Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Надежная идентификация живых дофаминергических нейронов в мозге культур с использованием РНК-секвенирования и TH-промотор-приводом EGFP Expression

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54981

⸱

10 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

В этой статье

Краткое содержание

При болезни Паркинсона (PD), черной субстанции (ВНС) дофаминергические нейроны дегенерируют, что приводит к моторной дисфункции. Здесь мы сообщаем протокол для культивирования вентральных нейронов среднего мозга от мыши, выражающей EGFP с приводом от Тирозингидроксилаза (TH) промоторной последовательности, собирая отдельные флуоресцентные нейроны из культур, и измеряя их транскриптом с использованием Секвенирование РНК.

Аннотация

При болезни Паркинсона (БП) широко распространена потеря нейронов по всему мозгу с выраженной дегенерацией дофаминергических нейронов в ВНС, что ведет к Брадикинезия, ригидности и тремора. Идентификация живых дофаминергических нейронов в первичных Брюшной мезенцефалической (VM) культур с использованием флуоресцентного маркера обеспечивает альтернативный способ изучить избирательная уязвимость этих нейронов, не полагаясь на иммунное фиксированных клеток. Здесь мы изолируем, диссоциируют, и культура мыши VM нейроны в течение 3 недель. Затем определить дофаминергических нейронов в культурах с использованием EGFP флуоресценции (направляемый Тирозингидроксилаза (TH) промотор). Отдельные нейроны собирают в микропробирок с использованием стекла микропипетки. Далее, мы лизировать собранные клетки, а также проводить синтез кДНК и транспозонов-опосредованной "tagmentation" для получения однородной клеточной РНК-Seq библиотеки 1, 2,попка = "Xref"> 3, 4, 5. После прохождения проверки контроля качества, библиотеки одноклеточные упорядочиваются и последующий анализ проводится для измерения экспрессии генов. Мы сообщаем Транскриптом результаты для отдельных дофаминергической и ГАМКергических нейронов, выделенных из среднемозговых культур. Мы сообщаем, что 100% живых клеток TH-EGFP, которые были собраны и секвенированию дофаминергические нейроны. Эти методы будут иметь широкое применение в неврологии и молекулярной биологии.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) является неизлечимым, связанная с возрастом нейродегенеративное расстройство. Причина этого довольно распространенным заболеванием остается плохо изученным. Существует широкое потеря нейронов по всему мозгу, с выраженной дегенерации нейронов дофаминергических нейронов в черной субстанции (ВНС), что приводит к диагностических клинических признаков Брадикинезия, жесткости и тремора.

Первичные смешанные культуры, содержащие дофаминергических нейронов SNc особенно важны для лечения болезни Паркинсона. Брюшной тегментальной Площадь (VTA) дофаминергических нейронов были вовлечены в награду и наркомании. Брюшной мезенцефалической (VM) первичные смешанные эмбриональные культуры содержат как SNc и VTA дофаминергическая (DA) нейронов и ГАМКергических нейронов. VM первичные культуры могут быть полезны дл нейропротекции анализов и выяснения селективное уязвимости дофаминергических нейронов. Там нет никакого надежного способа идентифицировать дофаминергические клеток в культуре на основе морфологии. Онре мы разрабатываем методы для выявления и сбора урожая отдельных нейронов дофаминергические и построить одноклеточные, высокопродуктивные библиотеки РНК секвенирования.

Мы сообщаем репрезентативные данные РНК транскриптом для одного дофаминергической и ГАМКергических нейронов, выделенных из среднемозговых культур. Этот протокол может быть использован для нейропротекции, нейродегенеративных и фармакологических анализов для изучения влияния различных обработок на транскриптома DA / ГАМК. Поскольку дофаминергические нейроны представляют собой незначительное меньшинство нейронов, выраженных в первичных культурах VM, способность надежно идентифицировать эти нейроны в живых культур позволит расширенный диапазон исследований одноклеточных. Эти новые методы будут способствовать прогресс в понимании механизмов, происходящих на клеточном уровне и может иметь применение в других местах в области нейронауки и молекулярной биологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию животных, предоставленных Национальным институтом здоровья и протоколы были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения из Калифорнийского технологического института.

