Методическая статья

Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle, Кожеед пятнистый

DOI:

10.3791/54976

⸱

28 декабря 2016 г.

 ,  , 
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протоколы для выращивания в средней зародышевой жука, кожеед пятнистый (D. тасиШиз) в лабораторных условиях . Мы также разделяем протоколы для эмбрионального и родителей RNAi и методы для анализа эмбриональные фенотипы для изучения функции генов у этого вида.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Достижения в области геномики повысили возможность исследования биоразнообразия в беспрецедентных масштабах. Тем не менее, последовательность сама по себе не будет информативной без инструментов для изучения функции генов. Таким образом, разработка и совместное использование подробных протоколов для создания новых модельных систем в лабораториях, а также инструментов для проведения функциональных исследований имеет решающее значение для использования возможностей геномики. Жесткокрылые (жуки) являются самой многочисленной кладой насекомых и занимают практически все виды местообитаний на планете. В дополнение к предоставлению идеальных моделей для фундаментальных исследований, изучение жуков может оказать влияние на борьбу с вредителями, поскольку они часто являются вредителями домашних хозяйств, сельского хозяйства и пищевой промышленности. Представлены подробные протоколы выращивания и содержания лабораторных колоний D. maculatus и проведения дцРНК-опосредованной интерференции у D. maculatus. Описаны как эмбриональные, так и родительские процедуры РНК-интерференции, включая настройку аппарата, подготовку, инъекцию и восстановление после инъекции. Также представлены методы анализа эмбриональных фенотипов, включая жизнеспособность, дефекты паттерна у вылупившихся личинок и препараты кутикулы для невылупившихся личинок. Эти анализы, вместе с гибридизацией in situ и иммуноокрашиванием для молекулярных маркеров, делают D. maculatus доступной модельной системой для фундаментальных и прикладных исследований. Кроме того, они предоставляют полезную информацию для установления процедур в других новых модельных системах на насекомых.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В 1998 году , Огонь и Мелло сообщил , что двухцепочечной РНК (дцРНК) может вызывать ингибирование функции генов в Caenorhabditis Элеганс 1. Эта реакция вызвана дсРНК была названа РНК - интерференция (RNAi), и такие RNAi-опосредованной ген глушителей , как сообщалось, сохраняется у животных, растений и грибов 2-7. У растений и некоторых животных, функции RNAi системно, а это означает , что эффект может распространиться на другие клетки / ткани , где дцРНК не непосредственно вводить (обзор в 8-10). Ученые использовали этот эндогенный клеточный ответ RNAi путем разработки дцРНК целевых генов , представляющих интерес, тем самым сбивая функцию гена без прямого манипулирования геном (обзор в 11-14).

RNAi является мощным инструментом для функциональных исследований из-за следующих преимуществ. Во-первых, даже при минимальной информации о последовательности гена, ген может быть направлена ​​с помощью RNAi. Это особенно важно для стudies не-модельных организмов, не имеющих геномные или транскриптомных данных. Во-вторых, в организмах, где ответ РНКи робастно системным, RNAi-опосредованной нокдаун гена может быть выполнен практически в любом стадии развития. Эта функция очень полезна для изучения функции плейотропных генов. В- третьих, в некоторых случаях, RNAi эффекты распространяются на гонады и потомству, таким образом, что фенотипы наблюдаются у потомства 15,16. Это явление, известное как родительская RNAi (pRNAi), особенно выгодно для генов, влияющих на эмбриональное развитие, а многочисленное потомство производится одним закачиваемой родителем может быть рассмотрено без прямого манипулирования яиц. По этим причинам, pRNAi является методом выбора. Тем не менее, если pRNAi неэффективен, например, для генов, необходимых для оогенеза, то эмбриональная RNAi (eRNAi) должен быть использован. В-четвертых, РНК-интерференция может быть использован для создания эквивалент серии аллельного в том, что количество дцРНК поставляется может варьироваться в диапазоне производить слабого до сильного дефектов, Такая градация фенотипов может быть полезным для понимания функции гена, когда ген участвует в сложном процессе и / или полной потере функции летально. В-пятых, поставка дсРНК как правило, легко и практически осуществимо, особенно у животных, показывая надежные системные реакции RNAi. дцРНК могут быть введены путем микроинъекции 1,5, питание / проглатывания 17,18, замачивание, 19,20 и вирус / доставки бактерии опосредованные 21,22. В-шестых, в отличие от некоторых методов нацеливание / редактирования генов, нет необходимости скрининга для организмов, несущих мутацию или проводить генетические кресты для генерации гомозиготы при использовании RNAi. Таким образом, по сравнению со многими другими методами для изучения функции генов, RNAi быстро, недорого, и может быть применен для крупномасштабных экранов 23-25.

