В этой статье описывается метод оценки взаимодействий и сборок интегральных мембранных белков in vitro с различными факторами-партнерами в липидно-проксимальной среде.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий In Vitro
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение интегральных мембранных белков в пробирке часто осложняется наличием гидрофобного трансмембранного домена. Еще более усложняют эти исследования, реинкорпорация моющих-солюбилизированного мембранных белков в липосомы является случайным процессом, где топология белка невозможно провести в жизнь. Эта статья предлагает альтернативный метод для этих сложных методов, которые использует липосом на основе строительных лесов. растворимость белков усиливается за счет делеции трансмембранного домена, и эти аминокислоты заменяются привязывать остатком, такие как His-меткой. Этот фал взаимодействует с анкерной группой (Ni 2+ координируется нитрилтриуксусная кислоты (NTA (Ni 2+)) для His-меченных белков), который вводит единую топологию белка на поверхности липосом. Приведен пример, в котором взаимодействие между динамина связанных с белком 1 (drp1) с интегральным мембранным белком, митохондриальной осколочного Factor (ММФ), был Investigated с помощью этого метода эшафот липосом. В этой работе мы продемонстрировали способность ММФ эффективно вербовать растворимого drp1 к поверхности липосом, что стимулировало его активность ГТФ. Кроме того, drp1 смог придавать трубчатую форму ММФ-украшенный шаблон липидов в присутствии специфических липидов. Этот пример демонстрирует эффективность каркасных липосом с использованием структурных и функциональных анализов и выдвигает на первый план роль ММФ в регуляции активности drp1.
Введение
Изучение мембранных проксимальных белок-белковых взаимодействий является сложной задачи из - за трудностей в обобщал родную среду интегральных мембранных белков , участвующих 1. Это связано с необходимостью моющего средства солюбилизации и непоследовательное ориентации белков в протеолипосомах. Для того , чтобы избежать этих проблем, мы использовали стратегию , в котором растворимые домены интегральных мембранных белков выражают в виде His-Tag слитых белков, и эти растворимые фрагменты прикреплены к каркасных липосом с помощью взаимодействий с NTA (Ni 2+) в полярных головных групп липидов поверхность. С помощью этих каркасах, липидные-проксималь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Эшафот липосом Подготовка
Примечание: В идеале, первоначальные эксперименты должны использовать сравнительно простой и невыразительную эшафот (состоящий из DOPC (1,2-dioleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин или ПК) и DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-диолеоил - зп глицеро-3 - [(N - (5-амино-1-карбоксипентил) иминодиуксусной кислоты) сукцинил]. (никелевую соль)) Строительство от этих экспериментов, липидный заряд, гибкость, и кривизна может быть введен в качестве индивидуальных факторов с потенциалом для изменения мембранами проксимальный взаимодействий. Эти изменения могут быть достигнуты путем добавления определенных к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В то время как взаимодействие между drp1 и MFF было продемонстрировано, что важно для митохондриального деления, это взаимодействие было трудно резюмировать в пробирке. Наша цель состояла в том, чтобы лучше подражать клеточной среды, в которой drp1 и MFF взаимодействовать. С этой целью, липосомы , содержащие предельные концентрации NTA (Ni2 +) полярных головных групп получали путем регидратации липидной пленки , как описано выше. Раствор липида первоначально состоит и.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол предлагает метод исследования белок-белковых взаимодействий, связанных с интегральными мембранными белками. Используя модульную липосомальной леску, исследователи способны оценить активность одного или нескольких белков в липидном проксимальных среде. Предыдущие исследования показали аналогичный метод рецепторных ферментов плазматической мембраны 24 - 26. Мы расширили этот метод для включения липидов кофакторов и исследовать взаимодействия между белками, которые составляют .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность за финансирование, полученное от Американской кардиологической ассоциации (SDG12SDG9130039).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фосфатидилхолин (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| фосфатидилэтаноламин (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| кардиолипином сердца крупного рогатого скота (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| хлороформа | Acros Organics | ||
| Экструдер липосом | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh отрицательные красительные сетки | Ted Pella | 79712 | |
| Микрофуге Пробирка | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Микротитровальные полоски | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Растворимый синий краситель Coomassie | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Хлорид магния | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Гель | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Загружающий краситель Laemmli | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Малахит зеленый карбинол | Сигма Олдрич | 229105 | |
| Молибдат аммония Тетрагидрат | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Лабораторная пленка | Парапленка | PM-996 | |
| Уранилацетат | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 кэВ Микроскоп | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Ротор | Beckman | ||
| Рефрижераторный CentriVap Концентратор | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Термоамплификатор | Eppendorf | ||
| VersaMax Считыватель микропланшетов | Молекулярные устройства |
Ссылки
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