1. Получение первичной дофаминергической культур клеток из мозга эмбриона мыши

  1. Решения и культура Средние
    1. Приготовление аскорбиновой кислоты маточного раствора
      1. Взвешивают 352 мг аскорбиновой кислоты. Добавить стерильного H 2 O до конечного общего объема 20 мл. Место в C водяной бане 37 ° до растворения. Смесь фильтруют через 0,2 мкм наконечника шприца и хранят в 500 мкл аликвотах при -20 ° С.
    2. Приготовление папаин маточного раствора
      1. Развести папаин до 15 ед / мл в 1X Hanks'-сбалансированном солевом растворе (HBSS). Пипетировать вверх и вниз 5 раз, чтобы тщательно перемешать. Готовят в день вскрытия.
    3. Приготовление ДНКазы маточного раствора
      1. Взвесить 20 мг ДНКазы. Добавить стерильного H 2 O до общего конечного объема 20 мл. Стерильный фильтр с 0,2 мкм шприцевой фильтр наконечника. Хранить при -20 ° С в 1 мл аликвоты.
    4. Получение стоп-раствора
      1. Разбавляют 5 мл донорской лошадиный лошадиной сыворотки до 10% в 45 мл 1х HBSS. Стерильный фильтр с 0,2 мкм шприцевой фильтр чаевых. Хранить при температуре 4 ° С.
    5. Приготовление 4% бычьим сывороточным альбумином (БСА) маточного раствора
      1. Взвешивают 2 г бычьего сывороточного альбумина и добавить 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) до общего конечного объема 45 мл. Фильтр стерилизовать с 0,2 мкм шприцевой фильтр наконечника. Хранить при температуре 4 ° С.
    6. Подготовка Покрытие среды
      1. В 494 мл среды, добавляют 1,25 мл культуральной среды, содержащий L-аланил-L-глутамин (стабилизированный источник L-глутамин) и 5 ​​мл донорской лошадиной сыворотки. Фильтр стерилизовать с 0,2 мкм шприца филтер наконечник. Хранить при температуре 4 ° С.
    7. Приготовление клеточной культуральной среды
      1. В 196 мл обшивке среды, добавляют 4 мл B27 и 200 мкл аскорбиновой кислоты. Фильтр стерилизовать с фильтром 0,2 мкм. Хранить раствор при температуре 4 ° С и использовать в течение недели.
    8. Приготовление 4% параформальдегида (PFA) раствора
      Внимание: Общие меры предосторожности при использовании параформальдегид следующим образом: Используйте вытяжку, избежать кожу и в глаза, избегать вдыхания паров, держать вдали от источников тепла или открытого пламени. Носить соответствующую защитную одежду. PFA может вызвать аллергию и дерматит, поэтому тщательно мыть руки после обработки.
      1. Добавьте 10 мл 16% PFA в 30 мл 1x PBS, рН 7,4.
    9. Приготовление 0,1% Тритон Х-100
      1. Пипетка 1 мл Тритона Х-100 в 9 мл 1x PBS, чтобы сделать 10% -ный раствор. Пипетка медленно, чтобы вязкий раствор, чтобы заполнить пипетку. Тепло 37 ° C водяной бане до дисрешать. Хранить 10% акций при температуре 4 ° С.
      2. Развести 10% акций до 0,01% (например, путем выполнения 2 последовательных разведений 1:10 Разбавить 1 мл 10% -ного раствора в 9 мл 1х PBS , чтобы сделать 1% раствор; 1 мл 1% -ного раствора в 9 мл 1x PBS , чтобы сделать 0,1% раствор).
    10. Получение 10% и 1% сыворотки осла
      1. Добавить 1 мл сыворотки осла к 9 мл 1x PBS в течение 10% -ного раствора. Добавить 0,5 мл ослиного сыворотки до 49,5 мл 1x PBS, рН 7,4 в течение 1% -ного раствора.
    11. Получение 1x PBS
      1. Разведите 10х PBS до 1 раза путем добавления 50 мл в 450 мл H 2 O. Доводят рН раствора до рН 7,4 с помощью рН - метра.
  2. Покрытие культуральных чашках
    1. Поли-L-орнитин покрытие
      1. Coat только 10 мм снизу стекла диаметром в центре всех мм чашках 35 с 120 мкл поли-L-орнитина с использованием стерильной техники. Инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С. Используйте вакуумный аспиратор для аспирата поли-Lornithine. Ополосните посуду дважды стерильной H 2 O.
    2. Laminin покрытия (наличие концентрации 1 мг / мл)
      1. Развести 20 мкл ламинин 2 мл стерильной H 2 O (конечная концентрация 0,01 мг / мл).
      2. Coat только 10 мм стекла диаметром нижней части в центре всех блюд с 120 мкл ламинин разбавляют до 0,01 мг / мл с использованием стерильной техники, и инкубировать в течение 1 ч или O / N при 37 ° C перед использованием.
  3. Мышь Вскрытие
    Примечание: Методы в этом рассечение предназначены для минимального воздействия на клетки, так как они передаются из эмбриональных мешочков в культуральную инкубаторе. Жизнеспособность клеток сохраняется путем удаления только часть мозга для рассечения среднего мозга. Выделение среднего мозга протекает более быстро, без необходимости вскрывать весь мозг, чтобы получить доступ к региону. Таблицу материалов для мышиного штамма , используемого в данном исследовании.
    1. Эвтаназии приурочен беременной мыши на гестационный день 14 с использованием CO 2.
    2. Спрей живота эвтаназии мышь с 70% этанола. Захватите кожу нижней части живота с помощью щипцов с 2 х 3 зубов и откройте брюшной полости с использованием тупым лезвием хирургические ножницы. Сделать два надреза при боковом движении и в проксимальном направлении на каждой стороне. Сложите в течение брюшной стенки с помощью пинцета, чтобы разоблачить брюшной полости.