Широкая полезность RNAi обеспечивает средства для проведения функциональных исследований в широком диапазоне организмов, расширение спектра видов для изучения beyond традиционные модельные системы, для которых были разработаны генетические инструменты. Например, исследования с использованием не-модельных систем необходимы , чтобы дать понимание эволюции генов и генных сетей путем сравнения функции ортологах из видов , представляющих различные режимы развития или имеющие различные морфологические особенности 26-29. Эти типы исследований обеспечит лучшее понимание биологического разнообразия, с последствиями как для прикладных и фундаментальных исследований.

Будучи крупнейшей группой животных на планете, насекомые предоставляют прекрасную возможность для изучения механизмов, лежащих разнообразия. Кроме того, насекомые, как правило, маленькие, имеют короткие жизненные циклы, высокая плодовитость, и просты в тыл в лаборатории. За последние два десятилетия, RNAi был успешно применен у насекомых , охватывающих заказы, в том числе двукрылых (мух истинные) 5, чешуекрылые (бабочки и моли) 30, жесткокрылые (жуки) 16,31, перепончатокрылых (sawfложь, осы, муравьи и пчелы) 32, Hemiptera (истинные ошибки), Isoptera (термиты) 34, Blattodea (тараканы) 35, прямокрылые (сверчки, кузнечики, саранча, и katydids) 36 и Phthiraptera (вши) 37. Успешное применение RNAi предоставило функциональные данные для исследований в паттернирования раннего эмбриогенеза (передне-задней оси 32, спинным-вентральной оси 28, сегментация 26,38), определение пола 39,40, хитин / кутикулы биосинтез 41, экдизол сигнализации 42, социальное поведение 43, и многое другое. Методы RNAi , разработанные для разных видов насекомых могут иметь дополнительное преимущество в том , что они, вероятно, будут полезны для борьбы с вредителями (обзор 44-46). RNAi эффекты будут Гено-специфические, а также видовой специфичностью, до тех пор, как несохраняющимся регионы выбраны для таргетинга. Для получения полезных видов насекомых, как пчелами и шелкопрядов, ориентированных на гены, жизненно важных для выживаниявирусы или паразиты , чтобы контролировать инфекцию может обеспечить новую стратегию защиты этих видов 47,48.

Кожеед пятнистый (D. тасиШиз), общее название скрыть жук, распространяется по всему миру , за исключением Антарктиды. Как holometabolous насекомое, жизненный цикл D. тасиШиз включает в себя эмбрионального, личиночного, Куколочные и взрослых стадий (рисунок 1). Потому что он питается плотью, D. тасиШиз используется в музеях для скелетируют мертвых животных и судебно - энтомологи могут использовать его , чтобы оценить время смерти 49,50. D. тасиШиз питается продуктами животного происхождения, включая туш, сушеное мясо, сыр и куколок / коконов других насекомых и тем самым наносит ущерб домашним хозяйствам, которые хранятся продукты питания, и шелк, сыр, и мясной промышленности 51,52. Применение RNAi в этом жука может обеспечить эффективный и экологически чистый способ минимизировать его экономические последствия. Наша лаборатория использовала Д. тасиШиз как новый мОдел насекомых для изучения сегментации 53. Помимо того , что поддается лабораторным разведению, D. тасиШиз представляет интерес для фундаментальных исследований , так как он является разработчиком промежуточного росток, что делает его полезным для изучения видов перехода между кратко- и развития долгосрочных ростка.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Жизненный цикл Д. тасиШиз. Фотографии Д. тасиШиз на разных этапах жизни, как указано. Жизненный цикл от яйца до взрослой особи занимает три недели при 30 ° С, но уже при более низких температурах. (A, F) свежеуложенную эмбрионы от белого до светло - желтого цвета, овальные, около 1,5 мм в длину. Эмибриогенеза ~ 55 часов при 30 ° С. (B, C и G) Личинки имеют темные пигментные полосы и покрыты щетинками. Личинки пройти через несколько возрастах в зависимости от окружающей среды, и их длина может быть увеличен до более чем 1 см. (D, H) (E, I) Вскоре после вылупления, темная пигментация появляется над телом взрослого жука. Взрослые могут жить до нескольких месяцев и одна самка может отложить сотни эмбрионов в течение ее жизни. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Ранее мы показали , что RNAi является эффективным в нокдаун функции гена в D. тасиШиз 53. Вот наш опыт выращивания D. тасиШиз колонии в лаборатории совместно вместе с протоколами шаг за шагом как для эмбрионального и родительского RNAi настройке, инъекции, уход после инъекции, а также анализ фенотипической. ДцРНК-опосредованные нокдаун и методы анализа ген , введенный здесь не только предоставить подробную информацию для решения вопросов в области D. тасиШиз, но также имеют потенциальное значение Foг применение RNAi в других / видов насекомых, не модель Beetle.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Разведение D. тасиШиз

