантировать, что они остаются нетронутыми в процессе заживления. В случае, когда шовный материал развязались, поместите мышь под наркозом, удалите оставшиеся швы, и заменить. В случае инфекции или Inflammвания консультации сотрудников ветеринара.
    Примечание: Инфекция или воспаление не сталкивался с этим протоколом.
  5. Для исследований метастазирования, выполнять ежедневные проверки здоровья до внешних признаков метастатического заболевания не наблюдаются в том числе, но не ограничиваясь ими:> 10% веса потери / усиления, scruffiness, потеря внимания к обстановке, брюшные отеки / асцит, светлые глаза и уши, или сутулой положение.
    Примечание: Ежедневные проверки состояния здоровья особенно важны при разработке модели для использования с новой клеточной линии или концентрации клеток, пока график метастазирования не очень хорошо понял.
  6. В исследовании конечной точки, усыпить мышей CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
    Примечание: Альтернативные методы эвтаназии, утвержденных комитетом по надзору следователей могут быть использованы, в том числе с перфузией 1x PBS в то время как под наркозом. Кровоснабжение печени осуществляется cannulating воротной вены, отрезая нижнюю полую вену, и толкая 1x PBS-гогрубая сосудистая сеть печени со скоростью 4 мл / мин в течение 1 - 2 мин, чтобы удалить циркулирующей крови и лейкоциты.
    Примечание: В зависимости от конечной точки для исследования, линии клеток и используемой концентрации, оверт метастаз печени может быть или может не быть очевидными при аутопсии. Микрометастатической повреждения могут быть выявлены с гистологическим анализом печени. Endpoints будет варьироваться в зависимости от дизайна исследования.
  7. Экстракт печени с ножницами и пинцетом сначала удалением желчного пузыря, а затем вырезать через нижнюю полую вену превосходит печень. Вырезать через полую вену, воротной вены и печеночной артерии уступает печени.
  8. Удалите всю печень мягко и промыть 5x в 1x PBS.
  9. Отделите печень в влево, вправо, срединных и хвостатых долей.
  10. Формалин затруднительное печени в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 48 часов при встряхивании при комнатной температуре. Процесс тканей с помощью ряда спиртов в увеличении концентрации и ксилол; парафин встраивать неподвижную ткань 71 .
    Примечание: В качестве альтернативы, печень может быть быстро замораживают путем размещения ткани в cryomold с оптимальной температурой резания (ОКТ) формулы и замораживание на гранул сухого льда, погруженных в 95% этаноле.
    1. Используя микротом, срезанные в блок тканей парафином таким образом, что размер матч головки ткани выявлено.
    2. Вырезать пять 4-микронных серийных срезов, это представляет собой первый уровень для анализа.
    3. Разрезать 250 микрон ткани, выбросить эти разделы в отходах.
    4. В 250 микрон сократить второй уровень пяти 4-микронных серийных срезах.
    5. Повторите по мере необходимости для раздела через весь печени. Гематоксилином и эозином пятно первая часть каждого уровня для оценки для метастазирования 72.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для быстро замораживают ткани использовать криостат вырезать секции.
      Примечание: Обнаружение микрометастатической болезни потребуется специальное окрашивание опухолевых клеток.
  11. Удалить мышей из исследования, если есть рост опухоли в разрез сидетье, так как это указывает на утечку опухолевых клеток в брюшную полость после инъекции.
    Примечание: Эта проблема не наблюдается.