      Примечание: Матка в настоящее время подвергается. Разоблачение плевральной полости и создание пневмоторакса также гарантирует, что животное не восстанавливается.
    3. Обрежьте оба конца рога матки, чтобы отделить матку. Поместите в чашку Петри в стерильном капюшоном.
    4. Используя прямой кончик пинцетом в каждой руке открыть зародышевого мешка и удаления эмбриона. Быстро обезглавить зажимая голову на шею с пинцетом. Стабилизировать голову с пинцетом твердо размещены на морде, так что дорсальная поверхность доступна.
    5. С помощью пинцета, проводимых в другой гай, зажать слой кожи и черепа непосредственно перед гребнем мезенцефалона. Отогните кожу и череп каудально вдоль средней линии. Поместите щипцов вокруг хребта с одним наконечником между корой и мезенцефалона, а другой над мозжечком.
    6. Pinch и удалить весь средний мозг, оставляя позади переднего мозга на ростральной стороне и мозжечка на хвостовом стороне. Поместите в чашку Петри с холодным HBSS под рассекает микроскопом.
    7. Повторите эту процедуру для оставшихся эмбрионов.
    8. Под микроскопом рассекает, перевернуть сегмент мозга таким образом, что брюшная сторона теперь доступна. Есть в настоящее время 4 квадранта видны. Удалите все мозговые оболочки и сосудистую систему, аккуратно захватывая мозговых оболочек и потянув вверх от головного мозга.
    9. Используйте пинцет, чтобы стабилизировать сегмент мозга во время отделения среднего мозга. Поместите один трубный ключ щипцов в желудочке примерно в центре сегмента. Сделайте первый пинч дорсально, указывая INto блюдо, затем кнутри на каждой стороне. Возьмем нижние два квадранта, сделав боковые разрезы с обеих сторон.
      Примечание: Ткань представляет интерес в вентральной нижней секции, которая появляется плотная. Эта область содержит как ВТА и ВНС.
    10. Обрежьте и выбросьте ткань, которая имеет меньшую плотность: это включает в себя верхний и нижний бугров четверохолмия. Поместите расчлененный ткань, содержащую как ВТА и SNc в свежем HBSS на отдельной чашки Петри.
      Примечание: На данном этапе развития мозга мыши (E14), область интереса в вентральной мозга отделяют желудочек от гопа incerta и других гипоталамических групп клеток. Чем более удлиненные структура развивающегося эмбрионального мозга мыши позволяет различие между этими областях, которые расположены ближе друг к другу в головном мозге взрослых мышей.
    11. Повторите эти действия для всех остальных сегментов мозга.
    12. После того, как все сегменты мозга были расчленены, используйте пинцет и скальпель № 11 на четверть еач среднего мозга раздел на куски примерно одинакового размера.
  4. Диссоциацию клеток
    1. Ферментативная обработка клеток
      1. Использование широким отверстием P1000 пипетки, чтобы занять все сегменты четвертовали среднего мозга в HBSS и поместить их в 15 мл коническую трубку. Пусть отрезки оседают на дно пробирки и удалить HBSS, который был принят с расквартированных штук.
      2. Добавить 500 мкл раствора папаина в пробирку и помещают в водяную баню 37 ° С в течение 15 мин. Ресуспендируют клетки пальцем стряхивая трубку после 7,5 мин.
      3. Использование широким отверстием P1000 наконечник, пипеток только сегменты среднего мозга в 1 мл аликвоты раствора дизоксирибонуклеаза I (ДНКазы). Разрешить сегменты оседают на дно пробирки.
      4. Использование широким отверстием P1000 наконечник, передавать только сегменты среднего мозга в пробирку 15 мл, содержащего 1 мл раствора холодной остановки для полоскания. Пусть отрезки оседают на дно пробирки и повторить полоскание насе больше.
    2. Механическая Растирание клеточной суспензии
      1. Заменить последнее полоскание с 1 мл свежего раствора стоп и пипетки вверх и вниз 7x с наконечником пипетки P1000 к Triturate клетки. Избегайте чрезмерного растирание, чтобы свести к минимуму лизис клеток.
      2. Подкладочный слой суспензии клеток путем медленного пипеткой 200 мкл 4% раствора БСА в нижней части трубы. Аккуратно извлеките наконечник пипетки, чтобы избежать разрушения клеточной суспензии слой. После центрифугирования при 280 х г в течение 6 мин, аспирата супернатант с P1000 и клетки вновь суспендируют в 1 мл среды металлизации.
  5. Подсчет и покрытие клеток
    1. Выполнить подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Развести клеточной суспензии до 1000 клеток / мкл, с металлизированный среды.
    2. С помощью вакуумного аспиратора, аспирация ламинин из блюд, покрытых, в партиях не более трех блюд. Пластина 120 мкл (1,2 х 10 5 клеток / блюдо (78,5 мм 2 )) Клеточной суспензии на поверхность с покрытием посуды сразу после того, как аспирационные каждую партию. Это предотвращает блюда от высыхания и формирования неровной поверхности.
    3. Через 1 ч осторожно добавляют 3 мл культуральной среды к затравки области культуры блюдо, чтобы свести к минимуму разрушение клеток.
    4. Выполните половину до полной замены среды на чашки для культивирования клеток с интервалами в 3 сут в течение 3-х недель.

