Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

15.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54929

⸱

15 декабря 2016 г.

 ,  , 
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Создание систем культивирования для экспансии взрослых нервных стволовых клеток (aNSCs) позволяет исследовать и применять aNSCs для терапии. Субкаллозальная зона (ЗКН) недавно была признана новой нейробластообразующей областью у взрослых мышей. Здесь описаны методы выделения, расширения и дифференцировки ЗКН-аНСК.

Аннотация

Взрослые нейральные стволовые клетки (aNSCs) могут быть использованы для регенерации поврежденной ткани мозга. НСК обладают потенциалом для дифференцировки и пролиферации в три типа клеток: нейроны, астроциты и олигодендроциты. Идентификация областей, производных от aNSC, и характеристика свойств aNSC имеют решающее значение для потенциального использования aNSC и для выяснения их роли в регенерации нейронов. Недавно сообщалось, что субкаллозальная зона (ЗКН), расположенная между белым веществом и гиппокампом, содержит аНСК и постоянно дает начало нейробластам. Низкий процент аНСК из ЗКН дифференцируется в нейроны; Большинство клеток дифференцируются в глиальные клетки, такие как олигодендроциты и астроциты. Предполагается, что эти клетки обладают терапевтическим потенциалом при травматическом повреждении коры головного мозга. Этот протокол подробно описывает процесс генерации SCZ-aNSC из мозга взрослой мыши. Матрица мозга с интервалом 1 мм используется для получения ЗКН, содержащих корональные срезы, и для точного рассечения ЗКН от всего мозга. Срезы ЗКН первоначально подвергаются культуре нейросферы. Хорошо развитая система культивирования позволяет проверять их характеристики и может увеличить количество исследований НСК. Система нейросферных культур представляет собой полезный инструмент для определения пролиферации и сбора подлинных НСК. Монослойная культура также является системой in vitro для анализа пролиферации и дифференцировки. Важно отметить, что эта культуральная система обеспечивает более однородную среду для НСК, чем нейросферная культуральная система. Таким образом, используя дискретную область мозга, эти системы культивирования будут полезны для расширения наших знаний о аНСК и их применении в терапевтических целях.

Введение

NSC обладают характеристиками самообновления и многолинейной дифференциации. Для подтверждения этих свойств широко используется система нейросферных культур. Система нейросферных культур была разработана в начале 1990-х годов и служила стандартной системой культивирования стволовых клеток1. В зависимости от активности самообновления, НСК непрерывно пролиферируют и генерируют клеточную массу в суспензионной культуре. Считается, что количество клеток и размер нейросферы тесно связаны со свойствами пролиферации НСК. Монослойные культуры также широко используются для поддержания и дифференцировки НСК. По сравнению с культурой нейросферы, монослойная культуральная система обеспечивает более однородное поддержание и расширение НСК. Эти две хорошо разработанные системы культивирования внесли свой вклад в характеристику аНСК in vitro.

НСК находятся в разных областях мозга, таких как субвентрикулярная зона (SVZ) латерального желудочка и субгранулярная зона (SGZ) гиппокампа3-5. Субкаллозальная зона (ЗКН) каудального подкоркового белого вещества признана новой нейрогенной областью6-8. Недавно сообщалось, что SCZ-aNSCs обладают терапевтическим потенциалом при черепно-мозговой травме9. По сравнению с другими нейрогенными областями, ЗКН находится вдоль подкоркового белого вещества. В мозге человека подкорковое белое вещество занимает большую область, чем в мозгемыши10. Таким образом, понимание характеристик SCZ-aNSC с использованием системы культивирования in vitro важно для продвижения потенциального использования этих клеток для регенерации нейронов. Требуется точное препарирование нужной области мозга, чтобы исключить возможное загрязнение нежелательными областями, содержащими активные или неактивные НСК. Например, аНСК в ненейрогенных областях могут активироваться и производить новые нейронные клетки в поврежденном мозге или во времякультивирования in vitro. Чтобы получить НСК из ЗКН, клетки собирали из срезов мозга, содержащих ЗКН. Затем была проведена тщательная микродиссекция области ЗКН с помощью тонкой иглы. Для создания нейросферы из ЗКН микрофрагменты ткани ЗКН диссоциировали на отдельные клетки, а затем культивировали в виде суспензии в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и основного фактора роста фибробластов (bFGF). После того как SCZ-aNSCs образуют нейросферы, они также могут поддерживаться в виде нейросфер или монослоев для расширения. Эта процедура также демонстрирует процессы иммуноокрашивания различными маркерами для обнаружения НСК и их потомства после их экспансии и дифференцировки в монослойной культуре. Здесь представлен визуальный протокол системы культуры SCZ-aNSC. Этот протокол содержит подробные инструкции по микродиссекции области ЗКН, а также по поддержанию и прохождению клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка материалов и среды культивирования