Результаты

Модель инъекции воротной вены, в которых опухолевые клетки доставляются непосредственно в печень с помощью хирургической процедуры, позволяет инъекции опухолевых клеток в портальную вену. Под антисептических условиях, в наркозом мыши, а ~ 1-дюймовый хирургический надрез на левой стороне мыши между средним и сагиттальной плоскостях, начиная чуть выше плоскости четвертого паховых молочных желез соском железы и заканчивая чуть ниже ребер , Большие и малые кишечники осторожно протягивают через разрез , чтобы обеспечить визуализацию воротной вены (рис 1А). Точная анатомический идентификация воротной вены и успешной инъекции внутри портала может быть подтверждена путем практиковать протокол впрыска тушью или аналогичным красителем. Правильное инъекции через воротную вену приведет к чернилам , они будут немедленно и специально доставлены в печень, и не приведет к тушью распространения в легкие (FIGURe 1В). Кроме того, с помощью D2A1 молочной железы мышей опухолевые клетки , маркированные с GFP, рассеивание опухолевых клеток по всему печени проявляется на девяносто минут после инъекции, подтвердив портальной вены доставки инъекционного в печень (рис 1C). При большем увеличении становится очевидным , что через 90 мин после инъекции опухолевых клеток обнаруживаются в синусоиды, а также в пределах паренхимы печени в непосредственной близости от портальных триад, где воротной вены кровь поступает в печень (фиг.1С). Эти данные свидетельствуют о том, что активная ячейка опухоли кровоизлияние происходит в 90 мин после инъекции опухолевых клеток. Взятые вместе, эти данные подтверждают, что модель инъекции воротной вены доставляет объем впрыска непосредственно в печень, с использованием чернил или опухолевых клеток, диспергированных в печени и без заметного переноса объема впрыска в легкие.

Для оценки устойчивости вены модели впрыска портала, три Separсъела сингенных молочной железы мышей линии опухолевых клеток были протестированы в взрослых самок мышей линии BALB / C. Эти опухоли молочной железы линии были выбраны на основе их характеризующейся поведения в молочных моделях жировой ткани и включают в себя весьма агрессивно и метастатического 4Т1 клеточную линию, тем менее агрессивную метастатического D2A1 линию, а также низкий / неметастатической D2.OR линии 37,61,73 , 74. 2000 и 10000 клеток на инъекцию были протестированы без каких-либо заметных различий во времени до развития явных признаков метастазирования с этими концентрациями низких клеток. Для этих исследований суррогатные маркеры метастазирования были использованы такие, как отсутствие груминга, бледность, и потеря веса, чтобы оправдать аутопсии, на которых наличие или отсутствие метастазов в печени были подтверждены путем визуальной оценки печени и других органов для подтверждения доставки внутри портала , Эти данные подтверждают предыдущие сообщения о том, что клеточные линии 4Т1 и D2A1 представляют более агрессивные опухоли молочной железы линии, так как наблюдаются короче метастазирование свободного выживаемость по сравнению с мышей, которым вводилис менее агрессивной D2.OR линии (фиг.2А). Мышей , которым вводили 4T1 или D2A1 опухолевые клетки развитом откровенного метастазов в печени по ~ 30 - 40 дней после инъекции, а некоторые развитые метастазирование уже через 18 дней после инъекции (рис 2А), в то время как только одна мышь вводили D2.OR клетки имели развитая откровенное метастаз печени к концу исследования, которое было 60 - 65 дней после инъекции клеток опухоли. Метастазы были впоследствии подтверждены секционирования через печень в уровне 250 мкм и анализ гематоксилином и эозином (Н & Е) (окрашенные срезы Рисунок 2B-D).