2. Заготовка Выращенный-дофаминергические Нейроны для РНК Секвенирование

Примечание: обзор протокола клеточного сбора и одноклеточных РНК-секвенирования приведена на рисунке 1.

  1. Шаги по выполнению Перед день эксперимента
    1. Чистый боросиликатного стекла капиллярных трубок путем обработки ультразвуком в 100% этаноле в течение 15 мин , а затем снова в дистиллированной H 2 O в течение 15 мин. Слить трубку и выпекать в течение ночи в печи при температуре 200 ° С для инактивации РНКазы.
    2. Используйте только что открытРНКазы наконечники пипеток, чтобы приготовить исходный раствор, 10Х буфера реакции путем смешивания 19 мкл 10-кратного буфера для лизиса из набора для секвенирования с 1 мкл раствора ингибитора РНКазы (20 мкл общего объема) в микроцентрифужных трубки. Спин вниз смесь на короткое время с помощью микро-центрифуге и держать на льду.
    3. Добавьте 2 мкл 10х реакционного буфера для каждого из отдельных 0,2 мл ПЦР-пробирки (используемые для сбора заготовленной нейронов). Пометьте пробирки соответствующие теги, идентифицирующие нейроны, которые будут собирать и хранить в замороженном виде при температуре 4 ° С.
  2. Шаги по выполнению на день эксперимента
    1. Изготовление уборочной пипеток.
      1. Потяните микропипетки диаметр большой наконечник (2 - 8 мкм) из запеченной капиллярной трубки с использованием микроэлектрода съемник и стеклянным покрытием нагрева нить накала microforge. Установите съемник, чтобы сформировать микропипетки с длинным конусом. Используйте microforge оборудованный с калиброванной окулярной сеткой и Ob высокой мощностипроективное сломать кончик микропипетки до нужного размера наконечника (10 - 20 мкм).
      2. Закрепить микропипетки в держатель пипетки microforge и установить держатель на microforge. Принесите кончик микропипетки в фокусе над стеклянным покрытием нагрева нити с использованием механического манипулятора microforge и выключателя на ток к нити, чтобы нагреть ее. Нажмите кончиком пипетки к нагретой нити. Выключите ток, когда кончик пипетки растает до соответствующего диаметра.
        ЗАМЕТКА. Отключение тока вызовет нить двигаться внезапно вниз и отсоединить от кончика пипетки, создавая большой, открытый наконечником пипетки с требуемым диаметром.
      3. Храните заполненные микропипетки в закрытой коробке, пока не понадобится.
    2. Сбор нейронах.
      ЗАМЕТКА. Культивируемые нейроны собирали после модифицированной версией ранее опубликованного протокола 6.
      1. Тщательно слЕАН все поверхности клеток-уборочной комнаты, которые вступают в контакт с культурами блюд и сбора труб с использованием жидкого дезинфицирующего и воды с последующим промыванием водой. Протрите вылеченных поверхности с 80% -ным этанолом, а затем РНКаза-ингибитор-проникнуты салфеткой.
      2. Заполните две изолированные контейнеры со льдом, один с регулярным (воды) льда, а другой с сухим льдом. Поместите 0,2 мл пробирки для сбора ПЦР, заполненные ранее с 2 мкл 10-кратного буфера для реакции на регулярном льду.
      3. Удалите культуры блюдо, содержащее нейроны из инкубатора, слейте питательную среду из чашки, промывают 2 мл PBS РНКазы Дульбекко (DPBS) и заменить 1 мл ДЗФР для уборки урожая.
      4. Определить флуоресцентные, TH-позитивных нейронов в первичных культурах среднего мозга с использованием инвертированного, эпифлуоресцентной микроскопа, оборудованного с 40X фазовой объективом, лампы Hg, и набор фильтров GFP.
      5. Поместите пипетку над клеточной сомы с использованием моторизованной или ручной миcromanipulator. Аспирируйте нейрон в стекло микропипетки с использованием деликатного всасывания применяется внутрь через пластиковую трубку, прикрепленной к боковой порту держателя микропипетки. Немедленно удалите микропипетки, содержащий ячейку из раствора для купания.
      6. Поместите наконечник пипетки внутрь 0,2 мл пробирку для сбора ПЦР, содержащей буфер реакции, и сломать кончик прижата к боковой стороне трубы, в нижней части. Expel оставшуюся жидкость (0,5 - 1,5 мкл) из разбитой кончика микропипетки, помещая стерильный 21 G иглу шприца в задней части микропипетки и применяя внешнее давление.
      7. Центрифуга коллекции трубки в течение 5 с помощью настольного микро-центрифуге и заморозить его в сухом льду. Хранить приборке, содержащие единичные клетки при -80 ° С. Как правило, 5-клетки собирают на чашку в течение 1 часового периода при температуре окружающей среды.