  1. Для рассечение и диссоциации ЗКН, оберните матрицу мозга, обоюдоострым лезвием бритвы и пинцета с алюминиевой фольгой, а затем стерилизовать их автоклавированием.
  2. Приготовьте 50 мл холодного буфера PBS, чтобы вымыть весь мозг мыши.
  3. Настройка рассечение микроскопа и подготовить хирургических инструментов, необходимых для рассечения мозга (автоклавного ножницами и пинцетом) и изоляцию (мл шприца 1, 30 G иглы, матрицы мозга и тонким пинцетом) ЗКН.
  4. Получение N2 среды:
    1. Готовят F-12 / DMEM (+ L-глутамин + бикарбонат натрия) среда с 2% B27, 1% N2 добавки и 1% пенициллина-стрептомицина.
      Примечание: Питательная среда состоит из N2 среды и факторов роста (20 нг / мл фактора роста очищенного эпидермальный (EGF) и 20 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF2)).
  5. Приготовьте буфера пищеварения (40 ед / мл папаин, / dispas 2,4 единицы мле II, и 2% пенициллина-стрептомицина в PBS) для переваривания ткани.
  6. Приготовление покрывающей плиты и покровного:
    1. Готовят поли-L-орнитин (ПЛО; 0,01%) и ламинин (10 мкг / мл , растворенный в дН 2 O). Для покрытия 6-луночные планшеты для поддержания ЗКН-aNSCs в виде монослоя или 18 мм покровные для иммунологического окрашивания, инкубировать их с ПЛО в течение ночи при температуре 4 ° С. Затем промыть их 3 раза DH 2 O. Разрешить планшеты и покровные высохнуть после последней промывки.
    2. Затем, инкубировать пластин с ламинин в течение ночи при температуре 4 ° С. Затем промойте их 3 раза DH 2 O.
      Предостережение: Не сушите ламинин, которые будут влиять на прикрепление клеток.
      Примечание: Растворы для нанесения покрытий могут быть повторно использованы в 3 раза.