В дополнение к обнаружению откровенных метастатических очагов в печени мышей, модель воротной вены также может быть использован для изучения ранних событий в метастатического каскада, включая обнаружение одиночных клеток / кластеров клеток после транссудации и формирования микро-метастатических поражений. Мультиплекс иммунофлюоресценции окрашивания был использовандля обнаружения 4T1, D2A1 и D2.OR молочной опухолевых клеток в печени, когда они присутствуют в виде отдельных клеток или микроорганизмов метастатических поражений, а Н & Е не является достаточным, чтобы подтвердить наличие небольших поражений. На фиг.3А показана репрезентативная BALB / C печени мышей с мнимого микрометастатической очагов опухолевых клеток D2A1 , которые являются положительными для эпителиального кератина CK18, отрицательным для маркера CD45 пан-иммунной, так и отрицательные для гепатоцитов маркера Heppar-1. Гепатоцитов также пятно положительным для CK18, что требует использования Heppar-1 в этом окрашиванием панели. Важно отметить, что эпителий желчных протоков и печени клетки - предшественники окрасить положительно для CK18, требует тщательного дискриминации между опухолевыми клетками и желчных протоков, особенно при оценке перипортальных регионов (рис 3А). Альтернатива мультиплекс иммунофлюоресценции для идентификации отдельных клеток и распространяемые микрометастатической фокусов использовать сингенных молочных желез опухолевых линий с меткой расширенной зеленого флуоресцентногобелок (EGFP) и / или люциферазы и выполнять IHC для тега (Рисунок 1С). Из - за иммуногенности EGFP, люциферазы, а также другие белки, необходимо использовать модели мыши, которые толеризованной к этим белкам, например, нового иммунокомпетентных "сияющего головы" мыши , которые экспрессируют EGFP и люциферазы в передней доле гипофиза 75. Для идентификации macrometastatic поражений непомеченным сингенных линий , таких как линии опухоли D2A1, мультиплекс иммунофлюоресценции CK18 / Heppar-1 / CD45 идеально (рис 3B).

figure-results-1
Рисунок 1: воротной вене Инъекции Обеспечивает опухолевых клеток непосредственно в печень. A) инъекции портальной вены; надрез делается между средним и левым сагиттальной плоскостях, сверху плоскостью четвертого паховых молочной железы сосок и заканчивая чуть ниже Р.И.б клетка. Б) BALB / C печени с PBS инъекций (слева). После инъекции чернил Индии через портальную вену, печень (средний), но не легких (справа) принимает чернила. С) Представительные шлифа изображения D2A1 молочной железы мыши опухолевых клеток , помеченных GFP в / с печени мышей Balb через 90 мин после инъекции 1 × 10 6 опухолевых клеток через воротную вену. Печени формалином парафиновых, разрезали и окрашивали анти-GFP антител для обнаружения опухолевых клеток. Верхняя панель показывает темно-коричневые запятнанные опухолевые клетки (стрелки), рассеянных по всему печени, звездочка обозначает неспецифическое окрашивание гепатоцитов вокруг центральных вен; Шкала бар = 300 мкм. Нижние панели показывают репрезентативные изображения опухолевых клеток через 90 мин после инъекции по-прежнему тесно связаны с сосудистой сетью; Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2: разрастание опухоли молочной железы мышей линий клеток в печени После воротной вене инъекций. A) Каплана-Мейера кривая , показывающая Безметастатическая уровень выживаемости мышей , которым вводили 2,000-10,000 4T1, D2A1 или опухоли молочной железы мыши D2.OR клеток. Мышам вводили опухолевые клетки и мониторинг на наличие признаков метастазирования включая отсутствие груминга, светлые глаза, и изменения веса. Метастазы было подтверждено во время аутопсии и H & E на гистологических срезах печени. N = 2 4T1 2000 клеток; 2 4T1 10000 клеток. N = 2 D2A1 2000 клеток; 3 D2A1 10000 клеток. N = 3 D2.OR 2000 клеток; 3 D2.OR 10000 клеток. Представитель H & E изображения B) 4Т1 поражения на 21 -й день после инъекции 10000 клеток, C) D2A1 поражений на 26 -й день после инъекции 10000 опухолевых клеток, и D) D2.OR поражения в59 дней после инъекции 10000 клеток; масштабные линейки = 75 мкм. Аналогичные повреждения наблюдаются при впрыскивали 2000 4T1 или D2A1 опухолевых клеток. Нет поражений не были обнаружены с 2000 D2.OR клеток. Никаких признаков метастазирования в других органах или в хирургическом месте разреза не было видно в любой мыши на этих исследованиях. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 3: Обнаружение одиночных клеток и метастатических поражениях в печени мышей с использованием Multiplex иммунофлюоресценции. А) Представитель мультиплекс иммунофлюоресценции опухолевых клеток D2A1 в / с печени мышей Balb через 90 мин после инъекции с использованием модели инъекции воротной вены. Окрашивание проводили с помощью мультиплексного набора. Слева направо показывает DAPI; CD45 отметить лейкоциты; Heppar-1 омрачатьК гепатоциты; и CK18 отметить опухолевые клетки, гепатоциты и эпителий желчных протоков. Merged изображение показывает предполагаемую кластер CK18 + Heppar-1 - CD45 - D2A1 опухолевых клеток , тесно связанных с порталом триады. Стрелка = опухолевые клетки D2A1, звездочка = эпителий желчных протоков; Шкала бар = 25 мкм. Б) Представитель откровенное D2A1 метастатического поражения с использованием той же панели окрашивания , как и в A. опухолевые клетки являются CK18 + , тогда как соседние гепатоциты CK18 + Heppar-1 +; Шкала бар = 25 мкм. Изображения были захвачены на микроскоп с 20 х 0,8, 40 х 1,3 и 60 х 1.4 Цели и ПЗС-камеры, с помощью программного обеспечения микроскопа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Balb / с портала мыши модель инъекции вены позволяет исследовать поражений молочной железы в печени при отсутствии искажающего метастазирования полиорганной и в полностью иммунокомпетентных хозяина. Наш протокол является продвижение ранее опубликованных хирургических процедур , которые позволяют доступ к воротной вены для инъекции опухолевых клеток непосредственно в печень 16,55,56. Один продвижение мы сделали это , чтобы значительно уменьшить число инжектированных опухолевых клеток от ≥ 1 × 10 5 клеток / нагнетательных 16,55,56 вниз до ≤ 10000 опухолевых клеток / инъекцию. Мы также расширили модель для изучения метастазов рака молочной железы в печень. Используя этот протокол, два молочных линий раковых клеток с известными метастатическим потенциалом развиваются метастазы в печень с короткой задержкой, чем более покоящейся молочной линии опухолевых клеток. Кроме того, в ранние моменты времени, опухолевые клетки распределены по всей паренхимы печени в виде одиночных или небольших групп одного CELLS после инъекции опухолевых клеток. Модель готова для решения вопросов метастатической эффективности, включая клетки экстравазации опухоли, выживаемости клеток, покоем и пролиферации - все фенотипы, которые вносят вклад в развитие микро-метастатического и откровенного метастазами в печени.

Важно учитывать множество аспектов протокола инъекции портальной вены до начала исследования. Тщательно решая на клеточных линиях, концентрации клеток, общего числа клеток, так и для конечных точек интереса на основе небольших разведочных исследований настоятельно рекомендуется. Кроме того, использование иммунокомпетентных хостов и сингенных клеточных линий, имеет огромное значение для понимания взаимодействия хост-опухолевых клеток. Недавно разработанный "светящегося голова" мышь , которая выражает EGFP и люциферазы из передней доли гипофиза является важным инструментом для устранения ответов хозяина на экзогенный EGFP и люциферазы, белки часто используются , чтобы пометить опухоли молочной железы линии 75 . Использование "светящиеся головы" мыши и сингенных помечено опухолевые клетки будут способствовать простой идентификации отдельных клеток, распространяемых и микрометастатической фокусы по IHC без беспокойства воспалительных реакций на EGFP или люциферазы. Точно так же, выбирая стратегии управления боли тщательно, чтобы обеспечить минимальное воздействие анти- или про-опухоли от режима лечения препарат настоятельно рекомендуется. Критические шаги в этом протоколе включают поддержание стерильных условий на протяжении операций, чтобы гарантировать, что заражение не происходит, так как это будет посрамить никаких результатов. Важно также, что игла правильно помещен в воротную вену, чтобы гарантировать, что опухолевые клетки, доставляются в печень. Практикующий протокол с красителями, такими как тушью поможет с этим вопросом. Рост опухоли на месте разреза кожи является лучшим показателем того, что произошло неправильное размещение иглы. И, наконец, очень важно, что потеря крови из воротной вены адекватно контролируется и прекращается полностью до suturiнг животное. Использование гемостатической марли значительно снижает риск неконтролируемой потери крови из воротной вены после инъекции. В наших руках, смертность, связанная с процедурными из-за потери крови из воротной вены после инъекции была снижена с 30% до 2% мышей с использованием гемостатической марли.