3. Одноклеточный Секвенирование РНК Библиотека Генерация

    <литий> Генерация кДНК первой цепи
    Примечание: Для следующих шагов используйте реагенты из набора коммерческих секвенирования.
    1. Доведите ниже реагенты на льду к шкафу ПЦР. Подготовьте первый мастер-нить микс плюс 10% путем комбинирования следующих реагентов при комнатной температуре в ПЦР кабинета: 2 мкл 5x первой цепи буфера, 0,25 мкл DTT (100 мМ), 1 мкл дНТФ смеси (10 мМ), 1 мкл олигонуклеотида ( 12 мкМ), 0,25 мкл РНКазы ингибатора, и 1 мкл обратной транскриптазы (100 единиц). Это обратная мастер транскриптазы смесь (5,5 мкл общего объема в реакции).
    2. Возьмите образцы от -80 С на сухом льду и довести до кабинета ПЦР. Добавьте следующий код в одном образце клеток: 1 мкл 3 'праймер 1 и 1 мкл РНК количественно спайки. Доведите образцы на охладителем блока к амплификатора предустановки горячей крышкой при температуре 72 ° С.
    3. Инкубировать пробирки в амплификатор в течение 3 мин при 72 ° С, а затем положить образцы на ПЦР-охладитель стойку.Добавить 5,5 мкл основной смеси (со стадии 3.1.1) к каждой реакционной трубе и перемешать с помощью пипетки осторожно. Спин 0,2 мкл пробирки в течение 5 с и инкубировать в амплификатор следующим образом: 42 ° С в течение 90 мин, 70 ° С в течение 10 мин. Выдержка при температуре 4 ° С.
  1. Очистка амплифицированной первой цепи кДНК.
    Примечание: ПЦР-амплифицированный кДНК очищают с помощью иммобилизации на магнитных шариков. Используйте магнитное устройство для разделения на 0,2 мл пробирки.
    1. Алиготе магнитных шариков Into 1,5 мл пробирки. Перед каждым использованием довести шарик аликвот до комнатной температуры в течение не менее 30 мин и хорошо перемешать, чтобы разойтись. Вихревые магнитные шарики пока равномерно не смешано.
    2. Добавьте 25 мкл магнитных шариков для каждого образца. Смешайте с помощью пипетки весь объем вверх и вниз, по крайней мере, в 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 8 мин, чтобы позволить кДНК связываются с бусинами.
  2. Приготовление Master Mix ПЦР
    1. Подготовьте основной смеси DS-ПЦР-амплификации кДНК для всех реакций с AdditРациональная 10% путем смешивания 5 мкл 10х ПЦР-буфера, 2 мкл дНТФ смеси (10 мМ), 2 мкл ПЦР-праймер 2 (12 мкМ), 2 мкл 50х 2 полимеразной смеси, и 39 мкл нуклеазы свободного-воды (50 мкл Общий объем / реакция).
  3. Амплификация First Strand
    1. Поместите образцы и магнитные шарики на магнитной сепарации устройства ≥5 мин, пока жидкость не появится совершенно ясно, и не осталось в супернатанте бусин.
    2. Хранение образцов на разделительном устройстве, пипеткой супернатант и отбрасывать. Спин образцы в течение 5 с для сбора жидкости со стороны трубы. Поместите образцы на устройстве магнитной сепарации в течение 30 секунд, а затем удалить все оставшиеся супернатант с P10 дозаторов.
    3. Добавьте 50 мкл мастер-смеси ПЦР в каждую пробирку, содержащую ДНК, связанной с гранулами из предыдущего шага. Поместите пробирку в разогретую до термоциклеру (95 ° C) с нагретой крышкой. Начинают Амплифицируйте с помощью следующей Prograм: 95 ° С в течение 1 мин, 26 циклов при 95 ° С в течение 15 с, 65 ° С в течение 30 с, 68 ° С в течение 6 мин. Затем при 72 ° С 10 мин. Выдержка при температуре 4 ° С.
      Примечание: Обратитесь к руководству пользователя секвенирования для получения более подробной информации и для оптимизации настроек выборки.
  4. Очистка Усиленный двухцепочечной кДНК
    1. Добавьте 90 мкл бус для каждого образца. Смешайте с помощью пипетки весь объем вверх и вниз, по крайней мере, в 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 8 мин, чтобы позволить кДНК связываются с бусинами. Поместите образцы плюс шарики на устройстве магнитной сепарации для ≥5 мин, пока жидкость не появится совершенно ясно, и не осталось в супернатанте бусин.