2. Выделение и Диссоциация ЗКН взрослых

  1. До начала подготовки культуры, поместите матрицу мозга и обоюдоострым бритву на льду.
    Примечание: Не замораживать матрицу мозга, потому что брайн может прикрепить к нему.
  2. Жертвоприношение мышь (8 недель) с помощью СО 2 удушья или цервикальной дислокации.
    1. Отрезать голову с острыми ножницами после распыления 70% этанола. Для иммобилизации головы, удерживайте обе стороны головы плотно. Обрежьте кожу с помощью ножниц по срединной линии в хвостовом-ростральной направлении. Это способствует полному удалению кожи от черепа.
    2. Снимите хвостовую часть черепа (заднего лямбда), а затем вставьте щипцов между черепом и мозгом в положении средней линии спины. Возьмите левый (или правый) теменной кости и тщательно очистить его. Повторите эту процедуру для удаления другой теменной кости.
      Примечание: Разъединение зрительного нерва и снятия мозговой оболочки из мозга сделать его легче отделить мозг от черепа.
    3. Перенести мозг холодным буфером PBS (25 мл) и промыть его в два раза, чтобы удалить избыток крови.
  3. Поместите мозг в матрицу мозга на льду и маKE корональные сокращений, чтобы получить срезы толщиной 1 мм. Перенесите срезы мозга (1 мм), содержащие регионы ЗКН, которые расположены в задней части мозга к холодным PBS в 35 мм пластиковые чашки Петри.
    Внимание: Для того чтобы получить параллельную плоскость корональных секций, убедитесь, что Трещина мозг помещается в средней линии матрицы мозга; очень важно, чтобы избежать ненужных изменений в секциях.
    Примечание: Получение срезов мозга на 2-3 мм кзади от темени; это позволяет разделение ЗКН от SVZ.
  4. Под микроскопом рассекает с небольшим увеличением, микро-рассекают ЗКН из белой области вещества коры и гиппокампа с изогнутым 30G иглы 6,9. Затем удалите регионы коры над ЗКН. Поместите расчлененный ЗКН область от срезов в 35 мм пластиковые чашки Петри на льду без холодной PBS.
    Примечание: Заражение дополнительных областей, содержащих зрелые нейроны могут повлиять на жизнеспособность aNSCs и нейросфера пласта боскольку они подвергаются клеточной гибели в условиях культивирования aNSC.
  5. Используя согнутую 30 G иглы, немедленно прервите рассеченные ткани на мелкие кусочки.
    Примечание: Если требуется больше времени для рассечения тканей ЗКН, погрузить рассеченные ткани в холодной PBS, прежде чем измельчать.
  6. Повторное приостановить нарезанную ткань с 1 мл буфера пищеварения, переноса ткани в 15 мл пробирку, содержащую 2 мл буфера пищеварения, и инкубировать ее в течение 30 мин на водяной бане 37 ° C.
    Примечание: встряхивать пробирку каждые 10 минут, чтобы хорошо перемешать.

3. Зона-расположенный под мозолистым телом полученных для взрослых Neural стволовых клеток культуры

  1. Нажмите на трубку слегка диссоциировать переваренной ткани, а затем отцентрифугировать пробирку при 145 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант, ресуспендируют переваренной ткани с 1 мл подогретого среды N2 промыть буфера пищеварения, и осторожно пипеткой раствор образца максимум 5 раз с использованием P1000 пипетки.
    Примечание: Over-растиранием с узкимпипетку наконечник может уменьшить жизнеспособность клеток и последующего роста.
  2. Отцентрифугировать пробирку при 145 х г в течение 5 мин. После удаления надосадочной жидкости, повторно приостанавливать осадок клеток в 1 мл среды N2.
  3. Подготовить 1 мл N2 среды в непокрытой 6-луночного планшета и добавляют 1 мл взвешенных клеток, чтобы сделать окончательный объем 2 мл.
  4. Добавить EGF (20 нг / мл) и bFGF (20 нг / мл) в каждую лунку. Осторожно встряхните 6-луночного культуры блюдо вручную, чтобы смешать добавленные факторы роста с посеянных клеток. Держите 6-луночного планшета в 37 ° C и 5% CO 2 инкубаторе.
  5. Добавить EGF (20 нг / мл) и bFGF (20 нг / мл) в каждую лунку, каждый день в течение 8 дней. Каждый третий день, добавьте 200 мкл N2 сред для поддержания ориентировочный объем 2 мл среды.