Важно отметить, что модель инъекции воротной вены не копирует полный метастатического каскада, но ограничивается изучением опухолевых клеток транссудации, опухолевая клетка-ниша взаимодействий следующий транссудации и опухолевого роста. Модели, которые точно копируют полную метастатического каскада в печень, как это происходит у больных, срочно необходимы. Дополнительное ограничение модели инъекционного воротной вены является то , что она путает влияния операции на хозяина, с заживлением раны, воздействующие прогрессирование заболевания 76,77.

Модель инъекции воротной вены представляет собой улучшение на другой инъекциимодели для изучения метастазов в печени, в том числе внутрисердечной и внутриселезеночное моделей. В частности, модель инъекции воротной вены позволяет исследовать более широкого диапазона прогрессирования заболевания, чем модель внутрисердечного, которая часто ограничена сопутствующим метастазами в других тканях. Кроме того, модель портальной вены не осложнена удаление селезенки, как это делается в внутриселезеночный модели.

Модель инъекции воротной вены может оказаться полезным инструментом для изучения метастазов в печени в целом. метастаз печени является наиболее частым местом метастазирования в аденокарциномы в целом, с особенно высокими показателями в поджелудочной железы (85% метастазов в печень), толстой и прямой кишки аденокарциномы (> 70%), а также желудка и пищевода (> 30 %) 1. Хотя спонтанные и Ортотопическая первичные модели опухоли поджелудочной железы и толстой кишки аденокарциномы более легко метастазировать в печень 78,79, воротной вены модель инъекции может прове полезно для понимания метастатического процесса этих видов рака, как контролируемые поставки опухолевых клеток позволяет биохимические, молекулярные и гистологические оценки в определенное время после прибытия опухолевых клеток. Таким образом, портал модель инъекции вену представляет собой важное улучшение по сравнению имеющихся моделей метастазов в печень рака молочной железы, а также могут быть применены к области метастазов в печени в целом.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать и заявлять об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность Александре Квакенбуш за помощь в хирургических процедурах во время съемок видеопротокола, Хэдли Холден за гистологическую поддержку, Сонали Джиндал за вклад в опухоль и патологию печени во время разработки метода, а также Брианне Карузо за критическое рецензирование рукописи. Опухолевые клетки молочной железы D2A1 и D2.OR были подарком от доктора Энн Чемберс, опухолевые клетки D2A1-GFP были подарком от доктора Джеффри Грина, а опухолевые клетки 4T1 были подарком от доктора Хайде Форд. Для визуализации было использовано ядро усовершенствованной световой микроскопии OHSU в Центре Юнгерса. Работа, включенная в эту рукопись, включает финансирование со стороны NIH/NCI NRSA F31CA186524 (для ETG) и NIH/NCI 5R01CA169175 (для PS).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 1 мл с иглой 26-го калибраBD Шприц309597Для подкожного введения бупренорфина; используйте осторожно, острые
спиртовые прокладкиFisher Scientific06-669-62Для очистки брюшной полости перед хирургическим разрезом
Универсальные губки, стерильныеKendall80444" x 4", используйте смоченные в стерильном физрастворе для защиты и увлажнения толстого и тонкого кишечника во время
хирургия Искусственные слезыРегби370114Минеральное масло 15%, белый вазелин 83%; применение для защиты глаз во время операции
Бупренорфин гидрохлорид, 0,3 мг/млMfg. by Reckitt BenckiserNDC-12496-0757-1Применение в дозе 0,05 - 0,1 мг/кг массы тела, 1 - 2 раза в день в течение 72 часов, подкожное введение
Бупивакаин гидрохлорид, 0,5% (5 мг/мл)Mfg. by Humira IncNDC-04091163-01Использовать по 0,5%, 1x сразу после операции, 10 раз; l Вводится подкожно в месте разреза 
анти-CD45 антителоBD Pharmingen550539использование при мультиплексной иммунофлюоресценции для исключения лейкоцитов при идентификации метастатических очагов
Celox™ Быстрая гемостатическая марляMedtrade Products Ltd.FG08839011Разрежьте на 5 мм² части, используйте для остановки оттока крови из воротной вены с давлением после инъекции
Химическая депиляцияИспользуйте для удаления волос из хирургической области; несколько поставщиков
Хлоргексидин, 2% раствор VetOne1CHL008Используйте осторожно, не попадите хлоргексидин в слизистые оболочки или уши мыши
антитела к CK18Abcamab53118Использование в мультиплексной иммунофлюоресценции для выявления метастатических очагов
Аппликаторы с ватным наконечником, SterileFisher Scientific23-400-1146" Деревянный вал 2 шт/конверт
DMEM, ВысокоглюкозныйHyCloneSH30243.01Клеточная культуральная среда для использования с D2A1, D2.OR и 4T1 Клеточные линии опухолей молочной железы