Примечание: Гнездовая колония D. тасиШиз была создана в лаборатории авторов с помощью взрослых и личинок закуплен. Идентичность видов была проверена с использованием ДНК - штрихкодирования 53.

  1. Для того, чтобы создать новую клетку в лаборатории, нанесите тонкий слой древесной стружки в клетку среднего размера насекомого (30,5 х 19 х 20,3 см 3). Поместите ~ 10 х 6 х 3 см 3 куска пенополистирол в клетке , чтобы личинки шкурку для окукливания. Добавьте 20 - 50 жуков (взрослым или поздно личинки возрастной стадии). Жуки будут прятаться в деревянной стружкой.
  2. Добавить влажный корм для кошек в чашке Петри или взвешенную лодочку. Накройте клетку с сетчатым тканью и поместить клетку в инкубаторе.
  3. Для поддержания гнездовой колонии в лаборатории, установить температуру в интервале от 25 до 30 ° C. D. тасиШиз растет быстрее при более высоких температурах, но это также способствует росту грибков и клещей. Для поддержания хилколония твоя, использовать 25 - 28 ° C для регулярного технического обслуживания запасов и 30 ° C для быстрого расширения колонии. Жизненный цикл занимает около трех недель до четырех месяцев в зависимости от факторов окружающей среды 50 (рисунок 2).

figure-protocol-1
Рисунок 2: D. тасиШиз Lab колонии. Фотография типичного клетки насекомых Д. тасиШиз показан. Стружки распространены, чтобы позволить жуки скрыть. Корм для кошек добавляется в небольшую чашку Петри, или взвешенную лодочку. Пенополистирол помещают в клетку в качестве убежища для окончательного личинок возрастной стадии окукливаются. Клетка , показанный здесь 30,5 х 19 х 20,3 см 3 , а дома несколько сотен личинок, куколок и взрослых. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. лугве яйца в клетке, чтобы созреть. Для того, чтобы расширить колонию, установить новые клетки с яйцами (собранных, как описано в разделе 2), личинок и взрослых, как указано выше. D. тасиШиз откладывают яйца по всей клетке, особенно вблизи источника пищи.
  2. Замените влажный корм для кошек примерно в два раза в неделю.
    Примечание: Из-за неприятного запаха влажного корма для кошек, альтернативные источники питания также были протестированы (см Обсуждение).

2. Эмбрион Коллекция

  1. Для того, чтобы создать коллекцию, отделить по меньшей мере, 50 самцов и 50 самок из колонии. Молодые люди являются лучшими. Место взрослых в мини-размера клетки (17,8 х 10,2 х 12,7 см 3) без древесной стружки. Добавьте корм для кошек в взвешенную лодочку.
  2. Перед началом сбора, проверьте клетку тщательно для любых эмбрионов, присутствующих и удалить их. Поместите растянутую ватный шарик в клетку, и оставить клетку в 30 ° C инкубатора. После соответствующего временного окна ватный шарик будет готов к сбору эмбрионов.
  3. сгибкусок черного цветной бумаги (формат А4) в два раза, чтобы создать складку, а затем разворачиваться.
  4. Удалить растянутого ватный шарик из клетки. Удалить взрослых от ватным тампоном и положил их обратно в клетку.
  5. В то время как ущемление растянутого ватным тампоном очень осторожно, разорвать его медленно в тонких хлопковых нитей, чтобы яйца падают на черную бумагу.
    Примечание: D. тасиШиз эмбрионы являются хрупкими и трудно увидеть в хлопке. Они могут быть легко раздавлен, если держать ватный шарик слишком сильно.