    2. В то время как образцы на устройстве магнитной сепарации, удалить супернатант и выбросить. Сохранить образцы на устройстве магнитной сепарации. Добавьте 140 мкл свежеприготовленного 85% этанола к каждому образцу, не нарушая бусинки. Подождите в течение 30 секунд. Пипетировать надосадочную. кДНК будет оставаться связанным с BEADS во время процесса стирки.
    3. Повторите мыть этанол еще раз.
    4. Кратко спина образцы для сбора жидкости со стороны трубы. Поместите образцы на устройстве магнитной сепарации в течение 30 с, а затем удалить все оставшиеся этанола с пипеткой. Поместите образцы при комнатной температуре в течение 2 - 2,5 мин , пока осадок не высохнет и больше не блестящие (т.е. до появления трещины).
      Примечание: Сухие гранулы только до тех пор, пока только сухой. Осадок будет выглядеть матовой, без блеска. Если осадок не сухой, этанол будет оставаться в образце скважин, что позволит снизить усиленную скорость восстановления кДНК, так и выход. Если Таблетку пересушивайте, будет трещины в осадке. Это займет больше времени, чем 2 мин регидрировать и может уменьшить усиленный восстановление кДНК и выход.
    5. Как только гранулы сухой, добавьте 22,5 мкл буфера для элюции для покрытия из гранул. Удалите образцы из устройства магнитной сепарации и тщательно перемешать до ресуспендирования бисером. Вcubate при комнатной температуре в течение 10 мин для регидратации.
    6. Спин образцы в течение 5 с для сбора жидкости со стороны трубы. Поместите образцы обратно на устройство магнитной сепарации для ≥1 мин, пока раствор не станет совершенно ясно.
      Примечание: небольшая популяция шариков не может осадить против магнита во время инкубации. Пипетировать эти unpelleted бусинки вверх и вниз, чтобы снова суспендировать их с надосадочной жидкостью, а затем пипеткой их к магниту, где остальная часть бортов уже гранулированным (не нарушая существующий осадок).
    7. Продолжайте инкубацию, пока не бусинки остаются в супернатанте. Передача прозрачного супернатанта, содержащего очищенный кДНК из каждой пробирки с нуклеазы, с низким сцеплением трубки. Добавьте каждую пробирку с образцом информации и хранить при температуре -20 ° C. Образцы можно хранить при -20 ° C до бесконечности.
  5. Измерение концентрации ДНК и размер фрагмента
    1. Провести проверку контроля качества путем количественного 1 мкл Альiquot кДНК на флуорометре. Оценка 1 мкл (3 нг) DS-кДНК с использованием системы электрофореза (как описано в разделе 1).
  6. Фрагментация ДНК
    Примечание: Используйте набор для подготовки образца ДНК.
    1. Добавьте 20 мкл кДНК (35 нг всего) к трубке. Добавить 25 мкл Tagment ДНК (ТД) буфера в пробирку, содержащую кДНК.
    2. Добавьте 5 мкл TDE1 (Tagment ДНК фермента) к трубе. Пипетировать вверх и вниз 10 раз перемешать. Используйте свежий наконечник для каждого образца. Центрифуга при 280 мкг при 20 ° С в течение 1 мин.
    3. Поместите образцы в амплификатор с нагретой крышкой и оставьте его работать при: 55 ° С, 5,5 мин. Быстро добавить 50 мкл раствора QG (набор для экстракции геля). Пипетировать вверх и вниз 10 раз перемешать. Продолжить непосредственно к следующему шагу.
  7. Очистка фрагментированной ДНК
    1. Добавьте 170 мкл шариков, пипетки вверх и вниз 10 раз перемешать. Позвольте ему сидеть в течение 10 мин. Положите трубки на магнит. Пусть трубки сидят на магнит в течение 10 мин.В то время как образцы на устройстве магнитной сепарации, пипеткой супернатант и отбрасывать.
    2. Оставьте трубку на магнит и добавить 200 мкл 85% этанола. Пусть сидят в течение 30 секунд, а затем удалить этанол. Повторите мыть этанол. Крутить XG трубка 1000 при комнатной температуре.
    3. Положите трубку обратно на магнит. Пипетировать от любого остаточного этанола. Пусть образцы высохнуть при комнатной температуре в течение 15 мин.
    4. Добавьте 21 мкл буфера для элюции из набора для экстракции геля. Пусть трубка сидеть от магнита, пипеткой вверх и вниз 10 раз перемешать. Пусть трубка сидеть при комнатной температуре в течение 15 мин.
    5. Возвращение трубки к магниту в течение 5 мин. Пипетка 20 мкл раствора (очищенную ДНК) в новую пробирку.