Стерилизатордля сухих стеклянных шариковИспользуйте между операциями для стерилизации инструментов из нержавеющей стали, будьте осторожны, очень горячими; несколько поставщиков
Этанол, 70% растворИспользуйте с осторожностью легковоспламеняющийся; используйте для очистки хирургической области по мере необходимости; несколько поставщиков
Фетальная бычья сывороткаHyCloneSH30071.03Клеточная питательная среда для использования с клеточными линиями опухолей молочной железы D2A1, D2.OR и 4T1, используйте в концентрации 10% в DMEM Марля с высоким содержанием глюкозы
, стерильнаяKendall21462 x 2 дюйма, использовать смоченный в 2% растворе хлоргексидина для очистки брюшной полости перед хирургическим разрезом
Anti Green Fluorescent Protein АнтителаVector LaboratoriesBA0702Использовать для окрашивания для меченых GFP D2A1 или других клеточных линий опухолей молочной железы
L-глутамин 200 мМ (100x)Gibco25030-081Добавка для клеточных культур для использования с клеточными линиями опухолей молочной железы D2A1, D2.OR и 4T1, использование при 2 мМ (1x) в DMEM Грелка с высоким содержанием глюкозы
, x 2 - 3Использование для поддержания тепла тела во время операции и восстановления; несколько поставщиков
ГемоцитометрHausser Scientific1483Для использования в клеточных культурах для подсчета клеток
Гемостатические щипцыНержавеющая сталь; несколько поставщиков
антител против Heppar-1DakoM7158Применение при мультиплексной иммунофлюоресценции для исключения гепатоцитов при идентификации метастатических очагов
Инсулиновый шприц, 0,3 мл, 29-го калибраBD   324702Для инъекции бупивакаина в место наложения шва; используйте осторожно, острый
ИзофлуранПирамалNDC-66794-017-25Вводится в дозе 2,5%
Изофлуран ВапорайзерVetEquip911103Используйте осторожно, испаряет анестезирующие газы
ИсточникИспользуйте для визуализации операционного поля; несколько поставщиков
Нейтральный буферизованный формалин, 10%Анатех ООО.135Используйте с осторожностью, токсичными; используйте в качестве тканевого фиксатора для конечных точек метастазирования и оценки метастатической нагрузки методом гистологии
Opal™ 4-color fIHC kitPerkinElmer, Inc.NEL794001KTИспользуйте для мультиплексной иммунофлюоресценции Heppar-1/CD45/CK18 для обнаружения метастазов в печени мышей
Операционные ножницыиз нержавеющей стали; используйте осторожно, остро; несколько поставщиков
Пенициллин/стрептомицин, 100xCorning30-002-ClКлеточная питательная среда для использования с клеющими линиями опухолей молочной железы D2A1, D2.OR и 4T1, используйте в 1x в DMEM с высоким содержанием
глюкозы фосфат-буферизованный физиологический растворИспользуйте в 1x для суспензии опухолевых клеток перед инъекцией, несколько поставщиков
Съемный игольчатый шприц, 25 μ l, модель 1702Hamilton7654-01Для инъекции в воротную вену; будьте осторожны, особенно при работе с иглами, нагруженными опухолевыми клетками, острые при прикреплении иглы
Ручкаиз нержавеющей стали;
лезвие скальпеля у нескольких поставщиков, #15Углеродистая сталь, стерильная, размер 15; несколько поставщиков
Съемные иглы с малой ступицей, 32 калибрHamilton7803-04Для инъекции воротной вены, длина 1 дюйм, тип точки 4, 12 градусов; угловые, многоразовые иглы от 33 до 34 калибра; используйте осторожно, особенно при работе с иглами, загруженными опухолевыми клетками, острым
гипохлоритомиспользуйте осторожно, коррозионно; используйте в концентрации 10% для дезинфекции рабочего места и поверхностей, несколько поставщиков
стерильного физиологического раствораFisher ScientificBP358-2120,9% раствор NaCl; в качестве альтернативы, могут быть домашние и стерильные фильтрованные
хирургические перчатки, стерильныенесколько поставщиков
Шовные материалы стерильные EthiconJ310H4-0 27" покрытый викрил с конусной иглой из этсплава 22 мм 1/2c; используйте осторожно, острый
Настольный портативный наркозный аппаратVetEquip901801Используйте с изофлурановым испарителем для мышиной
анестезии ЩипцыНержавеющая сталь, зубчатая, притупленная; несколько поставщиков
Полотенцесушители Простыни, стерильные Dynarex441018" x 26", для покрытия грелки и обеспечения стерильного рабочего пространства во время операции
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Для использования в клеточной культуре для оценки жизнеспособности используйте 1:1 с клетками в 1x PBS
Trypsin/EDTA, 0,05% (1x)Gibco25300-054Используйте в клеточной культуре для отделения опухолевых клеток от планшетов для культуры тканей
света скальпеля натрия . для большого пальца

Ссылки

  1. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  2. Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
  3. Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
  4. Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
  5. Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
  6. Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
  7. Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