3. дцРНК Подготовка

  1. ДНК шаблона Подготовка к дсРНК синтеза
    1. Выполнить 4 - 6 50 мкл ПЦР-реакции с использованием праймеров, содержащих Т7 последовательности промотора на обоих 5'-концах для амплификации ДНК-матрицы в соответствии с протоколом производителя.
    2. Очищают продукт ПЦР с использованием коммерческого набора для очистки ПЦР, в соответствии с инструкциями изготовителя. Идеальная конечная концентрация ДНК-матрицы является ≥100 нг / мкл.
  2. Инъекции буфера Получение
    1. Подготовьте 100 мл инъекционного буфера (0,1 мМ NaH 2 PO 4, 5 мМ KCl). Регулировка рН до 6,8 с помощью 5М NaOH.
    2. Храните аликвоты при -20 ° C.
  3. дсРНК Синтез
    1. Настройка реакции в 0,2 мл ПЦР - пробирку на льду и проводят в пробирке реакции транскрипции с Т7 - полимеразой, следуя инструкциям производителя, используя ~ 500 нг на шаблон реакции.
    2. Инкубируйте пробирку при 37 ° С в течение ночи.
    3. Дайджест шаблона ДНК с ДНКазы, в соответствии с инструкциями изготовителя.
    4. Нагреть пробирку до 94 ° С и держать при температуре 94 ° С в течение 3 мин.
    5. Для того, чтобы прокалить дцРНК, медленно охлаждают пробирку на 1 ° С / мин до тех пор, пока не достигнет 45 ° C через 1 ч.
      Примечание: Шаги 3.3.2 через 3.3.5 могут быть выполнены в амплификатор.
    6. Этанол осадок дсРНК, добавляют 280 мклРНКазы свободной воды к 20 мкл реакции, чтобы приспособиться к конечного объема 300 мкл. Добавить 30 мкл 3 М NaOAc (рН 5,2) и 650 мкл этанола. Поместите трубку в -20 ° C в течение ночи с морозильной камерой.
    7. После центрифугирования при 15,682 мкг в течение 30 мин при температуре 4 ° С, промыть осадок дсРНК с 70% этанола. Сухой осадок и растворяют в 20 мкл буфера для инъекций.
    8. Измерить концентрацию дцРНК с использованием спектрофотометра при 260. Идеальная концентрация составляет 3 - 5 мкг / мкл. Проверьте качество, выполнив 5 мкл 1:25 разведения дцРНК на 1% агарозном геле при 90 В в течение 30 мин. Одна полоса ожидаемого размера будет хорошо видна.
    9. Храните дсРНК при -20 ° C или ниже.
      Примечание: Для каждого RNAi нокдауна эксперимента, включают в себя контроль дсРНК, который не было бы ожидать, чтобы повлиять на процесс изучается. GFP дсРНК является отличным управления для большинства экспериментов. Подготовить и внедрить элемент управления дсРНК бок о бок с experimental дцРНК.

4. Монтаж Microinjector и Микроманипулятор

Примечание: Смотрите рисунок 3.

  1. Подключите азот или другой источник сжатого воздуха на входе давления пневматического инструмента насоса. Если пневматический насос отсутствует, надавливать с помощью 50 мл шприц, соединенный с тонкой трубкой.
  2. Подключите ножной переключатель к удаленному разъему насоса для регулирования потока давления выталкивания.
  3. Прикрепите держатель стеклянного капиллярного к порту выгрузки диска давления насоса с трубкой.
  4. Закрепите держатель капилляров на микроманипулятора рядом с рассечения микроскопом.

5. Эмбриональные RNAi

Примечание: На рисунке 4 показана блок - схема D. тасиШиз эмбрионального RNAi.