  8. Пометка и ПЦР-амплификации фрагментированной ДНК
    Примечание: На этом этапе очищенный ДНК амплифицируют с помощью ограниченного цикла программы ПЦР. Шаг ПЦР также добавляет индекс 1 (i7) и индекс 2 (i5), а также общие адаптеры (P5 и P7) (требуется для генерации и последовательности кластеров). Обратитесь к ДНК sдостаточное руководство по подготовке для получения более подробной информации.
    1. В новую пробирку добавляют 5 мкл индекса 2 праймеров (белый колпачок). Используя новый наконечник пипетки добавляют 5 мкл индекса 1 праймера (оранжевая крышка). Добавьте 15 мкл ПЦР-смеси мастер-микс в каждую пробирку.
    2. Добавьте 5 мкл коктейля праймеров ПЦР в каждую пробирку. Добавьте 20 мкл очищенной ДНК в пробирку. Аккуратно пипеткой вверх и вниз 3 - 5 раз.
    3. Выполните ПЦР с использованием следующей программы на амплификатора: 72 ° С в течение 3 мин, 98 ° C в течение 30 с, 5 циклов 98 ° С в течение 10 с, 63 ° С в течение 30 сек, 72 ° С в течение 3 мин. Удержание при 10 ° С. Незамедлительно к ПЦР-очистки или хранения образца при температуре 4 ° С в течение до 2 дней.
  9. Очистка амплифицированной ДНК-фрагментов
    1. Доведите шарики до комнатной температуры. Подготовьте свежий 85% этанола. Отбирают образцы из ПЦР машины и спином вниз на короткое время.
    2. Добавьте 30 мкл бус к трубе. Аккуратно пипетку смешать вверх и вниз 10 раз. Пусть трубка сидеть при комнатной температуре в течение 5 мин. Место BACK на магнит в течение 5 мин. С трубкой на магните использовать пипетку, чтобы отбросить супернатант.
    3. Добавить 200 мкл 85% этанола в каждую пробирку. Пипетка этанола после 30 сек. Повторите 85% этанола стирки. Пипетка этанола после 30 сек.
    4. С помощью трубки все еще на магните и крышки открыты, позволяют бусинки высохнуть на воздухе в течение 15 мин. Удалить труб из магнита.
    5. Добавить 32,5 мкл буфера для элюции. Аккуратно пипеткой вверх и вниз 10 раз. Выдержите от магнита на 10 - 15 мин.
    6. Возвращение трубки к магниту в течение 2 мин, или пока супернатант не испарится. Аккуратно перенести 30 мкл супернатанта в новую пробирку.
  10. Измерение концентрации ДНК и фрагмент Размер
    1. Провести проверку контроля качества путем количественного определения концентрации ДНК 1 мкл кДНК на флуорометре. Определить размер фрагмента ДНК с помощью электрофореза. Оценка 1 мкл (3 нг) DS-кДНК.
  11. Последовательность действий
    1. Принесите РНК-Seq библиотеки единственной клетки к секвенирования объекта. Сформировать 100 п.н. секвенирование читает на секвенсор ниже ранее опубликованного протокола 4.
      Примечание: Каждая библиотека секвенирование генерирует> 20 миллионов однозначно отображение читает.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы сообщаем протокол для культивирования вентральных нейронов среднего мозга от мыши , выражающей EGFP , приводимый промоторной последовательностью тирозин гидроксилазы, собирая отдельные флуоресцентные нейроны из культур, и измерения их РНК - транскриптом с использованием Секвенирование РНК (рисунок 1). Данные показали, что 100% -ом-EGFP-позитивных клеток, которые были собраны и секвенированию дофаминергические нейроны, основанные на присутствии следующих трех DA-...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы выделяем отдельные клетки из гетерогенной популяции с использованием флуоресцентной метки, а затем изучить каждую клетку с одноклеточного Секвенирование РНК. Мы сообщаем, что 100% живых клеток TH-EGFP, что мы заготовленной и секвенированию, в самом деле дофаминергические нейроны, основанные на присутствии следующих трех DA-связанных генных транскриптов, TH, DDC и SLC6A3. Все положительные клетки TH-EGFP выразил эти три гена, как оценивали с помощью РНК-Seq. Это была созвучна с электрофизиологических исследовани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Национальных институтов здравоохранения США (DA017279, AG033954, DA037743), Фонда Майкла Джей Фокса и Инициативы инноваций Калифорнийского технологического института, финансирующей Лабораторию генетики и геномики Милларда и Мюриэль Джейкобс в Калифорнийском технологическом институте. Мы благодарим Брайана Уильямса за оптимизацию протокола библиотеки RNA-Seq и за оказанную помощь. Мы благодарим Генри Амрайна за компьютерное обучение. Мы благодарим Барбару Дж. Уолд за использование ее оборудования и лабораторного пространства. Мы благодарим Игоря Антошечкина за библиотечную последовательность и за управление объектами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПапаинУортингтон Биохимическая корпорация 