4. пассажи NSCs в нейросферах и однослойные культуры

  1. Соберите нейросферы и перенести их в новый 15 мл коническую трубку.
    Примечание: Количество нейросферах (диаметром> 50 мкм) PER также от ЗКН одного мозга мыши составляет 64,3 ± 7,31, что было меньше , чем у СВЗ (190,5 ± 6,33) 9.
  2. Инкубируйте нейросферы 0,5 мл диссоциации буфера в течение 5 мин на водяной бане 37 ° C, чтобы диссоциировать нейросферы на отдельные клетки. Первичные нейросферы могут быть диссоциированы на отдельные клетки и сохраняется в течение нескольких пассажей, как нейросфера или однослойных культур.
    Примечание: Расширение ЗКН-aNSCs в виде монослоя превосходит нейросферах, потому что ЗКН-aNSCs можно пассировать> 10 раз в формате монослой культуры, но <5 раз в формате нейросфера культуры.
    Внимание: ЗКН-aNSCs демонстрируют сильную агрегацию, и его трудно отделить их в отдельные клетки. Таким образом, формат культуры нейросфера не рекомендуется для расширения рутинного клеток.
  3. Аккуратно пипеткой раствор образца вверх и вниз с P1000 пипетки менее чем в 5 раз и отцентрифугировать пробирку при 145 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно-супровести нейросферы с 1 мл N2 среды.
    Примечание: Над растиранием с узким кончиком пипетки может уменьшить жизнеспособность клеток и последующего роста.
  4. Для подсчета клеток, сделать смесь 1: 1 клеточной суспензии (10 мкл) и 0,4% -ным раствором трипанового синего, а затем подсчитывают количество живых клеток на гематоцитометр. После нанесения покрытия на 6-луночный планшет с ПЛО / ламинин, высевания клеток при 2,5 х 10 5 клеток / мл с помощью 2 мл N2 среды для каждой лунки.
    Примечание: Изменения в плотности клеток может повлиять на их состояние и дифференциации потенциал.
  5. Поддерживать ЗКН-aNSCs с ежедневной обработкой факторов роста (2 мл, 20 нг / мл) в течение 5 дней, и их прохождение их.

5. Разграничение зон-расположенный под мозолистым телом стволовых клеток, полученных для взрослых Neural

  1. Пластинчатые aNSCs на в ПЛО / Laminin покрытием 18 мм покровное с 1 × 10 5 клеток / мл в 1 мл N2 с факторами роста (20 нг / мл) для дифференциации ЗКН-aNSCs.
  2. Следующий день,когда клетки прочно прикреплены к покровным, обменивать ростовой среды с N 2 для удаления факторов роста.
  3. Через 6 дней, моют дифференцированных клеток с 1 мл PBS для удаления остатков клеток и закрепить их за иммунным окрашиванием.
    Примечание: BrdU, могут быть включены в состав вновь синтезированной ДНК пролиферирующих клеток. Поэтому, при желании, BrdU (10 мкг / мл) могут быть добавлены в живые клетки перед фиксацией клеток.

6. Иммунологическое взрослых нервные стволовые клетки и дифференцированные Предшественники