  1. eRNAi Подготовка
    1. Подготовка эмбриона сбора чашку Петри крышкой (диаметр 90 мм). Поместите кусок черного фильтровальной бумаги к спо внутренней стороне крышки. Поместите стандартный стекло микроскопа на черной бумаге.
    2. Развести дсРНК до соответствующей концентрации с инъекционного буфера. Используйте 2 - 3 мкг / мкл для начальных экспериментов. Всегда держите дсРНК на льду перед инъекцией.
    3. Добавьте пищевой краситель в 1:40 разбавления до дцРНК и пипетки осторожно несколько раз, чтобы хорошо перемешать.
  2. Сбор Эмбрионы для инъекций
    ПРИМЕЧАНИЕ: При температуре 25 ° C, в ядрах эмбрионов 6 - 8 ч после откладки яиц (AEL) мигрируют по направлению к периферии яйца 53. Клеточный бластодерма устанавливается в пределах 8 - 10 ч 53 AEL. Для обеспечения эмбрионов до начала клеточной стадии бластодерма используются для инъекций, 0 - рекомендуется 3 ч эмбрионы AEL для использования 53. Сбор эмбрионов, подготовка и инъекции обычно занимает менее 2 ч, если стеклянные капилляры находятся в хорошей форме. Таким образом, весь процесс может быть завершен в течение 5 часов AEL.
    1. Сбор эмбрионов, как описано в пунктах 2.2-2.5.
    2. Нажмите черную цветную бумагу для переноса эмбрионов в чашку Петри сбора крышку.
    3. Палка двухстороннюю ленту вдоль края слайда.
    4. С помощью кисти, выравнивания эмбрионов на ленте перпендикулярно кромке скольжения с передним или задним концом у края. Обратите внимание, что передний и задний концы ранних эмбрионов не легко различимы, таким образом, в среднем половина будет закачиваться в конце задней, который идеально подходит.
  3. Загрузка дсРНК в стеклянный капилляр
    1. Возьмите 2 - 4 мкл дсРНК в 20 мкл microloader кончика пипетки.
    2. Вставьте наконечник в предварительно вытащил стеклянного капилляра (называемый иглой) и осторожно пипеткой раствор дсРНК в капилляр. Приготовьте иглы из коммерческих стеклянных капилляров с помощью микропипетки съемник. Примером идеального запряженных иглы показан на рисунке 5. Длина и конусность игл, возможно, должны быть оптимизированы афинъекционные тер испытания.
    3. Закрепите стеклянный капилляр в держатель стекла капилляра.
    4. Соберите держатель капилляров в микроманипулятором.
  4. Инъекционное дсРНК в эмбрионы
    1. Аккуратно перенести слайд эмбрионов на стадии рассекает микроскопом.
    2. Передвиньте бегунок, чтобы принести один эмбрион к центру поля и фокуса микроскопа.
    3. Поместите кончик капилляра с микроманипулятором, глядя в рассекает микроскопом. Доведите наконечник ближе к концу первого эмбриона в ряду.
    4. Включите продувкой азотом или другим подачи воздуха.
    5. Установите электромагнитный переключатель входа в вакууме.
    6. Отрегулируйте регулятор давления выброса до 10 - 15 фунтов на квадратный дюйм. Отрегулировать давление в зависимости от аппарата.
    7. Откройте капилляр, если это необходимо. После того, как наконечник открыт, окрашенный раствор дсРНК заполнит наконечник.
    8. Переместить кончик капилляра вперед, чтобы проколоть еmbryo. Если настройка давления является идеальным, не эмбриональных жидкость не будет течь в капилляр.
    9. Шаг на ножной переключатель для извлечения раствора дсРНК в эмбрион, пока соответствующее количество раствора не будет извлечена. На рисунке 5 показаны примеры эмбриона морфологии после того, как соответствующие и несоответствующие количества раствора были введены.
    10. Держите кончик капилляра внутри зародыша на ~ 2 сек, а затем удалить его.
    11. Переместить капилляр к следующему эмбриона и повторите шаги 5.4.8 - 5.4.10, пока все эмбрионы не будут введены. Изменение стеклянный капилляр, если он засоряется или ломается.
  5. После инъекции Восстановление и инкубация
    1. После инъекции, поместите слайд в чашку Петри.
    2. Добавьте влажный ватный шарик в чашку Петри. Не позволяйте ватным тампоном прикасаться слайд.
    3. Накройте чашку Петри и оберните его с уплотнительным пленку. Этикетка блюдо с названием дсРНК, концентрации, даты, времени и количества впрыскиваетсяэмбрионов.
    4. Поместите чашку Петри в 30 ° C инкубаторе до Эмбрионы люк.