  8. Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
  9. Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
  10. Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
  11. Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer--a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
  12. Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
  13. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  14. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature reviews. Cancer. 4, 448-456 (2004).
  15. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  16. Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
  18. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
  19. Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
  20. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
  21. Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
  22. Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
  23. Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
  24. Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
  25. Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
  26. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
  27. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
  28. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
  29. Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489(2014).
  30. Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
  31. Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15, 73-86 (2015).
  32. Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
  33. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
  34. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501(2016).
  35. Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
  36. Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
  37. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
  38. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212(2006).
  39. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
  40. Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
  41. Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
  42. Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
  43. Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
  44. Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
  45. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. , e4260(2012).
  46. Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
  47. Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
  48. Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
  49. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
  50. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677(2014).
  51. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
  52. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  53. Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469(2015).
  54. Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
  55. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29(2009).
  56. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
  57. Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
  58. Coligan, J. E., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
  59. Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
  60. Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
  61. Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
  62. Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
  63. Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
  64. Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960(2015).
  65. Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35(2016).
  66. Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
  67. Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
  68. O'Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
  69. Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
  70. Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
  71. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
  72. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
  73. Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
  74. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
  75. Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
  76. Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
  77. Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
  78. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18, 1286-1294 (2012).
  79. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32, 39-61 (2013).

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель рака молочной железыинъекция опухолевых клетокпечень мышихирургический разрезгемостатическая марляприжизненная визуализацияанализ Г&Эиммунофлуоресцентный анализ
Воротной вены для инъекций модель для изучения печени метастазирования рака молочной железы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.