Сбалансированный по Хэнксу солевой раствор (HBSS), 1xGibco 14175-095
Донорская сыворотка для лошадейThermo Scientific SH30074.03
Бычья сыворотка альбумин (BSA)Sigma A7030-50G
Среда: Нейробазальная средаGibco 21103-049
Питательные среды, содержащие стабилизированную форму L-глютамина, L-аланил-L-глутамина: GlutaMAXGibco 35050-061Конечная концентрация 0,5 мМ.
L-аскорбиновая кислотаSigma A7506
B27Gibco 17504-04450x стоковый раствор, 1x конечная концентрация.
Посуда со стеклянным дном 35 ммMatTek   P35GC-1,5-10-C
Поли-L-орнитинсигма P4957
ЛамининСигма L2020Хранение при -20 °°; C в 20 & микро; L aliquots
Deoxyribonucrelative I (DNase)Sigma DN25
Синие наконечники для пипеток P1000Sorenson Bioscience Inc. 10130
10 мм неглубокая чашкаПетри VWR 25384-324
37 ° C Водяная баня
37 °°; C, инкубатор с влажностью
16% параформальдегид (PFA)Электронная микроскопия Sciences 15710
Тритон Х-100Сигма  X100-500ML
Сыворотка ослаEquitech SD-0100HI100% стоковый раствор, 1% конечная концентрация.
Хирургические ножницы стандартного образцаFine Science Tools14000-14
Щипцы - 2x3 зубаFine Science Tools11022-14
Щипцы - Dumont #55Fine Science Tools11295-51
Щипцы - Dumont #5Fine Science Tools11252-23
10x PBS, pH 7,4Gibco 70011-044
Фосфатно-буферный раствор Дульбекко (DPBS) 1xGibco14190-144500 мл
21 G иглаBD PrecisionGlide Игла305167100 игл
Микропипетка для вытягиванияSutter Instrumentмодель P-87
Микроманипулятор Саттер Инструмент  Набор для секвенирования MP-285
: набор SMARTer со сверхнизким уровнем РНК для секвенирования IlluminaClontech634936100 rnxs, включая набор
олигонуклеотидов Advantage2PCR (12 и микро; M): олигонуклеотид SMARTer IIA (12 & микро; m)Из комплекта SMARTer 
Обратная транскриптаза (100 единиц)Обратная транскриптазаSMARTcribe из набора SMARTer 
Грунтовка 13' CDSIIa Праймер Из набора SMARTer
Kit Праймер 2IS ПЦР праймерИз набора SMARTer
50x 2 полимеразная смесь50x Advantage 2 полимеразная смесьИз набора SMARTer
10x PCR буфер10x Advantage 2 PCR буфериз набора SMARTer
RNA SpikesThermoFisher4456740
штатив для охладителя PCRIsoFreeze PCR
Набор для подготовки образцов ДНК (Illumina/Nextera) NexterFC-121-103024 образца
ПЦР мастер миксNextera ПЦР мастер микс (NPM)Из набора Nextera 
Коктейль из праймеров для ПЦР (PPC) Коктейль из праймеров Nextera PCR (PPC) Из набора Nextera
ФлуориметрQubit ThermoFisherQ33216
HS Набор биоанализатора ДНКAgilent5067-4626110 rxns
Система электрофореза Биоанализатор Agilent 2100.G2938C
Магнитные бусины: Agencourt AMPure Beckman CoulterA638805 мл
РНКаза салфетки: РНКаза Zap салфеткиAmbionAM9786Размер 100 листов
Qubit ds HS Набор для анализаМолекулярные зонды Q32854500 анализов
Набор для экстракции геля: Qiaquick Набор для экстракции геляQiagen 28704
Трубка стеклянная капиллярная (Kimax-51, наружный диаметр 1,5 - 1,8 мм)
МикрокузницаNarishige (или аналог) 
СеквенсорIllumina HiSeq instrument GENSAT
тирозингидроксилаза-eGFP мышиный штамм Номер акции MMRRC: 000292-UNCStock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Региональный исследовательский центр мутантных мышей
LS0031265%

Ссылки

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сбор одиночных клетоккультуры вентрального мезенцефалонаизоляция клетокфлуоресцентная микроскопиясинтез кДНКанализ экспрессии генов
Надежная идентификация живых дофаминергических нейронов в мозге культур с использованием РНК-секвенирования и TH-промотор-приводом EGFP Expression
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.