6. Родительское RNAi

  1. Разделительный Куколки для pRNAi
    1. Сбор куколок из колонии.
    2. Сортировка мужского и женского пола куколки под микроскопом (смотрите рисунок 6). Держите их в двух отдельных чашках Петри в инкубаторе C 30 °, чтобы гарантировать, что ни один спаривание не происходит до инъекции.
    3. Проверить каждый день для eclosed взрослых. Окукливание обычно занимает 5 - 7 дней при 30 ° С.
    4. Передача eclosed самцов и самок (см рисунок 6) две отдельные чашки Петри и кормить их кошачью еду каждый день , пока они не будут готовы для инъекций.
    5. Перейдите к инъекции один раз имеется достаточное количество самцов и самок в соответствующем возрасте. Женщины от 4 до 8 дней после вылупления лучше. Для типичного анализа, 8 - используются 12 самок. Равное количество мужчин необходимы для вязки 54.
    2. Инъекционное дсРНК в Женского Живота
    1. Подготовка дсРНК на льду (5.1.2 и 5.1.3).
    2. Приложить 32 калибра иглы 10 мкл шприца.
    3. Анестезировать самок на CO 2 стадии.
    4. Загрузите решение дсРНК в шприц, не занимая никакого воздуха.
    5. Держите женскую брюшную сторону с одной стороны, и держать шприц с другой.
    6. Аккуратно прорезать segmacoria (мембраны) между стернитами 2 и 3 с кончиком иглы. На фиг.7 показана женщина во время инъекции. Если игла не проникает в ткань легко, угол игла вверх и медленно надавите. Вставка размером примерно 2 мм иглы в тело.
    7. Проверьте масштаб шприц, медленно нажимая на поршень, впрыскивая ~ 2 мкл на одну женщину.
    8. После инъекции, держать иглу еще в течение не менее 5 секунд перед удалением его из живота женщины.
    9. Передача инъекционные самок в чашку Петри (90 мм в диаметре) и кормить с кошачьей едой.
    10. Добавьте чашку Петри с именем дсРНК, количество введенного, дата и число женщин.
  2. После инъекции и восстановления Спаривание
    1. Выдержите чашку Петри в инкубаторе C 30 °.
    2. Через 24 часа, трансфер вводят самок в мини-клетки.
    3. Добавить в клетке равное количество неинъецированных молодых самцов, и маркировать клетку.
    4. Добавьте взвешенную лодочку с кошачьей едой в клетку.
    5. Оставьте клетку в инкубаторе C 30 °, чтобы позволить спаривание. Через 24 часа, самки должны начать откладывать яйца и эмбрионы могут собираться ежедневно или через установленные промежутки времени.

7. Фенотипическая анализ после того, как RNAi

Примечание: При температуре 30 ° C, она занимает ~ 55 час для яиц в люк 50.