  1. Для иммунным окрашиванием, мыть клетки с PBS и исправить их с 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре.
    Внимание: PFA является высокотоксичным; избегать контакта с кожей и глазами.
  2. Удалите 4% PFA, ополоснуть неподвижные клетки с PBS 3 раза, а затем хранить их при температуре 4 ° Cuntil они необходимы для иммунной окраски.
  3. Инкубируйте клетки на покровное с блокирующим раствором (3% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Тритон Х-100 в 1x РБС) в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре.
  4. Подготовка первичных антител в свежем блокирующем растворе и инкубируют образцы в течение ночи при температуре 4 ° С.
    1. Иммуноокрашивание в aNSCs
      1. Пятно aNSCs с использованием анти-Nestin и анти-BrdU антител. Перед фиксацией, добавьте 20 мкг BrdU к aNSCs и инкубировать их в течение 2 ч. Выполните шаг денатурирующих с использованием 2 N HCl в течение 20 мин при 37 ° CBefore проведения стадии блокировки.
    2. Иммуноокрашивание дифференцированные клетки-предшественники:
      1. Используйте анти-O4, анти-BIII-тубулина, а также анти-глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) антител к маркировать дифференцированные клетки-предшественники.
  5. Промыть образцы с PBS 3 раза и инкубировать их с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями (1: 500) в блокирующем растворе в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем промыть образцы 3 раза PBS.
    Примечание: Используйте вторичные антитела, которые соответствуют хозяев первичногоантитела. Hoechest33343 (1: 2000) используется для ядерного окрашивания.
  6. Добавить решение для монтажа на предметное стекло и приступить к монтажу. Обратите внимание и изображение образца на конфокальной микроскопии на нескольких длинах волн: FITC (488 нм), Су3 (543 нм), Су5 (647 нм) и Hoechest33343 (405 нм).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Определение системы культуры для aNSCs от неизвестного нейрогенной области имеет важное значение для понимания этих клеток и для развития их потенциального использования в ремонте мозга 12. Известно , что NSCs в разных стадиях развития или в разных регионах по- разному ведут себя 3,4. Недавно было сообщено о том, что ЗКН-производные клетки обладают дифференциальные потенциалы для дифференцировки нейронов в естественных условиях и в пробирке по срав...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной статье описывается подробный протокол для генерации NSCs из ЗКН взрослых мышей и поддерживать их для различных применений. Есть три важных шагов для создания пробирке системы культуры в необходимой для очистки и расширения ЗКН-NSCs. Во- первых, важно обеспечить, чтобы ЗКН область точно иссекают из других потенциальных нейрогенных областей (Фигура 1В). Толстые и точные разделы , содержащие участки ЗКН были получены с интервальной матрицы мозга на 1 мм, а затем тонкая игла была ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой исследования мозга через Национальный исследовательский фонд (NRF), финансируемой Министерством науки, ИКТ и планирования будущего Кореи (гранты NRF-2015M3C7A1028790); и грантом Корейского проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемый Министерством здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (HI14C3347).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>средние компоненты
DMEM/F12 Gibco11320-033+ L-глутамин, + бикарбонат натрия
Pen/StrepInvitrogen15140-122
N2 добавкаGibco17502-048
B27 добавкаGibco17504-044
фактор роста
bFGFR& D233-FB
EGFGibcoPHG0313
Buffer
PBS (10x)BIOSOLUTIONBP007a1x разведение
HBSSGibco14175-095
Dissociattion buffer
Dispase IIRoche04-942-078-001
PapainWorthington3126
AccutaseICTAT-104
Tool
Fine щипцыWPI555229F
НожницыStorzE3321-C
Матрица мозга (1 мм)RWD68707
Обоюдоострая бритваDORCOST-300
30 G иглаSUNGSHIMN1300
Материалы
15 мл тубыSPL50015
50 мл тубыSPL50050
35 мм чашкаSPL10035чашка Петри
100 мм чашкаSPL10090Чашка Петри
Накладка на крышку (18 мм)Deckglaser111580
12-луночная чашкаSPL32012без покрытия
6-луночная чашкаSPL32006без покрытия
<прочная>Материалы покрытия
PLOSigmaP49570,01%
ЛамининGibco23017-01510 мг/мл
<сильный>Первичные антитела 
NestinMilliporeMAB353мышь (1:1,000)
EGFRAbcamab2430кролик (1:1,000)
DCXSanta CruzSC8066коза (1:500)
Tuj1SigmaT2200кролик (1:2,000)
GFAPInvitrogen13-0300крыса (1:1,000)
O4MilliporeMAB345мышь (1:500)
BrdUAbcamab6326Крыса (1:500
)Secondary антитела
anti-mouse 488InvitrogenA212021:500
anti-mouse cy3Jackson715-165-151
anti-mouse 647Jackson715-606-150
анти-кролик 488AlexaA21206
анти-кролик cy3Джексон711-165-152
анти-кролик 647Джексон711-605-152
анти-коз 488AlexaA11055
анти-коз cy3Джексон705-165-147
анти-коз 647InvitrogenA21447
anti-rat 488InvitrogenA21208
anti-rat cy3Jackson712-166-150
anti-rat 647Jackson712-605-153
Immunostaining materials
BSAMillipore82-100-63% BSA с 0,1% Triton X-100 in PBS
Triton X-100usb22686
4% PFABiosesangP2031
Hoechest33342Life TechnologyH3570Краситель для окрашивания ядер

Ссылки

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
  2. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388(2007).
  3. Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812(2015).
  5. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  6. Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
  7. Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
  8. Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
  9. Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
  10. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
  11. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
  12. Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  13. Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
  15. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
  16. Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
  17. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  18. Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
  19. Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
  20. Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
  21. Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
  22. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
  23. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Изоляция субкаллозальной зоныкультивирование нейросфермонослойная культурапереваривание тканейпролиферация клетоканализ дифференцировкивоздействие факторами ростапроцедура иммуноокрашиваниядиссекция матрикса мозга
Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.