  1. Анализ eRNAi Жизнеспособность
    1. Вычислить скорость штриховки путем сравнения числа выведенных личинок к общему NUmber инжектированных эмбрионов. Не забудьте включить отрицательный инъекцию управления, как эмбрионы могут пострадать или погибнуть в результате процедуры инъекции. Типичные скорости люков варьируются от 30% - 60%. Остерегайтесь вылупившихся личинок едят невыведенное яйца.
  2. Анализ pRNAi Жизнеспособность
    Примечание: Если женская жизнеспособность влияние гена мишенью RNAi, самки впрыскивают со специфическим дцРНК, но не отрицательный контроль дсРНК начнет умирать. Если производство яиц или кладка подвергается воздействию, самки проявляют частичную или полную стерильность. Оценка женской выживаемости по сравнению с отрицательными контролями или сравнить общее количество яиц, снесенных экспериментальных и контрольных самок (7.2.3).
    1. Настройка коллекции эмбриона следующим шагом 2.2.
    2. Через 24 часа собирают эмбрионов следующие шаги 2.4 - 2.5.
    3. Подсчитать общее количество эмбрионов.
    4. Перенос эмбрионов на 90 мм чашку Петри. Добавьте чашку Петри с геном целевой, дата сбора, и количество эмбрионов.
      5. Инкубируйте эмбрионов в 30 ° C инкубаторе, пока они люк. Так как вылупились личинки питаются невыведенного эмбрионов, проверьте чашки Петри часто и отдельным вылупились личинки из невыведенного эмбрионов с помощью щипцов (см Обсуждение).
  3. Подсчитайте количество вылупившихся эмбрионов и рассчитать скорость штриховки.
  • Изучение кутикулы дефектов в вылупившихся личинок
    1. Сбор вылупившихся личинок в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    2. В вытяжном шкафу, добавляют 1 мл раствора фиксации.
    3. Оставьте микроцентрифужных трубку при температуре 4 ° С, по крайней мере в течение ночи, чтобы раствор проникает в личиночной ткани.
    4. Чтобы представить себе, удалить как можно больше закрепитель из трубки, как это возможно.
    5. Полоскание личинки, по крайней мере в три раза с PBST.
    6. Личинки Переход на стеклянную пластину с множеством скважин с PBST использованием P-1000 наконечник пипетки с конца отрезан, чтобы расширить его.
    7. Под микроскопом рассекает, растягивать личинок с помощью пинцета для изучения дефектов. ят имеет решающее значение для растянуться личинок исследовать дефекты, как их контракта органов в фиксаторе.
  • Изучение кутикулы дефектов в невыведенное Личинка
    Примечание: Эта процедура полезна для изучения ранних эмбриональных фенотипы, особенно для эмбрионов, которые не доживают до вылупления.
    1. Для pRNAi, добавьте PBST в чашку Петри (7.2.4) и передать невыведенное эмбрионов в микроцентрифужных пробирку объемом 1,5 мл с использованием P-1000 наконечник пипетки с конца отрезан. Для eRNAi, добавьте PBST в чашку Петри (5.5.4), кисти невыведенного эмбрионов выкл стекло микроскопа и передавать их в микроцентрифужных трубки.
    2. Закрепить эмбрионов с фиксированием раствором и промойте их PBST для визуализации следующие шаги 7.3.2 - 7.3.6.
    3. Использование щипцов, рассекают эмбрионы из яичной скорлупы под микроскопом рассекает в PBST.
    4. Перенос эмбрионов обратно в 1,5 мл микроцентрифужных трубки (~ 200 мкл эмбрионов в каждой пробирке).
    5. Удалить как можно больше золясоциологическое загрязнение, насколько это возможно.
    6. Добавить 1 мл 90% молочной кислоты / 10% этанола. Оставьте центрифужную пробирку в инкубаторе C 60 °, по меньшей мере в течение ночи.
      Примечание: Эмбрионы могут быть оставлены при 60 ° С в течение нескольких дней.
    7. Для установки эмбрионов, пипетки их на предметное стекло микроскопа с использованием P-1000 пипетку с конца отрезан.
    8. Вручную поместите эмбрионы с щипцами для идеальной ориентации.
    9. Обложка эмбрионов с крышкой скольжения и визуализировать под микроскопом с использованием DIC.
  • Изучение клеточных и молекулярных дефектов
    Примечание: Эта процедура полезна для изучения глубинных причин кутикулы фенотипов или летальности, что не сопровождается кутикулы дефектами.
    1. Для pRNAi, отдельные эмбрионы из ватных шариков на соответствующей стадии разработки и передачи их в эмбрион сбора корзины. Корзина сбор может быть такой же или аналогичный тому , который используется для Drosophila коллекций эмбриона.
      1. Делатьяйцо корзины из 25 мл пластиковый сцинтилляционный флакон с нижней части флакона удаляют, и круг, вырезанный из крышки (диаметром примерно 1 см). Поместите круг супер мелкой сеткой около 2,5 см в диаметре внутри крышки, а затем ввернуть сцинтилляционный флакон на и использовать в обратном порядке.
      2. По мере того как сетка может быть легко удалена, как только зародыши моют, погружают сетку в микроцентрифужных трубки с водой для восстановления любых эмбрионов прилипание к сетке.
    2. Для eRNAi, на соответствующем этапе, добавьте PBST в чашку Петри. Кисть эмбрионов от предметного стекла микроскопа и передать их в эмбрион собирающей корзине.
      Примечание: Фиксирование, in - situ гибридизации, с использованием меченых антител, а также протоколы окрашивание ядер можно найти в Xiang и др. 2015 53.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Лаборатория авторов использовал технологию RNAi для изучения функциональной эволюции генов , регулирующих сегментацию у насекомых 53,55. В то время как все насекомые сегментирован, гены , регулирующие этот процесс , как представляется, расходились во излучениями насекомых 26,38,56-63. Генетические экраны в дрозофилы определили набор из девяти генов сегментации пара-правила, которые отвечают за содействие формированию сегментов тела 64-70. Здесь о...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    В то время были разработаны небольшое количество сложных модельных систем (мышей, мух, червей) в течение 20 - го века, 21 - й век видел волна новых систем животных , которые разрабатываются в лабораториях по всему миру. Эти новые системы позволяют ученым решать сравнительные, эволюционные вопросы, которые не могут быть проверены с использованием только "стандартных" модельные системы. Это развертывание новых моделей требует быстрого развития методов лабораторного культивирования, идентифи...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторам нечего раскрывать.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы благодарим докторов Элисон Хеффер и Йонг Лу за создание аппарата для микроинъекций и за то, что они поделились своими бесценными знаниями и опытом работы с РНК-интерференцией насекомых. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01GM113230 до L.P.).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Dermestes maculatus живые жукиНаша лаборатория или Carolina Biological Supply#144168Наш лабораторный штамм был проверен с помощью COI barcoding; нельзя исключать вариации штамма из Каролины
    Влажный корм для кошекFancy FeastКуски мяса с соусом. Можно купить в большинстве магазинов кормов для домашних животных и продуктовых магазинов
    Сухой корм для собакPurina Puppy ChowМожно купить в большинстве магазинов кормов и продуктов питания
    для домашних животных Клетка для насекомых (размер средний, 30,5 x 19 x 20,3 см)Exo TerraPT2260Для содержания колонии. При необходимости можно использовать клетку большего размера
    Клетка для насекомых (размер мини, 17,8 x 10,2 x 12,7 см)Exo TerraPT2250Для сбора эмбрионов
    чашка ПетриVWR89038-968
    Ватный шарикFisher22-456-883
    Набор для транскрипции Megascript T7FisherAM1334Для 40 реакций
    Пневматический насосWPIPV830
    КапилляродержательWPI
    МикроманипуляторNARISHIGEMN-151
    Черная фильтровальная бумага (90  мм)VWR28342-010
    Пищевой краситель (зеленый)McCormick
    Боросиликатный стеклянный капиллярHilgenberg1406119
    Игла (микропипетка)Sutter Instrument Co.P-97
    Предметное стеклоWorldWide Life Sciences Division41351157
    Герметизирующая пленка (Parafilm M)Fisher13-374-12
    Шприц модели 801 (10  &микро; l)Hamilton7642-01
    Игла (32-й калибр) Hamilton7762-05
    Фиксационный раствор (Pampel's)BioQuip Products, Inc.1184CТоксичный, необходимо обрабатывать в вытяжном шкафу
    Щипцы (DUMONT #5)Fine Science Tools11252-30
    Защитный накладка (24 x 50 мм, No 1.5)Globe Scientific1415-15
    Eppendorf Femtotips Наконечник для микрозагрузчика для пипеткиFisherE5242956003
    Препарирующая микроскопия для инъекции эмбрионаLeicaM420
    Пресекательная микроскопия для фенотипической визуализации личинокZeissSteREO Discover. V12
    DIC микроскопияZeissAXIO Imager. М1

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
    2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
    3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
    4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
    5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
    6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
    7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
    8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208(2004).
    9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
    10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
    11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
    12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
    13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
    14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
    15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
    16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
    17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
    18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
    19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
    20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
    21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
    22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
    23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822(2015).
    24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
    25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674(2015).
    26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
    27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
    28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
    29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
    30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
    31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
    32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
    33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
    34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
    35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
    36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
    37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
    38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440(2014).
    39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
    40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602(2012).
    41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
    42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
    43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
    44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
    45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
    46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
    47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
    48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
    49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
    50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
    51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
    52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
    53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32(2015).
    54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
    55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
    56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
    57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490(2012).
    58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
    59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
    60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
    61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
    62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
    63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
    64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
    65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
    66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
    67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
    68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
    69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
    70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
    71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
    72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
    73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5(2013).
    74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
    75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
    76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Похожие статьи